类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征

第１１卷第６期　２０１３年１１月　生物加工过程　Ｖｏ１．１１　Ｎｏ．６　ＮＯＶ．２０１３　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—３６７８．２０１３．０６．００９　类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征　熊　斌，应向贤，陈丽娜，谢丽萍，魏　春，汪　钊　（浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州３１００１４）　摘要：从类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺＯ０８的发酵上清液中纯化得到一个高活力碱性果胶裂解酶，经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　电泳估算其亚基相对分子质量为４．５×１０　。通过对该酶进行酶学性质研究发现：该酶能催化裂解果胶酸、低酯果　胶和高酯果胶；酶催化反应最适温度范围为５５～６０℃，最适ｐＨ为９．６，在最适条件下以低酯果胶为底物酶的比酶　活达３　０２１．６　Ｕ／ｍｇ；Ｃａ“能增强该酶的活力，而Ｍｎ“，Ｂａ“和ＥＤＴＡ强烈抑制该酶活力；＇３没有ｃａ“存在时，高度　－酯化的果胶是该酶的最适底物，在４　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃａ“存在时，该酶以果胶酸为底物比酶活最高（２５　４６７　Ｕ／ｍｇ）。该酶Ｎ　端序列比对分析发现与类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　２７ｅ６４果胶裂解酶高度同源。　关键词：酶争陛质；酯化果胶；碱性果胶酶；纯化　中图分类号：Ｑ８１４　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７２—３６７８（２０１３）０６—００４２—０５　Ｐｕｒｉｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｆＯｎ　ｏｆ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｆａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　ＸＩＯＮＧ　Ｂｉｎ，ＹＩＮＧ　Ｘｉａｎｇｘｉａｎ，ＣＨＥＮ　Ｌｉｎａ，ＸＩＥ　Ｌｉｐｉｎｇ，ＷＥＩ　Ｃｈｕｎ，ＷＡＮＧ　Ｚｈａｏ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３　１００１４，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｗａｓ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｕｐｅｍａｔａｎｔ　ｏｆ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓＤ．　ＷＺ００８　ｇｒｏｗｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｅｃｔｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｉｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｗａｓ　ｆｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ａｒｏｕｎｄ　４．５×１０　ｂｙ　ＳＤＳ．ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｎ　ｂｏｔｈ　ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｐｅｃｔｉｎｓ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｉｆｅｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｗａｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｉｎ　ａ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　５５℃ｔｏ　６０℃ａｎｄ　ａｔ　ｐＨ　９．６．Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｗａｓ　ｕｐ　ｔｏ　３　０２１．６　Ｕ／ｍｇ　ｕｓｉｎｇ　２０％ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｐｅｃｔｉｎ　ａｓ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　Ｃａ“　，ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｕｔ　Ｍｎ“Ｂａｚ　，ａｎｄ　ＥＤＴＡ　ｓｔｒｏｎｇｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｉｔ．