孟宪荣;许伟;魏蓝;贾超;蒋村
【摘 要】以苏州某化工场地污染土壤为菌源,以目标污染物为唯一碳源,通过连续培养、分离纯化筛选出高效酚类化合物降解菌.利用16S rDNA基因测序、构建基因树等分子生物学技术手段确定菌株种属,并研究了菌株对酚类化合物耐受性和降解效果.结果表明:以4-甲基苯酚(4-MP)和4-氯-3-甲基苯酚(4-C-3-MP)为唯一碳源筛选出了2株菌,分别为嗜麦芽窄食单胞菌(NM)和香茅醇假单胞菌(NCM).菌株NM对4-MP耐受性良好,4-MP浓度为400 mg∕L时仍能生长繁殖;菌株NCM对4-C-3-MP耐受性较差,4-C-3-MP浓度≥200 mg∕L时,菌株NCM受到完全抑制,停止生长.菌株NM不能降解土壤中苯酚,对4-MP和4-C-3-MP去除效果良好,第20天时去除率分别达到43％和22％;菌株NCM对土壤中苯酚、4-MP和4-C-3-MP均有降解效果,第20天时苯酚、4-MP和4-C-3-MP去除率分别为20％、26％和28％,较第15天时去除率分别提高了18、3和6个百分点. 【期刊名称】《环境工程技术学报》 【年(卷),期】2018(008)004 【总页数】7页(P449-455)
【关键词】土壤;微生物修复;酚类化合物;高效降解菌 【作 者】孟宪荣;许伟;魏蓝;贾超;蒋村
【作者单位】苏州市环境科学研究所,江苏 苏州 215007;苏州市环境科学研究所,江苏 苏州 215007;苏州科技大学环境工程学院,江苏 苏州 215009;苏州科技大学环境工程学院,江苏 苏州 215009;苏州科技大学环境工程学院,江苏 苏州 215009
【正文语种】中 文 【中图分类】X53
土壤是生态环境的重要组成部分，是工业和农业生产的重要载体和物质基础[1]。近年来，随着工农业的迅速发展，土壤环境污染问题受到广泛关注。急需对大量受到严重污染的土壤进行土壤环境调查和修复治理。
土壤修复技术主要包括物理修复技术、化学修复技术和生物修复技术。而土壤微生物修复技术是目前国内外的研究热点。土壤微生物修复是利用土著或者外源微生物，通过改变环境条件促进或强化微生物降解功能，从而达到降低有毒污染物活性或降解成无毒物质[2]。土著微生物在有机污染土壤修复过程中发挥着重要作用，但一般情况下土著微生物生长速度缓慢、代谢活性低，受污染物影响而数量下降[3]。因而，需要通过人为的生物刺激手段对土著微生物进行刺激，促进其生长，包括向土壤中通气[4]、投加营养液[5-7]、电子受体[4]、表面活性剂或者其他添加剂[8-9]等，或通过向污染土壤中投加外源高效降解菌株、菌群等生物强化手段提高土壤中有机污染物降解效率[10-14]。其中投加外源高效降解菌株或菌群具有缩短微生物驯化周期、克服降解微生物的不均匀性、加速污染物生物降解、恢复微生物区系等作用[3]，因而得到广泛研究和应用。土壤微生物修复技术与土壤物理化学修复技术相比，具有不改变土壤性质、原位处理不扰动土壤、修复成本低、不存在二次污染等特点[15-17]。
酚类化合物是一种重要的化工原料，其毒性高、难降解，具有致癌、致畸、致突变作用，并可长期残留于土壤和水环境中[18]。目前采用微生物法降解酚类化合物的研究多集中于微生物法处理水中的酚类化合物[19-23]，而对土壤中酚类化合物的微生物筛选和降解鲜有报道。笔者以某化工污染场地酚类化合物污染土壤为研究对
象，通过连续培养从中筛选出能够降解土壤中酚类化合物的菌株；并利用分子生物学等技术手段研究筛选出的菌株生理生化性质；进一步研究筛选出的菌株对酚类污染物的耐受性及对土壤中酚类化合物的降解效果，以期为酚类污染土壤修复提供高效降解菌株和基础技术参数。 1 试验 1.1 菌种来源
菌源取自苏州市某化工场地严重污染的土壤，土壤取样深度为表层土以下20～30 cm。经检测分析，土壤中主要酚类污染物为苯酚、4-氯-3-甲基酚(4-C-3-MP)和4-甲基苯酚(4-MP)。 1.2 方法
1.2.1 菌株分离纯化
分别取5 g土壤加入到浓度为100 mgL含有4-MP和4-C-3-MP的无机盐液体培养基中，于30 ℃、150 rmin摇床中培养2～4 d。对培养后的土悬液进行梯度稀释，稀释梯度分别为10-3、10-4和10-5。分别移取不同梯度菌液1 mL至浓度为50 mgL含有4-MP和4-C-3-MP的固体无机盐培养基中，混匀，30 ℃恒温培养箱中培养3～5 d。观察培养基表面长出的菌落，挑取不同形态的菌落，进行划线分离、纯化，反复进行3～6次，纯化至第6代时，挑取培养皿中生长的单一菌落进行显微镜观察，初步确认纯化是否完成。所有操作均在无菌环境中进行。 1.2.2 菌种的生理生化鉴定
