氮测定法原理

凯氏定氮法原理，方法步骤和计算方法（三少整理版）

三鹿奶粉事件让全国人民知道了三聚氰胺，食品中蛋白质含量的现行国家标准和国际通行测定方法是经典凯氏定氮法，三少 作为一名分析人员，现在将凯氏定氮法原理，方法步骤和计算方法写出来，看看凯氏定氮法在蛋白质含量中的缺陷。

何为凯氏定氮法？

简单地说，凯氏定氮法是一种检测物质中“氮的含量”的方法。蛋白质是一种含氮的有机化合物，食品中的蛋白质经硫酸和催化剂分解后，产生的氨能够与硫酸结合，生成硫酸氨，再经过碱化蒸馏后，氨即成为游离状态，游离氨经硼酸吸引，再以硫酸或盐酸的标准溶液进行滴定，根据酸的消耗量再乘以换算系数，就可以推算出食品中的蛋白含量。

一. [凯氏定氮法原理]

凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。

反应式如下：

1.有机物中的氮在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，消化生成（NH4）2SO4

反应式为： H2SO4==SO2+H2O+[O]

R. CH.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3

NH3

R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O

2NH3+H2SO4==(NH4)2SO4

2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中

反应式为： 2NH4++OH-==NH3+H2O

NH3+H3BO3==NH4++H2BO3-

3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

反应式为： H2BO3-+H+==H3BO3

蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量[约在14％~18％，平均为16％（质量分数）]。凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数6.25，即为蛋白质含量。

凯氏定氮装置图

1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子

6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管 10.蒸汽发生瓶

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二. [方法和步骤]

（一）消化

1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液1.0mL，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g，浓硫酸2.0mL，30%过氧化

氢1.0mL。4、5、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水1.0mL代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。

2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底部，以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。

（二）蒸馏和吸收

蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。

1、仪器的洗涤

仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台上。

仪器使用前，微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸气洗涤5min即可。较长时间未使用的仪器，重复蒸气洗涤，不得少于三次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。

首先在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许沸石（或毛细管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封，防止漏气。蒸气发生后，立即关闭废液排放管上

的开关，使蒸气只能进入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置一个锥形瓶接收冷凝水。从定氮球发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移开煤气灯。冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打开废液排出口夹子放出废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下换放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口完全浸没在溶液中，蒸馏1～2min，观察锥形瓶内的溶液是否变色。如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去锥形瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测样品使用。

2、无机氮标准样品的蒸馏吸收

由于定氮操作繁琐，为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术，初学者宜先用无机氮标准样品进行反复练习，再进行有机氮未知样品的测定。常用巳知浓度的标准硫酸铵测试三次。

取洁净的100mL锥形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基蓝-甲基红混合指示剂（呈紫红色）3～4滴，盖好瓶口待用。取其中一只锥形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸没在溶液中。注意：在此操作之前必须先打开收集器活塞，以免锥形瓶内液体倒吸。准确吸取2mL硫酸铵标准液加到玻杯中，小心提起棒状玻塞使硫酸铵溶液慢慢流入蒸馏瓶中，用少量蒸馏水冲洗小玻杯3次，一并放人蒸馏瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30％NaOH溶液，使碱液慢慢流入蒸馏瓶中，在碱液尚未完全流入时，将棒状玻塞盖紧。向小玻杯中加约5mL蒸馏水，再慢慢打开玻塞，使一半水流入蒸馏瓶，一半留在小玻杯中作水封。关闭收集器活塞，加热蒸气发生器，进行蒸馏。锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由于吸收了氨，由紫红色变成绿色。自变色时起，再蒸馏3～5min，移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝管下口约lcm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，再继续蒸馏1min，移开锥形瓶，盖好，准备滴定。