Ｈｉｇｈｌｙ　ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｐｅｃｔｉｎ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　Ｃａ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｆ　２５　４６７　Ｕ／ｍｇ）ｏｎ　ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　４　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃａ　．Ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ．ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ａ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　２７ｃ６４．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ；ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｐｅｃｔｉｎ；ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　果胶裂解酶（ＰＥＬ，ＥＣ　４．２．２．２）能通过　一消除　的环境中催化效率较高，是对棉织物精炼效果最好　断裂聚半乳糖醛酸（ＰＧＡ）的　一１，４糖苷键得到４，　５位不饱和产物　。碱性果胶酶通常在ｐＨ　８～１０　的酶　，可以从未加工棉中去除非纤维素物质从而　提高棉的吸收能力和洁白度　。与化学加工过程　收稿日期：２０１３—０１—３０　基金项目：浙江省自然科学基金（ＬＹ１２Ｂ０６０１０）；教育部留学回国人员科研启动基金（第４０批）　作者简介：熊斌（１９８８一），男，湖北荆州人，硕士研究生，研究方向：生物催化与转化；汪钊（联系人），教授。Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｚｗａｎｇｚｈａｏ＠１６３．ｃｏｒｎ　第６期　熊斌等：类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征　４３　相比，纺织原料的酶法生物精炼对环境更友好。除　此之外，碱性果胶酶还可用于麻类生物脱胶、生物　制浆、果胶低聚糖制备等方面，同时它也是一种重　要的饲料用酶　。最新的研究表明碱性果胶酶在　植物抗病中具有良好的诱导效果＿５　。　碱性果胶酶的嗜碱性是其基本特征，细菌碱性　果胶裂解酶最适作用ｐＨ一般在８～１０，有报道果胶　裂解酶最适ｐＨ可高达１１．５　７１。由于许多细菌在偏　碱性的环境生长良好，因而细菌是碱性果胶裂解酶　的主要微生物来源。许多微生物碱性果胶裂解酶　的酶学性质已被表征，其微生物来源包括Ｂａｃｉｌｌｕｓ、　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ和Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　等＿４　Ｊ。尽管碱性果胶酶的相关研究已有较多报道，　但发现并研究新型高活力的碱性果胶裂解酶对其　工业应用仍具有重要的意义。　碱性果胶裂解酶产生菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＷＺ００８是从腐烂的水果表皮筛选到的，笔者所在课　题组吴茜等　前期研究已表明其在生物精炼上具　有应用潜力。在此基础上，笔者对类芽胞杆菌　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｓｕ　ｓｐ．ＷＺ００８碱性果胶裂解酶进行分离　纯化，并对其酶学性质进行了详细表征，以期为其　工业应用提供基础数据。　１材料与方法　１．１材料　１．１．１　菌种　类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺＯ０８是浙江工　业大学生物细胞培养实验室筛选并保存的菌种。　１．１．２试剂与药品　层析填料Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　ＴＹＰＥ　Ｉ，Ｂｉｏ－　Ｒａｄ公司；层析填料Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ｐｒｅｐ　ｇｒａｄ，ＧＥ　Ｈｅａｈｈｃａｒｅ公司；果胶酸、低酯及高酯果胶均由衢州　果胶公司提供。其他试剂和药品均为国产分析纯。　１．１．３仪器　蛋白质电泳仪、低压层析仪（ＢｉｏＬｏｇｉｃ　ＬＰ，Ｂｉｏ－　Ｒａｄ公司），ＡＫＴＡ蛋白层析系统、紫外可见分光光　度计（Ａｍｅｒｓｈａｍ公司）。　１．２方法　１．２．１类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｓｕ　ｓｐ．ＷＺＯ０８的培养　用于类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺＯ０８生长　的液体培养基组成：１　Ｌ的培养基中蛋白胨１０　ｇ；酵　母膏１０　ｇ；酯化果胶６　ｇ。固体培养基在上述液体培　养基中加入２Ｏ　ｇ／Ｌ的琼脂。类芽胞杆菌　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８在该液体培养基中于３０　ｑＣ、　２００　ｒ／ｍｉｎ下培养４６　ｈ。所得的发酵液于６　０００　ｇ下　离心１５　ｍｉｎ，收集上清液用作后续实验。　１．２．２类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｓｕ　ｓｐ．ＷＺＯ０８果胶裂　解酶的纯化　将离心得到的５００　ｍＬ上清液先用５０％的饱　和（ＮＨ　）：ＳＯ　沉淀去除杂质，然后用８０％的饱和　（ＮＨ　）　ＳＯ　沉淀果胶酶。