酵母菌原生质体融合育种
第一部分：酵母菌原生质体融合育种
一、 基本原理
进行微生物原生质体融合时，首先必须消除细胞壁，它是微生物细胞之间进行遗传物质交换的主要障碍。在酵母属进行细胞融合时，通常采用蜗牛酶除去细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。细胞膜融合之后还必须经过细胞质融合、细胞核重组、细胞壁再生等一系列过程，才能形成具有生活能力的新菌株。融合后的细胞有两种可能：一是形成异核体，即染色体DNA 不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。另一是形成重组融合子，通过连续传代、分离、纯化，可以区别这两类融合。应该指出，即使真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。因此，必须经过多次分离，纯化才能获得稳定的融合子
二、 实验材料
（一）菌种：酵母菌
（二）培养基：
1、完全培养基（液体CM）
2、完全培养基（固体CM）在液体培养基加入2%琼脂
3、基本培养基（MM）葡萄糖柠檬酸钠培养基或YNB培养基
4、再生完全培养基 固体完全培养基中加入0.5mol/L的蔗糖
(三) 缓冲液
(1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2) 高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生质体稳定液(SMM)
0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五) 促融剂
40％聚乙二醇 (PEG)的SMM 溶液。
(六) 器皿
培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、离心管、玻璃棒、显微镜、离心机等。
四、试验内容
(一) 原生质体的制备
1．活化菌体
将单倍体酿酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分别转接新鲜斜面。自新鲜斜面分别挑取一环接入装有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30℃培养16 h 至对数期。
2．离心洗涤、收集细胞
分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养液，3000 r/min 离心 10 min，弃上清液，向沉淀的菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体，振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离心洗涤一次。将二株菌体分别悬浮于5 mL 高渗缓冲液中，振荡均匀，分别取样0.5 mL，用生理盐水稀释至10-6，分别各取0.1 mL 10-4、10-5、10-6 稀释液。于相应编号的完全培养基平板上(每个稀释度做两个平板)，用刮棒涂布，30℃培养48 h 后进行二亲株的总菌数测定。
3. 酶解脱壁
各取3 mL 菌液于无菌小试管中，3000 r/min 离心10 min，弃上清液，加入3 mL 含2.0 mg 蜗牛酶的高渗缓冲液(此高渗缓冲液含有0.1％EDTA 和0.3％SH-OH）于30℃振荡保温，定时取样镜检观察至细胞变成球状原生质体为止，此时原生质体形成。
(二) 原生质体再生及剩余菌数的测定
1．再生
分别吸取0.5 mL 原生质体(经酶处理)加入装有4.5 mL 高渗缓冲液及4.5 mL 无菌水试管中。经高渗缓冲液稀释至10-5；分别吸取0.1 mL 10-3、10-4、10-5。稀释液于相应编号的再生培养基平板上，30℃培养48 h 后，进行再生菌数测定(用双层再生培养基)。
2. 未脱壁菌数测定
分别取0.5 mL 原生质体至装有无菌水试管中，稀释到10-4；各取0.1 mL 10-2、10-3、10-4 的稀释液于相应编号的完全培养基平板上，30℃培养48 h 后，进行未脱壁菌数测定。
(三) 原生质体融合
1. 除酶
取两亲本原生质体各1 mL，混合于灭菌小试管中，2500 r/min 离心 10min，弃上清液，用高渗缓冲液离心洗涤二次，除酶。
2. 促融
向上述沉淀菌体中加入0.2 mL SMM 溶液，混合后再加入1.8 mL 40％PEG，轻轻摇匀，32℃水浴保温2 min 立即用SMM 溶液适当稀释(一般为100、10-1、10-2)。
3．再生
取融合后的稀释液各0.1 mL，放于冷却至45℃左右的6 mL 固体再生基本培养基试管中，迅速混匀，倒入带有底层再生培养基的平板上，每个稀释度做两次重复，30℃培养96 h，检出融合子。
4．融合子的检验
