细菌的生理生化鉴定

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细菌的生理生化鉴定

篇一：细菌生理生化鉴定

实验九细菌的生理生化试验[日期：20XX-5-30]来源：作者：孔庆学[字体：大中 小]

实验九细菌的生理生化试验 1目的

1.1了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理 1.2掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法 2原理

各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种

差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以

其发酵的类型和产物也不相同，也就是说

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，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物 学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。 3材料 3.1菌种

大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、产气肠杆菌（enterobacteraerogenes）、普通变形杆菌（proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）的斜面菌种 3.2培养基

葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖） 3.3试剂

40％naoh溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。 3.4器具

超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。 4流程

糖发酵试验→V-p试验→甲基红试验→吲哚试验 5步骤

(一)糖类发酵试验

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1目的

了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法． 2原理

可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可

在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即b.c.p指示剂，其ph在5.2以下呈黄色，ph在

6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放 入倒置杜氏小管观察。 3材料 3.2菌种

大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、产气肠杆菌（enterobacteraerogenes）、普通变形杆菌（proteus vulgaris）的斜面菌种 3.３培养基

葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管 ４流程

发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录 5步骤

5.1试管标记图9-1糖发酵产气

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取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气

4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。 5.2接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接

菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中（图9-1），置37℃恒温箱中培养，分别在培养 24h、48h、和72h观察结果。 5.3观察记录

与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，

记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用

“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录

用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。

（二）乙酰甲基甲醇试验(V．p试验) 1目的

了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原

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理，并掌握其操作方法． 2原理

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲

基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红 色化合物，称V－p（+）反应。 3材料 3.1菌种

大肠埃希氏菌（escherichiacoli）、产气肠杆菌（enterobacteraerogenes）、普通变形杆菌（proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）的斜面菌种 3.2培养基

葡萄糖蛋白胨培养液的试管 ４流程

培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录 5步骤 5.1标记试管

取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 5.2接种培养

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以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h。 5.3观察记录

取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40％naoh溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.p.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.p.试验阴性反应（用“－”表示）。注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。

（三）甲基红试验（m.R.试验） 1目的

了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法． 2原理

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基ph值下降至ph4.5以下，使甲基红指示剂变红。 3材料 3.1菌种

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同V．p试验 3.2培养基 同V．p试验 4流程

培养液→指示剂→观察→记录结果

于V.p.试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。 （四）吲哚试验 1目的

掌握吲哚试验(ehrlich法)的原理和方法 2原理

有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。 3材料 3.1菌种 测试菌株． 3.2培养基 蛋白胨水培养基

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3.3试剂

二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。 4流程

标记试管→接种→培养→观察→记录 5步骤 5.1试管标记

取装有蛋白胨水培养液的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 5.2接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h。 5.3观察记录

在培养液中加入乙醚1～2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。 记录生理生化反应测定结果． 7思考

1以上生理生化反应能用于鉴别细菌，其原理是什么？2细菌生理生化反应试验中为什么要设对照．3试设计一试验

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方案，鉴别一株肠道细菌．

篇二：实验五细菌鉴定中常见的生理生化反应 实验五细菌鉴定中常见的生理生化反应 一、实验目的。

1)了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。2)了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。

3)了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 二、实验原理。

各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。 1.糖（醇）类发酵试验

不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示剂溴甲酚紫，ph5.2黄色—ph6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。 2.甲基红试验（m.R试验）

甲基红试验，ph4.4红色～ph6.2黄色，是用来检测由

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葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的ph降低到4.2以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使ph升至大约6。

3.Voges-proskauer试验（伏-普试验，V.p.试验） 伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.p.反应阳性。 4.靛基质试验

某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质。 5.硫化氢试验

某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。

6.明胶液化实验

明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会液化。有些微生物可产生一种成

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为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4度仍能保持液化状态。 7.柠檬酸盐利用试验

有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂ph6.0(黄)～7.6(蓝)，由绿色变为深蓝色。 8.淀粉水解实验

细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。

三、实验仪器、材料和用具

实验仪器：32度恒温培养箱、4度冰箱；

微生物材料：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌、待鉴定的未知菌的平板单菌落；

试剂：甲基红试剂、V.p.试剂、吲哚试剂，Koh溶液；实验用具：

试管：每个试验3根试验管，1根对照管，8个试验，共32管；杜氏小管、接种环、接种针、酒精灯、火柴、试管架、记号笔。 四、实验步骤。

1.配制培养基（上次实验完成）2.鉴别实验1）．糖(醇)类发酵试验

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编号：在各试管上分别标明发酵培养基名称，所接种的菌名和组号，下同。接种：取葡萄糖发酵培养基3支，按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。同样取3支乳糖发酵培养基，1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。 将已接种好的培养基置32℃温箱中培养24h。2）.甲基红试验(m.R.试验)

将大肠杆菌和产气杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，32℃培养24h，加甲基红指示剂数滴，观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴性。 3）.伏一普试验(V．p．试验)

将被检菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，32℃培养24h，取出，加入40％Koh7滴，然后再加入等量的5％a-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温30min，以加快反应速度。若培养物呈现红色，为伏—普反应阳性。 4)．靛基质(吲哚)试验

将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，32℃培养24h后，滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，轻轻摇动，观察结果。 出现红色者为阳性，出现黄色者为阴性。5).硫化氢试验：

将大肠杆菌和变形杆菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，32℃培养24h，观察结果，若有黑色