将用８０％的饱和　（ＮＨ　）２ｓ０４得到的沉淀重新悬浮于含有５　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｋ　ＰＯ　的５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣ１缓冲液（ｐＨ　８．０）中。　悬浮好的酶液以０．５　ｍＬ／ｍｉｎ的流速上样到预先　平衡好的羟基磷灰石柱中（１．５　ｃｍ　ｘ　２０　ｅｍ），上样　量为１０　ｍＬ，用含有５～２５０　ｍｍｏＬ／Ｌ　Ｋ　ＰＯ４的Ｔｒｉｓ—　ＨＣ１（５０　ｍｍｏＬ／Ｌ，ｐＨ　８．０）线性梯度洗脱果胶酶，洗　脱流速为１　ｍＬ／ｍｉｎ。将含有果胶酶活力的洗脱组　分合并到一起，并通过ＰＭ一３０的超滤膜浓缩。浓　缩好的试样（０．５　ｍＬ）用于后续Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００凝胶　过滤色谱（１．０　ａｍ　ｘ　３０　ｃｍ），该柱的平衡和洗脱都　以５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（ｐＨ　８．０）为缓冲液，流速为　０．５　ｍＬ／ｍｉｎ。在分离过程中，果胶裂解酶试样通　过ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳来验证其纯度。纯化后的果胶　裂解酶Ｎ一端序列测定由上海基康生物技术公司　完成。　１．２．３果胶裂解酶活力测定　果胶裂解酶活力的测定是通过测定其在２３５　ｎｍ处的吸光度增值来实现的＿９　Ｊ。反应的具体流程　如下：先将４００　Ｌ的底物溶液（５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ　９．６　的Ｇｌｙ．ＮａＯＨ缓冲液中含有０．３３％的聚半乳糖醛酸　或果胶）于５５℃下预热，然后加入２００　Ｌ的酶液，　于５５℃下保温１０　ｍｉｎ。取出２００　Ｉ．ｔＬ的反应液加入　１．８　ｍＬ　ＨＣ１（０．０１　ｍｏｌ／Ｌ）终止反应，最后测定波长　２３５　ｎｍ的吸光值。一个酶活力单位定义为每分钟　产生１　ｌｘｍｏｌ不饱和半乳糖醛酸所需的酶量，计算所　使用的摩尔消光系数为４　６００　ｃｍ　／ｍｏｌ【１０］。文中所　有相对活力的１００％均指以２０％酯化果胶为底物测　得的比酶活。　１．２．４果胶裂解酶的性质表征　用于果胶裂解酶最适ｐＨ测定的缓冲液为５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１（ｐＨ　７．９～８．８）和Ｇｌｙ—ＮａＯＨ（ｐＨ　８．８～１　１．１）。酶的ｐＨ稳定性测定是将酶置于　ｐＨ　９．３或９．６的缓冲液中于４℃下保留一段时　间，然后测定残留活力。温度对酶活力影响是在　ｐＨ　９．６的Ｇｌｙ．ＮａＯＨ中进行，温度变化范围４０～　生物加工过程　第１１卷　７０℃。０．３３　ｍｍｏＬ／Ｌ不同金属离子加入到反应　体系中，然后检测活力，从而确定不同金属离子　２结果与讨论　２．１　类芽胞杆菌ＰａｅｎｉｂａｃｉＵｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８果胶裂　解酶的分离纯化　对酶的影响。为了测定酶的热稳定性，先将酶液　分别于５０、５５和６０℃孵育，然后按照常规的活　力测定方法测定其残留活力。酶动力学参数测　定反应体系如下，底物质量浓度范围为０．２～８　ｍｇ／ｍＬ，温度为５５℃，缓冲液为ｐＨ　９．６的５０　通过（ＮＨ　）：ＳＯ　沉淀、羟基磷灰石和凝胶过滤　８　６　４　３　２　ｌ　色谱等步骤对类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　××　×　×　×　Ｏ　０　Ｏ　Ｄ　Ｄ　２　×　果胶酶进行分离纯化，结果见表１。由表１可知：　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｇｌｙ—ＮａＯＨ，利用双倒数作图法计算　和　值。　１．２．５蛋白质浓度和果胶裂解酶亚基相对分子质　量的测定　总纯化倍数为５３．５倍，酶活力总收率为２７％，纯　酶的比酶活达到３　０２１．６　Ｕ／ｍｇ，高于已报道的果　胶裂解酶活力　，　，属于高活力果胶裂解酶。　ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳鉴定结果见图１。由图１可知，纯　蛋白质浓度的测定采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ检测法　，果　胶酶亚基相对分子质量通过ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳测定。　化后的酶只有单一条带，估算其亚基相对分子质　量为４．５×１０　。　表１　类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８果胶裂解酶的分离纯化　Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　ＰａｅｎｉｂａｃｉＵｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　注：ａ是指以２０％酯化果胶为底物进行果胶裂解酶活力测定的结果。　２　的催化活力的影响，结果见图２。由图２可知：在　ｐＨ　７．８～１１．１范围内该酶都有活力，当ｐＨ为９．６　时酶活力最高，因此该果胶酶属于碱性果胶酶家　族。对其ｐＨ稳定性的分析表明，当酶在４　ｃＩ＝下于　ｐＨ　９．３和９．６缓冲液中孵育４　ｈ后，酶的残留活力　分别为初始活力的９６．５％和７４．７％，表明该酶在碱　性条件下具有良好的稳定性。　