用牙签桃取原生质体融合后长出的大菌落点种在基本培养基平板上，生长者为原养型即
重组子。传代稳定后转接于固体完全培养基斜面上，而亲本类型在基本培养基上是不生长的。
补充：原生质体融合育种
一、方法：用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍—细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞， 然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优良性状于一体的稳定融合子。
聚乙二醇诱导和电融和
聚乙二醇种内融合率可高达27%，种间的融合率也可达10%，比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱导融合又将融合率提高10倍。
二、原生质体融合育种的特点
1、杂交率高
2、受接合型或致育型的限制小
3、遗传物质传递更为完整
4、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能
5、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株
6、提高菌株产量的潜力较大
7、有助于建立工业微生物转化体系
三、原生质体融合育种五大步骤：
Ⅰ、直接亲本及其遗传标记选择；
一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为直接亲本
直接亲本都带有遗传标记
Ⅱ、双亲本原生质体制备与再生
（一）原生质体制备
最有效和最常用的是酶法。
（处理细菌细胞壁用酶 溶菌酶Lysozyme
处理放线菌细胞壁用酶 Lytic Enzyme裂解酶、Lysozyme溶菌酶
处理真菌用酶 纤维素酶 Cellulase
酵母裂解酶 Zymolyase β1,3葡聚糖酶
几丁质酶 Chitinase
商品酶 Novozyme234来自 Trichoderma harzianum Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶
Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶 ）
原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处理等因素有关。
1、 酶法分离原生质体的影响因素
（1）培养基组成
（2）菌体培养方式：丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌和酵母菌多用振荡沉没培养法。
（3）菌体菌龄：丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前期和对数期效果最好。
酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化，才能大幅度地提高制备率；放线菌制备原生质体，以对数期到静止期的转换期比较理想，不仅制备量多，而且细胞壁再生能力也比较强；细菌适合在对数期分离原生质体
（4）稳定剂：高渗溶液；无机盐对丝状真菌效果较好，而糖和糖醇对酵母更为合适，细菌多使用蔗糖或NaCl，
（5）酶解前的预处理：SH-化合物（如巯基乙醇）广泛应用于酵母自和某些丝状真菌中 ，
（6）酶系和酶的浓度：真菌-0.5％蜗牛酶和0.5%纤维素酶 ，
（7）酶的作用温度和作用pH值：通常细菌水解细胞壁的温度在 35℃左右。一般放线菌的温度在 30～32℃。
（8）菌体密度：
（9）酶解方式：酶解时保持较好的通气条件和适当振荡可促进原生质体释放和分离。
2．原生质体的鉴别
（1）低渗爆破法：
（2）荧光染色法：
3．原生质体的收集和纯化
（1）过滤法：使用沙心漏斗。
（2）密度梯度离心法：
（3）界面法：
（4）漂浮法：
4．原虫质体的活力鉴定
（1）荧光素双醋酸盐（FDA）染色法
（2）酚藏花红染色法
（3）伊文恩篮染色法
5．原生质体的保存
（1）立即进行融合或其它方式育种
（2） 5％的二甲亚矾或甘油等其他保护剂 ，液氮。
（二）原生质体再生
l、原生质体再生的影响因素
①菌体生理状态
②稳定剂：
③酶浓度和酶作用时间
④再生培养基：丝状真菌、酿酒酵母等的原生质体仅能在固体培养基上再生，在液体培养基中细胞壁再生不彻底，不能完全复原。再生培养基要用稳定剂配制，还含有Ca2＋和Mg2+,浓度和原生质体形成时的酶解液相类似，菌种不同稍有差别。
⑤残存菌体的分离，
⑥原生质体密度 ⑦排除再生培养基上的冷凝水， ⑧再生方法，
2．再生率及其计算
细菌原生质体再生频率在90％以上，
放线菌的50～60％，
真菌为20－70％。
Ⅲ、亲本原生质体诱导融合；
（一）原生质体融合过程所需材料:原生质体 、PEG及适量的CaCl2、MgCl2