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出现者为阳性。 6)明胶液化试验

取大肠杆菌和枯草杆菌的纯培养物少许，以接种针分别穿刺接种到营养明胶培养基中，置32℃培养24小时。故观察结果时，应将明胶培养基轻轻放入4℃冰箱30min，此时明胶又凝固。若放置于冰箱30min仍不凝固者，说明明胶被试验细菌液化，是为阳性。 7）柠檬酸盐利用试验

取少量被检菌接种到柠檬酸盐培养基上，32℃培养24h后，观察结果。培养基变深蓝色者为阳性。 8）淀粉水解试验

在培养进表面滴加碘液，观察是否变紫。 五、实验结果及分析

1.观察结果如下表：表1实验结果 阳性

表2.各项生理生化实验现象及意义 阴性（对照） 意义

细菌代谢产有机酸细菌代谢产生气体细菌代谢产有机酸细菌代谢产生气体ph下降到4.2以下细菌代谢产生乙酰 基甲醇细菌代谢可分解色 氨酸

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细菌代谢产生硫化 氢

细菌可产生明胶酶细菌可利用柠檬酸 盐作为碳源细菌可利用淀粉 现象

溶液仍为紫色杜氏小管中无气体溶液仍为紫色杜氏小管中无气体加入甲基红，培养基

为黄色培养基为黄色培养基为黄色无黑色固体产生明胶在25℃以下不

能液化培养基仍为绿色 变紫 意义

细菌代谢不产酸细菌代谢不产生气 体

细菌代谢不产酸细菌代谢不产生气 体ph值大于6细菌代谢不产生乙 酰基甲醇细菌代谢不能分解 色氨酸细菌代谢不产生硫 化氢

细菌不能产生明胶 酶

细菌不能利用柠檬酸盐作为碳源细胞无法利用淀粉

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现象溶液变黄 葡萄糖发酵实验 杜氏小管中有气体（> 体积10%）溶液变黄 乳糖发酵实验 杜氏小管中有气体（> 体积10%）

甲基红试验伏-普试验吲哚试验硫化氢试验明胶液化试验柠檬酸盐利用试 验淀粉水解试验 加入甲基红，培养基

呈现红色培养基呈现红色培养基呈现红色产生黑色固体明胶在4℃仍能保持

液化状态培养基由绿色变为深 蓝色不变，黄色 2.照片及分析： 1）．糖(醇)类发酵试验

现象：葡萄糖发酵中，三个菌种的溶液都变黄，为阳性；仅大肠杆菌杜氏小管含气泡。

分析：大肠杆菌能分解葡萄糖，产生甲酸等产物，并有甲酸解氢酶，可将其分解为co2和h2，故生化反应结果为产酸产气。而另外两种菌代谢产生了酸，但没有气体产生。另

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外，未知菌溶液临近表面处有一层深色区域，不像指示剂的颜色，可能为某种代谢产物。

图1葡萄糖发酵（从左到右依次为对照、大肠杆菌、未知菌、变形杆菌）

现象：乳糖发酵中，未知菌和变形杆菌都不变色，大肠杆菌的培养液变黄。只有大肠杆菌杜氏小管有气泡。 分析：变形杆菌无法利用乳糖，未知菌无法利用乳糖或在乳糖代谢途径中没有产生有机酸，大肠杆菌乳糖代谢途径产生了有机酸，且产生了气体

图2乳糖发酵（从左到右依次为对照、未知菌、变形杆菌、大肠杆菌）2）.甲基红试验(m.R.试验 )

现象：甲基红试验中，大肠杆菌为深红色，说明其产生的酸最多；未知菌为桔红色，说明它产酸量中等；产气杆菌为黄色，说明它基本不产酸。

分析：大肠杆菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸等，使培养基的ph降低，培养基呈现红色。产气杆菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，，使ph升至大约6，培养基呈现黄色。 图3甲基红试验（从左到右依次为对照、大肠杆菌、产气杆菌、未知菌）

3）.伏一普试验(V．p．试验)

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图4V.p试验（从左到右依次是大肠杆菌、产气杆菌、未知菌）4)．靛基质(吲哚)试验

现象：大肠杆菌黄色（即无变化），产气杆菌稍有红色，未知菌为红色。

分析：，说明大肠杆菌在葡萄糖蛋白胨水中代谢不产生乙酰基甲醇；产气杆菌产生了少量乙酰基甲醇；未知菌产生了较多乙酰基甲醇

注：V.p.试验一开始是没有现象的，最后把其他的试管都洗了后(这也是没有对照的原因)，我们重新滴加了边台的naoh，然后用a-萘酚溶液处理，所以估计一开始没有现象的原因可能和Koh失效有关。

现象：吲哚试验中，未知菌没有变化；产气杆菌和大肠杆菌溶液表面产生了少量玫瑰红。

分析：未知菌无法分解色氨酸，产气杆菌和大肠杆菌可以分解色氨酸。

另外，对照组也出现了玫瑰红，照理说里面没有微生物分解蛋白胨中的色氨酸产生靛基质的话，是不会反应产生红色化合物的，估计试剂有污染，比如有含色氨酸酶的杂菌引入。

图5吲哚试验（从左到右依次是对照、未知菌、产气杆菌、大肠杆菌）5).硫化氢试验： 图片不是很清晰，请见谅。

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现象：硫化氢试验中，仅有变形杆菌产生了黑色物质。三只试管接种周围都有向外扩展现象。

分析：仅变形杆菌能分解含硫的氨基酸并产生硫化氢。三种菌均具有运动能力

图6硫化氢试验（从左到右依次是对照、未知菌、变形杆菌、大肠杆菌）6).明胶液化试验

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