(完整word)(完整word版)pull down 实验方法

Pull Down实验流程

1. 混合两种预测相互作用的蛋白.(Protein—A-GST ＆ Protein-B—HIS，下面实验用GST 树脂IP，用Western Blot检测HIS；反之亦然。如果是纯化后的蛋白，需要进行偷袭或者使用超滤离心管为蛋白更换溶液,之后才能继续Pull Down.） 2。 加入1 mL Binding Buffer。

Binding Buffer:50 mM Tris.HCl （pH7。50。） 100 mM NaCl

0。25% Triton—X 100 35 mM β-Me（巯基乙醇）

3。 将混合蛋白在4℃条件下旋转结合2—4 h。

TM

4. 加入20—30 μL GST—Bind Resin结合2-4 h。 5. 4 ℃,150—200 g 离心2 min，吸弃上清（小心！不要吸弃底部沉淀）。第一次弃去的上清样品记为Washing- Protein-A/ Protein-B，用于SDS-PAGE电泳时的对照。

6。 加入1 mL Binding Buffer，4 ℃条件下旋转混匀5—10 min，4 ℃，150-200 g 离心2 min，吸弃上清. 7. 重复步骤6，用1 mL Binding Buffer 清洗5-6次。

8. 最后一次清洗后留有20-30 μL 液体，加入适量的 Loading Buffer，95℃金属浴5—10 min，150—200 g 离心5 min，样品记为上样跑SDS-PAGE电泳。 电泳样品顺序：

Marker，Protein—A—GST，Protein-B—HIS，Washing- Protein-A/ Protein-B，Pull Down- Protein-A/ Protein-B

此次电泳的目的,一是初步检测两个蛋白是否互作，二是可以为后面正式实验所需蛋白量提供参考。

用于正式检测两个蛋白是否互作电泳顺序如下： （input，蛋白量为后两者的1/10）

Marker，Protein—B-HIS ， GST+ Protein—B-HIS， Protein-A-GST+ Protein—B—HIS Marker，Protein—A—GST , HIS+ Protein—A—GST， Protein-B—HIS+ Protein—B—GST

9。 转PVDF膜，350 mA 恒流,2 h 左右.(PVDF膜用之前，用甲醇泡2 min） 10. 做Western Blot 过程：

预杂交1 h 以上;杂交一抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min ；杂交二抗1 h 以上；洗膜三次，每次10 min.

11。 显影：

用1 mL 发光液A + 1 mL发光液B浸润PVDF膜，然后固定，显影液显影1 min（时间可以适当调整）,水洗，定影1 min。

12。 扫描杂交胶片结果。