对分离纯化后的细菌进行生理生化鉴定，包括革兰氏染色试验、氧化酶试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验，各试验方法参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)[24]、《常见细菌系统鉴定手册》[25]及《微生物分类学》[26]。
1.2.3 菌种的分子生物学鉴定
菌株16S rDNA测序由生物工程上海有限责任公司使用SK8131胶回收试剂盒、SK8255 Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒完成。 1.2.4 菌株耐受性试验
向含有4-MP浓度分别为0、50、200、400、800 mgL的液体培养基中加入1.5 mL菌悬液，4-MP浓度为0 mgL的培养基中添加牛肉膏蛋白胨作为碳源对照，28 ℃、150 rmin恒温摇床中培养，分别在0、4、8、24、34、48、58 h时测定实时生长量，绘制生长曲线。对4-C-3-MP的耐受性考察方法同上。 1.2.5 酚类化合物降解效果试验 1.2.5.1 对照试验
选取某一干净地块土壤，阴干、研磨，过22目筛后待用。取2个容积为3 L的透明塑料桶中各加入1 kg备用土壤，2个塑料桶土壤中分别添加4-MP和4-C-3-MP，各自混匀后用无污染土壤装满、压实、密封。在第1天和第25天取样，测定土壤中酚类污染物浓度。检测结果如表1所示。由表1可知，未添加纯化菌株的干净土壤25 d内对污染物几乎没有去除效果。
表1 对照试验结果Table 1 Results of the blank test项目浓度
∕(mg∕kg)4⁃MP4⁃C⁃3⁃MP第1天615 97509 76第25天619 11499 93去除率∕%—1 9
1.2.5.2 酚类化合物降解试验
取某一干净地块土壤，阴干、研磨，过22目筛后待用。称取一定量土壤向其中添加苯酚、4-MP和4-C-3-MP，混匀，用无污染土壤压实、密封，防止污染物挥发，模拟土壤环境，保存，待用。将生长至对数生长期的菌株以3%接种量接入已制备好的污染土壤中，用灭菌培养基调节含水率至30%，充分混匀。为防止取样过程中污染物挥发影响试验结果，已配好的土壤样品均质分装于20 mL离心管中，立刻测定污染物浓度，即为土壤中污染物初始浓度结果见表2；之后定期取样测定土
壤中的污染物浓度。
表2 土壤中酚类化合物初始浓度Table 2 Initial concentration of phenolic compounds in soil mgkg苯酚4⁃MP4⁃C⁃3⁃MP718 21～727 29269 09～317 66270 14～283 79 1.2.6 样品处理及分析
弃去离心管上端2～3 cm处土壤后，称取5 g(精确至0.01 g)土壤于20 mL离心管中，加入15 mL丙酮与二氯甲烷混合溶剂(体积比为1∶2)，摇匀后于30 ℃、200 rmin条件下振荡20 min，继续超声波提取20 min，将提取液过0.22 μm有机滤膜，重复提取3次，合并提取液，旋转蒸发至近干，定容至1 mL，待测。 酚类化合物的浓度采用安捷伦气相色谱-质谱联用仪检测(气相色谱仪型号为7890B，质谱仪型号为5977A，安捷伦科技有限公司)，色谱柱为毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm，HP-5)。仪器运行条件：进样口温度270 ℃。升温程序：柱温40 ℃,保持3 min，以15 ℃min升至150 ℃，再以20 ℃min升至270 ℃，保持15 min。传输线温度250 ℃，四级杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，离子扫描。载气为高纯度氦(99.999%)。柱内流量采用恒流控制为1.0 mLmin。进样方式：不分流进样，溶剂延迟5.4 min，进样量为1.0 μL。酚类化合物空白加标回收率检测结果见表3。
表3 酚类化合物空白加标回收率
Table 3 The blank recovery rate of phenolic compounds %苯酚4⁃MP4⁃C⁃3⁃MP81 08～129 677 82～112 778 88～146 9 2 结果与讨论 2.1 菌株分离纯化结果