在一次蒸馏完毕后，移去煤气灯，夹紧蒸气发生器与收集器间的橡胶管，排除反应完毕的废液，用水冲洗小玻杯几次，并将废液排除。如此反复冲洗干净后，即可进行下一个样品的蒸馏。按以上方法用标准硫酸铵再做两次。另取2mL蒸馏水代替标准硫酸铵进行空白测定二次。将各次蒸馏的锥形瓶一起滴定。

3、未知样品及空白的蒸馏吸收

将消化好的蛋白样品三支，空白对照液三支，依次作蒸馏吸收。

加5mL热的蒸馏水至消化好的样品或空白对照液中，通过小玻杯加到反应室中，再用热蒸馏水洗涤小玻杯3次，每次用水量约3mL，洗涤液一并倒入反应室内。其余操作按标准硫酸铵的蒸馏进行。

由于消化液内硫酸钾浓度高而呈粘稠状，不易从凯氏烧瓶内倒出，必须加入热蒸馏水5 mL稀释之，如果有结晶析出，必须微热溶解，趁热加入玻杯，使其流入反应室。此外，还应当注意趁仪器洗涤尚未完全冷却时立即加入样品或空白对照液，否则消化液通过冷却的管道容易析出结晶，造成堵塞。

（三）滴定

样品和空白蒸馏完毕后，一起进行滴定。

打开接受瓶盖，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的标准盐酸溶液进行滴定。待滴至瓶内溶液呈暗灰色时，用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗一次。若振摇后复现绿色，应再小心滴入标准盐酸溶液半滴，振摇观察瓶内溶液颜色变化，暗灰色在一二分钟内不变，当视为到达滴定终点。若呈粉红色，表明已超越滴定终点，可在已滴定耗用的标准盐酸溶液用量中减去0.02mL，每组样品的定氮终点颜色必须完全一致。空白对照液接受瓶内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以不滴定。记录每次滴定耗用标准盐酸溶液毫升数，供计算用。

三. [结果与计算]

运算下列公式计算出每次无机氮标准样品和未知样品的总含氮量。

式中

WN——每毫升样品的含氮毫克数；

A——滴定样品消耗的盐酸量（mL）；

B——滴定空白消耗的盐酸量（mL）；

C——测定样品所取用量（mL）；

0.0100——标准盐酸物质的量浓度（mol/L）；

14.008——每摩尔氮原子质量（g/mol）。

三次样品测定的含氮量相对误差应小于±2%。

样品粗蛋白含量＝总氮量× 6.25

6.25为含氮量换算为蛋白质含量的系数。.这个系数来自蛋白质平均含氮量为16％，实际上各种蛋白质因氨基酸组成不同，含氮量不完全相同。乳类为6.38，大米为5.95，花生为5.46等

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凯氏定氮法的缺陷：

从凯氏定氮原理可以知道：凯氏定氮法是将含氮有机物转变为无机氮硫酸铵来进行检测，以得到含氮量的测定值乘以一定系数得出蛋白质含量。而含氮有机物不仅仅是蛋白质，还有三聚氰胺 等等。在加上食

品中蛋白质含量的现行国家标准和国际通行测定方法是经典凯氏定氮法，这就为造假者提供了可乘之机。

蛋白质中的含氮量不超过30％，三聚氰胺的最大的特点是含氮量很高（66％），溶于水后无色无味，也就是说在一杯清水中加入三聚氰胺，然后用凯氏定氮法检测，结果显示是含有蛋白质的。由于“凯氏定氮法”只能测出含氮量,并不能鉴定饲料中有无违规化学物质,所以,添加三聚氰胺的奶粉理论上可以测出较高的蛋白质含量。

比较:

半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量的方法原理

方法原理

样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。

比较:

土壤全氮测定法

1、测定原理

样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机化合物，经过复杂的高温分解反应，转化为铵态氮。碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，求出土壤全氮含量（不包括全部硝态氮）。