１一蛋白质质量标准；２一纯化后的果胶酶　图１　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８果胶裂解　酶的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果　Ｆｉｇ．１　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｐｅｃｔａｔｅ　蜒　莨　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　２．２类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８果胶裂　解酶的酶学性质　２．２．１　ｐＨ对酶活力影响　考察ｐＨ对Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８果胶裂解酶　图２　ｐＨ对ＰａｅｎｉｂａｃｉＵｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　果胶裂解酶的催化活力影响　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐＨ　ｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆｐｕｒｉｉｆｅｄ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　ＰａｅｎｉｂａｃｉＵｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　第６期　熊斌等：类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征　４５　２．２．２温度对酶活力影响　由于细菌碱性果胶裂解酶的最适作用温度一般　为４０—７０℃　，所以笔者考察不同温度（４０～　７０　ｏＣ）下，温度对Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺＯ０８果胶裂解酶　活力的影响，结果见图３。由图３可知：酶的最适温度　范围为５５～６Ｏ　ｃ【＝。纯酶在低于５０℃的条件下活力　相对比较稳定，同时，该酶在５０℃下活力半衰期为１５　ｈ。当温度增加到５５　时，酶的半衰期降至３　ｈ，而温　度高于６０　ｑＣ时，酶则会很快失活（图４）。　！｝ｇ　莨　图３温度对Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　果胶裂解酶活力的影响　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ０Ｏ８　媲　霞　Ｏ　５　１Ｏ　１５　时间，ｈ　图４　ＰａｅｎｉｂａｃｉＵｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８果胶裂解酶的热稳定性　Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　２．２．３金属离子和ＥＤＴＡ对酶活力影响　考察不同金属离子对酶活力影响，结果见图５。　由图５可知：０．３３　ｍｍｏＬ／Ｌ的Ｃａ“极大增强了酶的　活力，与不加Ｃａ¨对照相比，活力提高了１．７倍，同　时，其他二价金属离子，如Ｍｇ“、Ｃｕ“、Ｃｏ“、Ｎｉ“和　Ｚｎ　对酶活力影响不明显，酶活力范围为不加Ｃａ“　对照的９５％～１０９％（图５）。Ｂａ“能强烈地抑制该　果胶裂解酶的活力，其酶活力仅为不加ｃａ¨对照的　７％，这一性质与报道的来自芽胞杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＢＰ一２３果胶裂解酶相似　。另外，Ｍｎ“和ＥＤＴＡ　也对酶有明显的抑制作用，其酶活力分别为不加　Ｃａ　对照的６６％和５３％。在没有外加Ｃａ　的情况　下该酶仍有较高活力，这可能是由于底物中微量的　残留Ｃａ　引起的。当ＰＧＡ、２０％酯化果胶和７０％酯　化果胶分别用作底物时，最适ｃａ　添加浓度分别为　２、４和４　ｍｍｏ￣Ｌ（图６）。　１２０　６０　Ｏ　金属离子和ＥＤＴＡ　图５　金属离子和ＥＤＴＡ对酶活力的影响　Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｍｅｔａｌ　ｉｏｎｓ　ｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　！｛ｇ　靛　Ｏ　２　４　６　８　ｌＯ　ｃ（Ｃａ￣　）／（ｍｍｏｌ‘Ｌ－　、　图６　ＰａｅｎｉｂａｃＵｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺＯ０８果胶裂解酶的底物特异。眭　Ｆｉｇ．６　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｐｅｃｉｉｆｃｉｔｙ　ｏｆ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙｒｅ　ｆｒｏｍ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　２．２．４底物特异性　分别考察该果胶裂解酶对ＰＧＡ、２０％酯化果胶　和７０％酯化果胶的特异性，催化反应中Ｃａ¨添加量　范围是０～１０　ｍｇ／ｍＬ。当不向反应中外加Ｃａ“时，　该果胶酶对７０％酯化果胶活力最高（２５　４６７　Ｕ／ｍｇ），分别是ＰＧＡ和２０％酯化果胶活力的３．０９　和１．８８倍。当反应混合体系中加入４　ｍｍｏ￣Ｌ　ＣａＣ１，时，酶对ＰＧＡ活力最高，分别是２０％和７０％酯　化果胶活力的１．２５和１．４６倍（图６）。　２．２．