以4-MP为唯一碳源筛选出一株菌，命名为NM；以4-C-3-MP为唯一碳源筛选出一株菌，命名为NCM。
2.2 菌种的生理生化鉴定结果 2.2.1 细菌形态观察
菌株NM菌体呈淡黄色，表面生长平整，边缘整齐。团聚，稍显干燥，易挑起，生长4 d左右菌落稍显黄色；菌株NCM菌体呈黄色，表面生长平整，边缘呈啮齿状。团聚，稍显干燥，易挑起。菌株纯化平板如图1所示。 图1 菌株纯化平板Fig.1 Purified tablet of bacteria 2.2.2 菌种的生理生化鉴定结果
对菌株NM和NCM的生理生化鉴定结果见表4。
表4 菌株NM和NCM部分生理生化测定结果Table 4 Physiological and biochemical characteristics of bacteria strains NM and NCM试验菌株NM菌株NCM革兰氏染色试验--氧化酶试验+-淀粉水解试验-+明胶水解试验++吲哚试验+-甲基红试验++硝酸盐还原试验+-
从表4可以看出，菌株NM和NCM在革兰氏染色试验、明胶水解试验、甲基红试验结果一致，在氧化酶试验、淀粉水解试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验中结果相反。说明菌株NM和NCM生理生化性质具有差异性。 2.2.3 菌种的分子生物学鉴定结果
根据生物工程上海有限责任公司的16S rDNA测序结果，对菌株NM和NCM的16S rDNA基因序列在NCBI上进行BLAST比对分析，使用Mega 5.1构建系统发育树，结果分别如图2和图3所示。BLAST比对分析显示NM的16S rDNA基因序列与嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia strain)的16S rDNA序列同源性高达90%，NCM的16S rDNA基因序列与香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis strain ATCC 13674)的16S rDNA序列同源性高达100%。同时结合生理生化试验，比对《伯杰细菌鉴定手册》[24]和《常见细菌系统鉴定手册》[25]，确定菌株NM为嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas
maltophilia strain)，菌株NCM为香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis strain ATCC 13674)。
图2 菌株NM的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree diagram of NM 图3 菌株NCM的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree diagram of NCM 2.3 菌株NM和NCM耐受性分析
分别考察菌株NM对4-MP和菌株NCM对4-C-3-MP的耐受性。 2.3.1 菌株NM对4-MP的耐受性分析
菌株NM在不同浓度4-MP液体培养基中的生长状况如图4所示。
图4 菌株NM在不同浓度4-MP培养基中生长状况Fig.4 Growth of NM in different concentrations of 4-MP medium
从图4可以看出，当4-MP浓度≤200 mgL时，菌株NM生长未受到明显抑制。菌株NM能够快速适应含污染物环境并开始增殖，生长趋势与未添加4-MP环境下菌株生长趋势相似，符合Logistic非线性拟合。菌株生长达到稳定期后，菌株浓度较未添加4-MP环境下有所降低。当4-MP浓度为400 mgL时，菌株NM受到的抑制作用显著增加，与未添加4-MP菌株NM生长曲线相比，菌株NM迟缓期延长，增长速度变缓，达到稳定期时菌株浓度降低，58 h时菌液A600为1.2左右，较未添加4-MP菌液58 h时的A600降低了29%。当4-MP浓度为800 mgL时，菌株NM生长受到了完全抑制，不能增殖生长。分析可知，菌株NM对4-MP具有良好的耐受性，当4-MP浓度达到400 mgL时，菌株生长受到了明显抑制，但当菌株适应环境后仍然能够生长。 2.3.2 菌株NCM对4-C-3-MP耐受性分析
