Trizol法使用步伐之马矢奏春创作
创作时间：二零二一年六月三十日
一、分离纯化的基来源根基理
研究基因的表达和调控时经常要从组织和细胞中分离和纯化RNA.RNA质量的高低经常影响cDNA库,RTPCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败.Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶. 二、用户需自备的试剂和资料
无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNasefree）、 Tips（RNasefree） 三、准备工作
RNase酶非常稳定,是招致RNA降解最主要的物质.它在一些极真个条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性.用惯例的高温高压蒸气灭菌方法和卵白抑制剂都不能是RNase完全失活.它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必需戴手套.
RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处置.一般情况下采纳用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本到达要求.取RNasefree的物品时必需戴手套. 1、料制品的处置 尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNaseFree 的塑料制品,如没有开封使用过通常没有需要再次处置.对国产塑料制品,原则上都必需处置方可使用.处置步伐如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%.注意：DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用.
2）处置的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部份都浸泡到溶液中. 3）在通风柜中室温处置过夜.
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处置过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟. 5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥.置于干净处备用. 2、璃玻和金属物品
创作时间：二零二一年六月三十日
创作时间：二零二一年六月三十日
250°C烘烤3小时以上.
四、从组织中提取总RNA
1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50100mg组织/ml Trizol加入Trizol,转入离心管进行第2步把持.
2) 匀浆：组织样品按50100mg/mlTrizol 加入Trizol.另外,组织体积不能超越Trizol体积的10%,否则匀浆效果会欠好,用电动匀浆器充沛匀浆约需12分钟. 五、从细胞中提取总RNA
1) 培养贴壁细胞：不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm2/ml比例加入. 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解,每1ml Trizol可裂解5×106植物、植物或酵母细胞,或107细菌细胞. 六、把持步伐
1、细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充沛裂解.注：此时可放入70℃长期坚持. 2、12,000rpm 离心5min,弃沉淀.
3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min.注：禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂.
4、4℃12,000g离心15min.
5、吸取上层水相,至另一离心管中.注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和卵白质,则保管下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA,则弃下层酚相.
6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀,室温放置510min. 7、4℃12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底.
8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀. 9、4℃8,000g离心5min,尽量弃上清.
10、室温晾干或真空干燥510min.注：RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解.
11、可用50ul H2O,TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品,5560℃,510min.注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处置并高压.
12、测O.D值定量RNA浓度.注：此方法提取RNA A260/A280值在1.61.8之间；产率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）110ug,培养细胞（ug RNA/106 Cell）：515ug.
注：组织或细胞量过少,可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多,会引起DNA对RNA的污染；
高卵白、脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨后须4℃12,000g离心10min去失落不溶物,再进行下面把持,若顶层有脂肪物,则也须去失落； 热天提RNA,带手套是必需的,手是RNase的主要来源；
组织块用液氮研磨,效果最好,若没有液氮或电动匀浆器,可用手动匀浆器取代,此时组织块不宜过年夜,且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎,然后再充沛研磨.
6.1.2.1 肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法
①使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开,从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织,置于离心管后立即放入液氮中；
②组织在液氮下研磨成粉,取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中,充沛混合后于4℃,12,000rpm离心15min；
③取上清移至新1.5ml离心管中,加入200ul氯仿,剧烈震荡直至呈乳白色,于4℃,12,000rpm离心15min；
④取上清移至新1.5ml离心管中,加入500ul异丙醇,轻轻倒置10次,冰上放置20mins,于4℃,12,000rpm离心15min；
⑤弃上清,加入1ml75%乙醇（用DEPC水现配现用）,于4℃,12000rpm离心5min,重复此步伐一次；
创作时间：二零二一年六月三十日
创作时间：二零二一年六月三十日
⑥弃上清后,室温干燥57mins；
⑦加入适量（2030ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解,20℃（最好80℃）保管,检测RNA浓度,并电泳检测.
6.1.2.2 RNA浓度测定和电泳检测
取2ul提取好的RNA溶液,于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度,纯洁RNA的A260/A280应在1.82.2之间.
电泳检测：1%琼脂糖,1×ATE缓冲液,90V电泳30min,凝胶成像系统观察,分析结果.
6.1.2.3 肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成
反应依照TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time)反转录试剂盒说明书进行,合成cDNA模板.
①基因组DNA的除去反应,在PCR管中配置如下缓冲液.
试剂
5×gDNA Eraser Buffer gDNA Eraser Total RNA RNase Free dH2O
X*：根据检测到的RNA浓度来配置； 混合均匀后,室温放置2030min
②反转录反应,在PCR管中配置如下缓冲液（20ul system）,反应液配制在冰上进行.为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,先按反应数+1的量配制Master Mix ,然后再分装到每个反应管中.
试剂
5×PrimeScript® Buffer 2（for Real Time）
PrimeScript® RT Enzyme Mix I
RT Primer Mix
①的反应液 RNase Free dH2O
③混合均匀后,在PCR仪上进行逆转录反应,反应条件为：
37℃ 15 min 85℃ 5 sec
然后将获得的cDNA寄存于20℃冰箱保管待用. 创作时间：二零二一年六月三十日 使用量 4.0 ul 1.0 μl 1.0 μl 10.0 ul up to 20 μl
用量 2.0 μl 1.0 μl X* ul up to 10 μl
创作时间：二零二一年六月三十日
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