包括硝态和亚硝态氮的全氮测定，在样品消煮前，需先用高锰酸钾将样品中的亚硝态氮氧化为硝态氮

后，再用还原铁粉使全部硝态氮还原，转化成铵态氮。

2、仪器、设备

2.1 土壤样品粉碎机；

2.2 玛瑙研钵；

2.3 土壤筛：孔径1.0mm（18目）；0.25mm（60目）；

2.4 分析天平：感量为0.0001g；

2.5 硬质开氏烧瓶：容积50ml，100ml；

2.6 半微量定氮蒸馏装置；

2.7 半微量滴定管：容积10ml，25ml；

2.8 锥形瓶：容积150ml；

2.9 电炉：300W变温电炉。

3、试剂

3.1 硫酸（GB 625—77）：化学纯；

3.2 硫酸（GB 625—77）或盐酸（GB 622—77）：分析纯，0.005mol/L硫酸或0.01mol/L盐酸标准

溶液；

3.3 氢氧化钠（GB 629—81）：工业用或化学纯，10mol/L氢氧化钠溶液；

3.4 硼酸-指示剂混合液；

3.4.1 硼酸（GB 628—78）：分析纯，2％溶液（W/V）；

3.4.2 混合指示剂：0.5g溴甲酚绿（HG3—1220—79）和0.1g甲基红（HG3—958 —76）于玛瑙研钵中，加入少量95％乙醇，研磨至指示剂全部溶解后，加95％乙醇至 100ml。使用前，每升硼酸溶液中加20ml混合指示剂，并用稀碱调节至红紫色（pH值约4.5）。此液放置时间不宜过长，如在使用过程中pH值有变化，需随时用稀酸或稀碱调节之。

3.5 加速剂：100g硫酸钾（HG 3—920—76，化学纯），10g五水合硫酸铜（GB 665 —78，化学纯），1g硒粉（HG3—926—76）于研钵中研细，必须充分混合均匀。

3.6 高锰酸钾溶液：25g高锰酸钾（GB 643—77）溶于500ml无离子水，贮于棕色瓶中；

3.7 1∶1 硫酸；

3.8 还原铁粉：磨细通过孔径0.15mm（100目）筛；

3.9 辛醇。

4、土壤样品的制备

将通过孔径1mm（18目）筛的土样，在牛皮纸上铺成薄层，划分成多个小方格。用小勺于每个方格

中，取等量的土样（总量不得少于20g）于玛瑙研钵中研磨，使之全部通过0.25mm筛。混合均匀后备用。

5、测定步骤

5.1 称取风干土样（通过0.25mm筛）1.0×××g（含氮约1mg），同时测定土样水分含量。

5.2 土样消煮

5.2.1 不包括硝态和亚硝态氮的消煮：将土样送入干燥的开氏瓶底部，加少量无离子水（约0.5～1ml）湿润土样后，加入2g加速剂和5ml浓硫酸，摇匀。将开氏瓶倾斜置于300W变温电炉上，用小火加热，待瓶内反应缓和时（约10～15min），加强火力使消煮的土液保持微沸，加热的部位不超过瓶中的液面，以防瓶壁温度过高而使铵盐受热分解，导致氮素损失。消煮的温度以硫酸蒸气在瓶颈上部1/3处冷凝回流为宜。待消煮液和土粒全部变为灰白稍带绿色后，再继续消煮1h。消煮完毕，冷却，待蒸馏。在消煮土样的同时，做两份空白测定，除不加土样外，其他操作皆与测定土样时相同。

5.2.2 包括硝态和亚硝态氮的消煮：将土样送入干燥的50ml开氏瓶底部，加1ml高锰酸钾溶液，摇动开氏瓶，缓缓加入2ml 1∶1硫酸，不断转动开氏瓶，然后放置5min，再加入1滴辛醇。通过长颈漏斗将0.5g（±0.01g）还原铁粉送入开氏瓶底部，瓶口盖上小漏斗，转动开氏瓶，使铁粉与酸接触，待剧烈反应停止时（约5min），将开氏瓶置于电炉上缓缓加热45min（瓶内土液应保持微沸，以不引起大量水分丢失为宜）。停火，待开氏瓶冷却后，通过长颈漏斗加2g加速剂和5ml浓硫酸，摇匀。按5.2.1的步骤，消煮至土液全部变为黄绿色，再继续消煮1h。消煮完毕，冷却，待蒸馏。在消煮土样的同时，做两份空白测定。