５动力学参数　分别以ＰＧＡ，２０％酯化果胶和７０％酯化果胶为　底物，在０．２—８　ｍｇ／ｍＬ底物质量浓度范围内测定　酶的比酶活，结果见图７。由图７可知：在不同底物　下，该果胶裂解酶的酶促反应动力学均符合　生物加工过程　第１１卷　Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ．Ｍｅｎｔｅｎ动力学，因而经Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ．Ｂｕｒｋ双　倒数作图法计算酶动力学参数　和　值。当所　用底物为２０％酯化果胶时，酶的Ｋ　值为３．７７　ｍｇ／ｍＬ，酶促反应的　为８　５６０　Ｕ／ｍｇ，而底物变为　７０％酯化果胶时，酶的　值增加到４．１７　ｍｇ／ｍＬ，酶　促反应　。　则变为１０　８００　Ｕ／ｍｇ。该果胶裂解酶对　ＰＧＡ的Ｋ　值为３．３９　ｍｇ／ｍＬ，同时酶促反应　为　９　４００　Ｕ／ｍｇ。　Ｏ　暑　●　０　娌　鞋　丑　ｐ慷物）／（ｍｇ・ｍＬ　）　图７酶在不同底物浓度下的比酶活　Ｆｉｇ．７　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８　２．２．６　Ｎ一端序列结果　经测定得到该果胶裂解酶的Ｎ一端序列为　ＡＧＮＡＤＹＮＬＴＧＦＳＱＧＮ，通过Ｂｌａｓｔ序列比对发现，该　序列与来自类芽胞杆菌Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　２７ｃ６４果胶裂解酶ＰｅｌＢ的同源序列具有很高　的相似度（１４／１５的相似度）。与Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＷＺ００８果胶裂解酶类似，该类芽胞杆菌果胶裂解酶　也表现出对酯化果胶和聚半乳糖醛酸均有活力＿】　，　但其活力却远远低于本文所报道的果胶裂解酶。　另外，作为胞外酶，Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ＷＺ００８果胶裂解　酶的Ｎ一端序列以丙氨酸而不是以甲硫氨酸为起始　氨基酸，这也意味着该酶的信号肽在翻译后已被　切除。　３　结　论　通过（ＮＨ　）　ＳＯ　沉淀、羟基磷灰石柱层析及凝胶　过滤柱层析从类芽胞杆菌发酵液中纯化得到一个果　胶裂解酶。该酶底物谱广，以果胶酸、低酯果胶或高　酯果胶为裂解底物时该酶均表现出高活力。该酶最　适作用ｐＨ为９．６，属于碱性果胶裂解酶，在碱性条件　下具有良好的稳定性。最适作用温度范围为５５～　６０℃，在５Ｏ　ｃＩＣ下热稳定性较好。Ｃａ２　对酶的活力具　有显著促进作用。该酶Ｎ一端序列比对分析表明与　一个解淀粉类芽胞杆菌果胶酶高度同源，而其活力远　高于解淀粉类芽胞杆菌果胶酶，以高酯果胶为底物时　酶动力参数　可高达１０　８００　Ｕ／ｍｇ。　参考文献：　［１］Ｐａｙａｓｉ　Ａ，Ｓａｎｗａｌ　Ｒ，Ｓａｎｗａｌ　Ｇ　Ｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉｌａ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅｓ：　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，２５（１）：１—１４　［２］Ｋａｌａｎｔｚｉ　Ｓ，Ｍａｍｍａ　Ｄ，Ｃｈｒｉｓｔａｋｏｐｏｕｌｏｓ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｂｉｏｓｃｏｕｒｉｎｇ　ｏｎ　ｐｈｙｓｉｃａｌ，ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｌｏｗ－ｓｔｒｅｓｓ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｃｏｔｔｏｎ　ｆａｂｒｉｃｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，９９　（１７）：８１８５—８１９２．　［３］Ｔｚａｎｏｖ　Ｔ，Ｃａｌａｆｅｌｌ　Ｍ，Ｇｕｅｂｉｔｚ　Ｇ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｂｉｎ－ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｔｔｏｎ　ｆａｂｒｉｃｓ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，２９（６）：　３５７－３６２．　［４］Ｈｏｏｎｄａｌ　Ｇ　Ｓ，Ｔｉｗａｒｉ　Ｒ　Ｐ，Ｔｅｗａｒｉ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｌａ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｅｃｔｉｎａｓｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｉｎｄｕｓｔｉｒｌａ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｍｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｎｌ，２００２，５９（４／５）：４０９－４１８．　［５］　Ｅｓｑｕｅｒｒ６一Ｔｕｇａｙ６　Ｍ　Ｔ，Ｂｏｕｄａｒｔ　Ｇ，Ｄｕｍａｓ　Ｂ．