菌株NCM在不同浓度4-C-3-MP液体培养基中的生长状况如图5所示。 图5 菌株NCM在不同浓度4-C-3-MP培养基中生长状况Fig.5 Growth of NCM in different concentrations of 4-C-3-MP medium
从图5可以看出，在未添加4-C-3-MP环境下，菌株NCM生长迅速，在10 h内基本达到稳定期；当4-C-3-MP浓度为50 mgL时，菌株NCM生长受到了显著抑制，生长速度显著降低，58 h时菌液A600为1.28，较未添加4-C-3-MP菌液58 h时A600降低了约10%。当4-C-3-MP浓度≥200 mgL时，菌株NCM生长受到完全抑制，不能生长。分析可知，菌株NCM对4-C-3-MP耐受性较差。 2.4 菌株NM和NCM对土壤中酚类化合物降解
图6 菌株NM和NCM对酚类化合物去除效果Fig.6 Removal efficiency of phenols by bacteria NM and NCM
菌株NM和NCM对苯酚、4-MP和4-C-3-MP第15天和第20天的降解效果如图6所示。由图6可知，第15天时，菌株NM对苯酚没有去除效果，对4-MP和4-C-3-MP去除率分别约为37%和15%；菌株NCM对苯酚、4-MP和4-C-3-MP去除率分别约为2%、23%和22%。第20天时，菌株NM对苯酚几乎没有降解效果，对4-MP和4-C-3-MP的去除率为43%和22%，较第15天分别提高了约6和7个百分点；菌株NCM对苯酚、4-MP和4-C-3-MP去除率为20%、26%和28%，较第15天分别提高了18、3和6个百分点，从数值上来看，2种菌株对酚类化合物第20天时去除效果较第15天时并未明显提高。
菌株NM对苯酚几乎没有降解效果，对4-MP和4-C-3-MP有明显的降解效果，对3种酚类化合物降解效果为4-MP>4-C-3-MP>苯酚。微生物对酚类化合物降解过程关键是酶的催化[27]，一方面菌株NM是以4-MP为唯一碳源筛选出的菌株，可能无法产生降解苯酚的酶，因此对4-MP降解效果最好，却不能降解苯酚；另一方面，微生物对酚类化合物的降解效果与酚类化合物结构有关。甲基使苯环活化，使之更容易被微生物分解；氯代基使苯环钝化，苯环上电子云密度降低，使之难以被微生物分解[28]。因此菌株NM对4-MP的降解效果比对4-C-3-MP好。 菌株NCM对苯酚、4-MP和4-C-3-MP污染物均有降解效果，对3种酚类化合
物降解效果为4-C-3-MP≈4-MP>苯酚。菌株NCM是以4-C-3-MP为唯一碳源筛选出的菌株，因此对4-C-3-MP具有良好的降解效果。由于4-MP与4-C-3-MP具有相似的分子结构，且反应活性较4-C-3-MP更好，因此菌株NCM对4-MP也有良好的降解效果，与对4-C-3-MP降解效果相似。菌株NCM与NM不同，能够降解苯酚，且随着反应时间增加，降解效果明显提高，这可能是因为苯酚对菌株NCM具有一定的抑制作用，随着反应时间增加，菌株NCM逐渐适应环境并产生分解苯酚的酶，从而对苯酚进行降解。 3 结论
(1)筛选出2株酚类化合物降解菌，通过16S rDNA基因测序和建立基因树，结合生理生化试验确定2株菌分别为嗜麦芽窄食单胞菌和香茅醇假单胞菌，分别命名为菌株NM和菌株NCM。
(2)菌株NM对4-MP具有良好的耐受性，当4-MP浓度为400 mgL时对菌株NM产生抑制作用，但菌株适应后仍能很好地生长繁殖；菌株NCM对4-C-3-MP的耐受性较差，当4-C-3-MP浓度≥200 mgL时，菌株NCM受到完全抑制，停止生长。
(3)菌株NM对土壤中苯酚没有降解效果，对4-MP和4-C-3-MP有明显降解效果，第20天时，菌株NM对土壤中4-MP和4-C-3-MP的去除率分别为43%和22%；菌株NCM对土壤中苯酚、4-MP和4-C-3-MP污染物均有降解效果，第20天时，菌株NCM对土壤中苯酚、4-MP和4-C-3-MP的去除率分别为20%、26%和28%。 参考文献
【相关文献】
[1] 范聪,肖炜,张仕颖.微生物修复污染土壤的应用研究进展[J].贵州农业科学,2017,45(8):53-58. FAN C,XIAO W,ZHANG S Y.Advances in application of microorganisms in contaminated soil[J].Guizhou Agricultural Sciences,2017,45(8):53-58.