5.3 氨的蒸馏

5.3.1 蒸馏前先检查蒸馏装置是否漏气，并通过水的馏出液将管道洗净。

5.3.2 待消煮液冷却后，用少量无离子水将消煮液定量地全部转入蒸馏器内，并用水洗涤开氏瓶4～5次（总用水量不超过30～35ml）。

于150ml锥形瓶中，加入5ml2％硼酸-指示剂混合液，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上3～4cm处。然后向蒸馏室内缓缓加入20ml10mol/L氢氧化钠溶液，通入蒸汽蒸馏，待馏出液体积约50ml时，即蒸馏完毕。用少量已调节至pH4.5的水洗涤冷凝管的末端。

5.3.3 用0.005mol/L硫酸（或0.01mol/L盐酸）标准溶液滴定馏出液由蓝绿色至刚变为红紫色。记录所用酸标准溶液的体积（ml）。空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4ml。

6、测定结果的计算

6.1 计算公式

土壤全氮（％）＝〔（V－V0）×CH×0.014/m〕×100

式中：V── 滴定试液时所用酸标准溶液的体积，ml；

V0── 滴定空白时所用酸标准溶液的体积，ml；

CH── 酸标准溶液的浓度，mol/L； 0.014── 氮原子的毫摩质量；

m── 烘干土样质量，g。

6.2 平行测定结果，用算术平均值表示，保留小数点后三位。

6.3 平行测定结果的相差：土壤含氮量大于0.1％时，不得超过0.005％；含氮 0.1～0.06％时，不得

超过0.004％；含氮小于0.06％时，不得超过0.003％。

总氮量的测定——凯氏定氮法

[原理]

凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变成无机氮，再进行测定。

凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。

以蛋白质为例，反应式如下：

消化：蛋白质 + H2SO4→（NH4）2SO4

+ SO2↑+ CO2 ↑+ H2O

蒸馏：（NH4）2SO4 + 2NaOH→ Na2SO4

+ 2 H2O + 2NH3 ↑

2NH3 + 4H3BO3→（NH4）2B4O7

+ 5H2O

滴定：（NH4）2B4O7

+ 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4 H3BO3

蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量[约在14％~18％，平均为16％（质量分数）]。凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数6.25，即为蛋白质含量。

本法适用于测定0.2～1.0mg氮的样品测定。

通过本实验使学生能理解凯氏定氮法的原理，掌握凯氏定氮法的操作方法。

[方法和步骤]

（一）消化

1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液1.0mL，样品要加到烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g，浓硫酸2.0mL，30%过氧化氢1.0mL。4、5、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定进行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水1.0mL代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。

2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。先用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务必注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底部，以保证样品完全消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中进行。消化完全后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。

（二）蒸馏和吸收

蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内进行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三部分组成。

1、仪器的洗涤

仪器安装前，各部件需经一般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在一只铁架台上。

仪器使用前，微量全部管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸气洗涤5min即可。较长时间未使用的仪器，重复蒸气洗涤，不得少于三次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。

首先在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许沸石（或毛细管等），以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封，防止漏气。蒸气发生后，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸气只能进入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置一个锥形瓶接收冷凝水。从定氮球发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移

开煤气灯。冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打开废液排出口夹子放出废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下换放一个盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口完全浸没在溶液中，蒸馏1～2min，观察锥形瓶内的溶液是否变色。如不变色，表示蒸馏装置内部已洗干净。移去锥形瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测样品使用。

2、无机氮标准样品的蒸馏吸收

由于定氮操作繁琐，为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术，初学者宜先用无机氮标准样品进行反复练习，再进行有机氮未知样品的测定。常用巳知浓度的标准硫酸铵测试三次。