Ｃｅｌｌ　ｗａｌｌ　ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅｓ，ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ　ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｐａｒｔｉｃｉｐ　ａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｉｌａｏｇｕｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］．Ｐｌｎａｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０００，３８（１／２）：１５７　１６３．　［６］李祖明，李鸿玉，白志辉，等．碱性果胶酶诱导黄瓜抗病机理　的初步研究［Ｊ］．植物保护，２００８，３４（５）：５２－５７．　［７］Ｈａｔａｄａ　Ｙ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｔ，ｈｏ　Ｓ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｌｙ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　ａｎｄ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　Ｐｅｌ４－Ｂ　ｆｒｏｍ　ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ　Ｐ－４－Ｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｎｔｉｒｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ，２００１，５（２）：１２７—１３３．　［８］吴茜，沈雪亮，汪钊．碱性果胶酶菌种选育及在纺织前处理中　的应用研究［Ｊ］．印染助剂，２００８，２５（２）：２５－２７．　［９］Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ　Ｐ．Ｐｅｃｔｉｎ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，　１９６６，８：６２８－６３１．　［１０］Ｃｏｌｌｍｅｒ　Ａ，Ｒｉｅｄ　Ｊ　Ｌ，Ｍｏｕｎｔ　Ｍ　Ｓ．Ａｓｓａｙ－ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｐｅｃｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９８８，１６１：３２９－３３５．　［１　１］　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　Ｍ　Ｍ．Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｇｒａｍ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ—ｄｙｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９７６，７２：２４８－２５４．　［１２］Ｙｕａｎ　Ｐ，Ｍｅｎｇ　Ｋ，Ｗａｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｌｏｗ—ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ—ａｃｔｉｖｅ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ＡＣＣＣ　１００４８　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｖｅｒ　ａ　ｗｉｄｅ　ｐＨ　Ｒａｎｇｅ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１２，１６８（６）：１４８９・１５００．　［１３］　Ｂｏｌａｎｄ　Ｗ　Ｅ，Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ　Ｅ　Ｄ，Ｄｏｒａｎ—Ｐｅｔｅｍｏｎ　Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｓｔｒａｉｎ　２７ｃ６４　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅｓ　ｗｉｔｈ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｎ　ｈｉｇｈｌｙ　ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ　ｐｅｃｔｉｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｎｌ，　２０１０，７６（１７）：６００６－６００９．　［１４］　陈丽娜，应向贤，薛群，等．细菌碱性果胶酶的酶学特性及其　应用研究［Ｊ］．中国生物工程杂志，２０１０，３０（４）：１２５．１３０．　［１５］Ｓｏｆｉａｎｏ　Ｍ，Ｂｌａｎｃｏ　Ａ，Ｄｉａｚ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ａｎ　ｕｎｕｓｕａｌ　ｐｅｃｔａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　ａ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｎ　ｐｅｃｔｉｎ：ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，１４６（ｐａｒｔ　１）：８９－９５．