[2] 孙玉军,王效科,王如松.五指山保护区生态环境质量评价研究[J].生态学报,1999,19(3):365-370. [3] 刘张,周成.污染土壤微生物修复技术[J].生物技术世界,2013(1),18-20.
[4] 黄廷林,唐智新,徐金兰,等.黄土地区石油污染土壤生物修复室内模拟试验研[J].农业环境科学学报,2008,27(6):2206-2210.
HUANG T L,TANG Z X,XU J L,et al.Laboratory study on bioremediation of petroleum-contaminated soil in loess region of China[J].Journal of Agro-Environment Science,2008,27(6):2206-2210.
[5] 乔俊,陈威,张承东.添加不同营养助剂对石油污染土壤生物修复的影响[J].环境化学,2010,29(1):6-11.
QIAO J,CHEN W,ZHANG C D.Bioremdiation of petroleum on taminated soil by verious nutrient amendments[J].Evironmental Chemistry,2010,29(1):6-11.
[6] SARKAR D,FERGUSON M,DATTA R,et al.Bioremediation of petroleum hydrocarbons in contaminated soils:comparison of biosolids addition,carbon supplementation,and monitored natural attenuation[J].Environmental Pollution,2005,136(1):187-195. [7] AYOTAMUNO M J,KOGBARA R B,OGAJI S O T,et al.Bioremediation of a crude-oil polluted agricultural soil at Port Harcourt,Nigeria[J].Applied Energy,2006,83:1249-1257. [8] 牛明芬,韩晓日,郭书海.生物表面活性剂在石油污染土壤生物预制床修复中的应用研究[J].土壤通报,2005,36(5):712-715.
NIU M F,HAN X R,GUO S H.Application of biosurfactant in the biodegradation of petroleum contaminated soil with bio-prepared bed[J].Chinese Journal of Soil Science,2005,36(5):712-715.
[9] 张秀霞,滕芝,吴佳东.激活剂对石油污染土壤修复的强化作用及修复条件的优化[J].石油学报,2013,29(2):353-358.
ZHANG X X,TENG Z,WU J D.Strengthening bioremedation of oil contaminated soil by activation agent and optimization of bioremediation conditions[J].Acta Petrolei Sinica,2013,29(2):353-358.
[10] 李春荣.石油污染土壤的生态效应及生物修复研究[D].西安:长安大学,2009. [11] RAHMAN K S M,BANAT I M,THAHIRA J,et al.Bioremediation of gasoline contaminated soil by a bacterial consortium amended with poultry litter,coir pith,and rhamnolipid biosurfactant[J].Bioresource Technology,2002,81(1):25-32.
[12] 魏小芳,张忠智,郭绍辉,等.外源微生物强化修复石油污染土壤的研究[J].石油化工高等学校学报,2007,20(2):1-4.
WEI X F,ZHANG Z Z,GUO S H,et al.Ex site-bio remediation of petroleum-contaminated soil with exogenous microbe[J].Journal of Petrochemical Universities,2007,20(2):1-4.