取洁净的100mL锥形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基蓝-甲基红混合指示剂（呈紫红色）3～4滴，盖好瓶口待用。取其中一只锥形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸没在溶液中。注意：在此操作之前必须先打开收集器活塞，以免锥形瓶内液体倒吸。准确吸取2mL硫酸铵标准液加到玻杯中，小心提起棒状玻塞使硫酸铵溶液慢慢流入蒸馏瓶中，用少量蒸馏水冲洗小玻杯3次，一并放人蒸馏瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30％NaOH溶液，使碱液慢慢流入蒸馏瓶中，在碱液尚未完全流入时，将棒状玻塞盖紧。向小玻杯中加约5mL蒸馏水，再慢慢打开玻塞，使一半水流入蒸馏瓶，一半留在小玻杯中作水封。关闭收集器活塞，加热蒸气发生器，进行蒸馏。锥形瓶中的硼酸-指示剂混合液由于吸收了氨，由紫红色变成绿色。自变色时起，再蒸馏3～5min，移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝管下口约lcm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，再继续蒸馏1min，移开锥形瓶，盖好，准备滴定。

在一次蒸馏完毕后，移去煤气灯，夹紧蒸气发生器与收集器间的橡胶管，排除反应完毕的废液，用水冲洗小玻杯几次，并将废液排除。如此反复冲洗干净后，即可进行下一个样品的蒸馏。按以上方法用标准硫酸铵再做两次。另取2mL蒸馏水代替标准硫酸铵进行空白测定二次。将各次蒸馏的锥形瓶一起滴定。

3、未知样品及空白的蒸馏吸收

将消化好的蛋白样品三支，空白对照液三支，依次作蒸馏吸收。

加5mL热的蒸馏水至消化好的样品或空白对照液中，通过小玻杯加到反应室中，再用热蒸馏水洗涤小玻杯3次，每次用水量约3mL，洗涤液一并倒入反应室内。其余操作按标准硫酸铵的蒸馏进行。

由于消化液内硫酸钾浓度高而呈粘稠状，不易从凯氏烧瓶内倒出，必须加入热蒸馏水5 mL稀释之，如果有结晶析出，必须微热溶解，趁热加入玻杯，使其流入反应室。此外，还应当注意趁仪器洗涤尚未完全冷却时立即加入样品或空白对照液，否则消化液通过冷却的管道容易析出结晶，造成堵塞。

（三）滴定

样品和空白蒸馏完毕后，一起进行滴定。

打开接受瓶盖，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的标准盐酸溶液进行滴定。待滴至瓶内溶液呈暗灰色时，用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗一次。若振摇后复现绿色，应再小心滴入标准盐酸溶液半滴，振摇观察瓶内溶液颜色变化，暗灰色在一二分钟内不变，当视为到达滴定终点。若呈粉红色，表明已超越滴定终点，可在已滴定耗用的标准盐酸溶液用量中减去0.02mL，每组样品的定氮终点颜色必须完全一致。空白对照液接受瓶内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以不滴定。记录每次滴定耗用标准盐酸溶液毫升数，供计算用。

[结果与计算]

运算下列公式计算出每次无机氮标准样品和未知样品的总含氮量。

式中

WN——每毫升样品的含氮毫克数；

A——滴定样品消耗的盐酸量（mL）；

B——滴定空白消耗的盐酸量（mL）；

C——测定样品所取用量（mL）；

0.0100——标准盐酸物质的量浓度（mol/L）；

14.008——每摩尔氮原子质量（g/mol）。

三次样品测定的含氮量相对误差应小于±2%。

样品粗蛋白含量＝总氮量× 6.25

6.25为含氮量换算为蛋白质含量的系数。.这个系数来自蛋白质平均含氮量为16％，实际上各种蛋白质因氨基酸组成不同，含氮量不完全相同。