（二）原生质体融合的影响因素
1．融合剂：不同种类微生物对PEG分于量的要求不尽相同。
物理融合剂：电场和激光是原生质体融合
2．温度：丝状真菌适宜融合的温度约为30℃；而细菌原生质体融合的适温往往偏低，据认为4℃或20℃比37℃更好；放线菌通常在常温（约20℃）下进行融合。总的来说在20-30℃下进行融合效果较理想。融合处理时间从1min-1h，但大多数微生物1～10 min，
3、亲株的亲和力和原生质体的活性
4．无机离子： 在PEG介导融合时，通常需要一定桩度的Ca2+、Mg2+有效地促进融合
5．其他条件 ：细胞密度
Ⅳ、融合重组体（称为融合子）分离；
（一）融合体再生
双亲融合后形成的融合体不等于重组体，以霉菌来说，可能是异核体或杂合二倍体或重组体，它们融合后营养互补，经过再生，均可在基本培养基上形成菌落。
酵母菌、细菌常用双层平板法，与融合前原生质霉菌和放线菌除了用双层平板法外，也可把原生质体直接分离到高渗培养基平板上，同样能得到再生菌落。
（二）融合体的检出与分离
1．利用营养缺陷型标记选择融合体
2．利用抗性选择融合体
3．用灭活原生质体检出融合体
4．利用荧光染色法选择融合体
5．双亲对碳源利用不同而检出融合体
6．融合体的其他选择方法
①对昆虫的毒力测定进行融合体的选择
②利用形态差异选择
③生化测定指标选择融合体
Ⅴ、遗传特性分析与测定；
分离重组体，并试验其遗传稳定性研究
（一）重组体的检出和鉴别的方法
1．直接法
2．间接选择法
3．钝化选择法
（二）融合率
如采用直接法，融合率的计算公式为：
融合率（％）=基本培养基上再生的菌落/完全培养基上再生的菌落数×100%
如采用间接法．融合率的记算公式为：
融合率（%）＝重组体后代总数/所有后代总数×100％
各类微生物之间融合频率差别很大．既使是同一个种的不同菌株也不一样。霉菌、放线菌融合率约为0.1%一10%，细菌和酵母菌为10-3一10-6。异种间融合率比同种间又低得多，如霉菌种间融合率约为0.1％一1%，酵母菌、放线菌为10-5一10-7。
（三）DNA含量及孢子形态测定
1．DNA含量测定
2．单倍化
3．有关酶活性及孢子体积的测定
4．分子生物学方法
四、原生质体融合的应用
1．提高产量或质量，合成新物质，新中间体
2．改良菌种遗传特性
3．优化菌种发酵特性
4．质粒转移
5．原生质体与细胞核融合
6．进行遗传分析
附录 酵母原生质体融合试验用培养基
(包括酵母单倍体原生质体融合及电场诱导酵母原生质体融合）
1. 完全培养基
葡萄糖 2 g
蛋白胨 2 g
酵母膏 1 g
蒸馏水 100 mL
pH 7.2
100 Pa 灭菌20 min。
如需配成固体完全培养基时，则需在上述液体培养基中加入2％琼脂。
2. 基本培养基(用于单倍体酵母原生质体融合试验)
(1) 葡萄糖柠檬酸钠培养基
葡萄糖 0.5 g
(NH4)2SO4 0.2 g
柠檬酸钠 0.1 g
MgSO4·7H2O 0.02 g
K2HPO4 0.4 g
KH2PO4 0.6 g
纯化琼脂 2 g
蒸馏水 100 mL
pH 6.0
100Pa 灭菌20 min。
(2) YNB 培养基
葡萄糖 2 g
酵母氨基(YNB)* 0.67 mL
琼脂(经纯化处理) 2.0 g
蒸馏水 100 mL
pH 6.0
100 Pa 灭菌20 min。
3. 再生完全培养基
在固体完全培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖(或0.8 mol/L 甘露醇或1 mol/L 山梨醇）。
4. 基本培养基(用于电场诱导酵母原生质体融合试验)
葡萄糖 2 g
酵母氨基(YNB)* 0.67 mL
琼脂(经纯化处理) 2.0 g
蒸馏水 100 mL
pH 6.0
100 Pa 灭菌20 min。
*YNB 培养基由以下A、B、C 三种溶液混合而成，取A 1 mL，B 1 mL，C 10 mL，无离子水 1000mL， pH6.5。
A 液 维生素混合液VB1 1000 mg，箊酸400 mg，吡哆醇 400 mg，生物素 20 mg，泛酸钙2 000 mg，VB2 200 mg，肌醇10 000 mg，对氨基苯甲酸 200 mg，无离子水l 000 mL，
B 液 微量元素混合液 H3BO4 500 mg，MnSO4·7H2O 200 mg，ZnSO4·7H2O 400 mg，CuSO4·5H2O 40
mg，FeCl3·6H20 100 mg，Na2MnO4 200 mg，无离子水1000 mL，
C 液 其他无机盐KI 0.1 mg，CaCl2·2H2O 0.1 g，K2HPO4 0.15 g，KH2PO4 0.85 g，MgSO4·7H2O 0.5
g，NaCl 0.1 g，无离子水1000 mL。
5．再生基本培养基
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