[13] 张秀霞,滕芝,吴佳东.生物强化修复石油污染土壤[J].环境工程学报,2013,7(4):1573-1577. ZHANG X X,TENG Z,WU J D.Bioaugmentation remediation of petroleum contaminated soil[J].Chinese Journal of Environmental Engineering,2013,7(4):1573-1577. [14] 屠明明,王秋玉.石油污染土壤的生物刺激和生物强化修复[J].中国生物工程杂志,2009,29(8):129-134.
TU M M,WANG Q Y.Biostmiulation and bioaugmentation repair of oil contaminated soil[J].China Biotechnology,2009,29(8):129-134.
[15] 宋雪英,宋玉芳,孙铁珩,等.矿物油污染土壤中芳烃组分的生物降解与微生物生长动态[J].环境科学,2004,25(3):115-119.
SONG X Y,SONG Y F,SUN T H,et al.Biodegradation of aromatic hydrocarbons and dynamics of microbe growth in soils contaminated with mineral oil[J].Environmental Science,2004,25(3):115-119.
[16] 焦海华,潘建刚,徐圣君,等.原位生物修复提高多环芳烃污染土壤农用安全性[J].环境科学,2015,36(8):3038-3044.
JIAO H H,PAN J G,XU S J,et al.Improving agricultural safety of soils contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons by in situ bioremediation[J].Environmental Science,2015,36(8):3038-3044.
[17] LU L,YAZDI H,JIN S,et al.Enhanced bioremediation of hydrocarbon-contaminated soil using pilot-scale bioelectrochemical systems[J].Journal of Hazardous Materials,2014,274:8-15.
[18] 陈洁霞,韦恩泽,鲜啟鸣.长江沿岸某化工园区土壤、底泥中酚类化合物的污染现状[J].色谱,2014,32(8):843-848.
CHEN J X,WEI E Z,XIAN Q M.Pollution status of phenolic compounds in the soil and sediment from a chemical industrial park along the Yangtze River[J].Chinese Journal of Chromatography,2014,32(8):843-848.
[19] LI L H,ZHANG P Y,ZHU W P.Comparison of O3-BAC,UVO3-BAC and TiO2UVO3-BAC processes for removing organic pollutants in secondary effluents[J].Journal of Photochemistry and Photobiology A:Chemistry,2005,171:145-151.
[20] 李日强,王翠红,辛晓芸,等.焦化废水处理中酚、氰降解细菌的分离选育[J].重庆环境科学,2002,24(3):23-24.
LI R Q,WANG C H,XIN X Y,et al.Isolation and screening of degrading cyanide and phenol bacteria in the coke wastewater treatment[J].Environment Science of Chongqing,2002,24(3):23-24.
[21] 陈明,张维,徐玉泉,等.醋酸钙不动杆菌PHEA-2对苯酚的降解特性研究[J].中国环境科学,2001,21(3):226-229.
CHEN M,ZHANG W,XU Y Q,et al.Study on characteristics of Acinetobater calcoaceticus PHEA-2 for phenol degradation[J].China Environmental Science,2001,21(3):226-229.
[22] HOLLENDER J,HOPP J,DOTT W.Degradation of 4-chlorophenol via the meta cleavage pathway by Comamonas testosteroni JH5[J].Applied and Environmental Microbiology,1997,63(11):4567-4572.
[23] COLE J R,CASCARELLI A L,MOHN W W,et al.Isolation and characterization of a novel bacterium growing via reductive dehalogenation of 2-chlorophenol[J].Applied and Environmental Microbiology,1994,60(10):3536-3542.
[24] 布坎南,吉布斯.伯杰氏细菌鉴定手册[M].8版.颜子颖,王海林,译.北京:科学出版社,1999. [25] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001. [26] 张纪忠.微生物分类学[M].上海:复旦大学出版社,1990.
[27] 刘蛟.菌群中关键菌株降解酚类废水、本征动力学及环境代谢组学解析[D].天津:天津大学,2012.
[28] 闻欣,薛光璞,张群,等.酚类化合物在水环境中的生物降解研究[J].黑龙江环境通报,2010,34(3):63-66.
WEN X,XUE G P,ZHANG Q,et al.Study on biological degradation of phenolic compounds in water[J].Heilongjiang Environmental Journal,2010,34(3):63-66.○
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