利用Fusarium poae制备T-2毒素的培养条件和提取方法

４ｏ　微生物学杂志　２０１１年９月第３１卷第５期ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ　Ｓｅｐｔ．２０１１　Ｖｏ１．３１　Ｎｏ．５　利用Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｐｏａｅ制备Ｔ－２毒素的　培养条件和提取方法　代　坊　，王雅玲¨，孙力军　，施　琦　，徐德峰　，王远征　，胡红林　，欧阳毅　，吕国忠。　（１．广东海洋大学食品科技学院，广东湛江５２４０１３；２．大连民族学院环境与资源学院，辽宁大连１１６６００）　摘　要　比较２种不同优化方法对分离纯化梨孢镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｐｏａｅ）产生的Ｔ一２毒素的效果，并得到高纯　度的Ｔ．２毒素，解决国内Ｔ－２毒素产业化问题。在优化Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｐｏａｅ产毒培养条件的基础上，对Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ的　提取方法和Ｇｒｅｇｏｒｙ培养基进一步优化以最大限度地提高Ｔ一２毒素的产率，从而得到高纯度并且高产率的Ｔ－２　毒素。目标菌株最适产毒培养基成分：ＮＨ　Ｈ２ＰＯ　ｌ　ｇ，ＫＣ１　０．２　ｇ，ＭｇＳＯ　・７Ｈ：Ｏ　０．２　ｇ，葡萄糖１０　ｇ，酵母膏５　ｇ，ＣｕＳＯ　・５Ｈ２Ｏ　０．００５　ｇ，ＺｎＳＯ　・７Ｈ２Ｏ　０．Ｏ１　ｇ，Ｈ２Ｏ　１　０００　ｍＬ。最佳产毒培养条件为８—２５℃间隔１２　ｈ变温、　前期光照后期黑暗、前期振荡后期静止的培养条件下培养２８　ｄ。在这种条件下可提高Ｔ－２毒素的产率达５倍。　用丙酮氯仿进行分离，免疫亲和拄进行纯化得到高纯的Ｔ一２毒素。优化后的Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ提取方法提高了Ｔ一２　毒素的产率。　关键词Ｔ－２毒素；镰孢茵；产毒培养　Ｑ９３—３３　文献标识码Ａ　文章编号１００５—７０２ｌ（２ｏｉＩ）０５—００４０—０５　中图分类号Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　Ｐｒｅｐａｒｅ　Ｔ－２　Ｔｏｘｉｎ　Ｕｓｉｎｇ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｐｏａｅ　ＤＡＩ　Ｚｈｅ　，ＷＡＮＧ　Ｙａ—ｌｉｎｇ　，ＳＵＮ　Ｌｉ－ｊｕｎ　，ＳＨＩ　Ｑｉ　，ＸＵ　Ｄｅ—ｆｅｎｇ　，　ＷＡＮＧ　Ｙｕａｎ—ｚｈｅｎｇ　，ＨＵ　Ｈｏｎｇ—ｌｉｎ　，ＯＵ—ＹＡＮＧ　Ｙｉ　，ＬＶ　Ｇｕｏ—ｚｈｏｎｇ　（１．Ｃｏｌ１．ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｔｅｃｈｎｏ１．，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｏｃ．Ｕｎｉ．，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ　５２４０１３；　２．Ｓｃｈ．ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎ．＆Ｒ∞．，Ｄａｌｌａｎ　Ｍｉｎｇｕ　Ｃｏｌ１．．Ｄａｌｌａｎ　１　１６６ｏ０）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｔｏ　ｉｓｏｌａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙ　Ｔ一２　ｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｐｏａｅ（ＦＰ）ｗｉｔｈ　ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　Ｔ－２　ｔｏｘｉｎ　ｔｏ　ｓｏｌｖｅ　ｉｔｓ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｐｒｏｂｌｅｍ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ．　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ＦＰ，Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｒｅｇｏｒｙ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｏｐｔｉ—　ｍｉｚｅｄ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｔ一２　ｔｏｘｉｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｔｈｅｒｅｂｙ　ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｐｒｏｄｕｃ－・　ｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｔ一２　ｔｏｘｉｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４　１　ｇ，ＫＣ１　０．２　ｇ，ＭｇＳＯ４。７Ｈ２Ｏ　０．２　ｇ，ｇｌｕｃｏｓｅ　１０　ｇ，ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　５　ｇ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　０．００５　ｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．Ｏ１　ｇ，Ｈ２Ｏ　１　０００　ｍＬ．Ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｐｒｏｄｕｃｅ　ｔｏｘｉｎ　ｗａｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２８　ｄａｙｓ　ａｔ　ｉｎｔｅｒｖａｌ　８～２５℃ｏｆ　ｐｏｉｋｉｌｏｔｈｅｒｍｉａ　ｆｏｒ　１２　ｈｏｕｒｓ　ｕｎｄｅｒ　ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎ，ｔ　ｓｈａｋｉｎｇ　ａｔ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅ．ｔｈｅｎ　ｓｈａｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｕｈｕ—　，ｒｉｎｇ　ａｔ　ｒｅｓｔ　ａｔ　ｌａｔｅｒ　ｓｔａｇｅ，ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ一２　ｔｏｘｉｎ　ｒｅａｃｈｅｄ　ｔｏ　ｍａｘｉｍａｌ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　５　ｍｇ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｆｉｖｅ　ｔｉｍｅｓ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　ｂｅｆｏｒｅ．Ａｆｔｅｒ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ａｃｅｔｏｎｅ—ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｉｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｅ　ａｆｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｏｌｕｍｎ，ａｎｄ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ　Ｔ－２　ｔｏｘｉｎ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｔ一２　ｔｏｘｉｎ　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｔ－２　ｔｏｘｉｎ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐ．；ｔｏｘｉｎ　ｃｕｈｉｖａｔｉｏｎ　基金项目：国家自然科学基金（３１１７１６３４）；湛江市财政科技专项竞争性项目（２０１１１）０２）　作者简介：代酷女，硕士研究生。研究方向为真菌毒素与水产品质量与安全。Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｙ—ｇｏｏｄ＠１２６．ｃｏｍ　十通讯作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｙｌｃｈｉｎａ＠１６３．ｃｏｒｎ　收稿Ｅｔ期：２０１１－０９—１９；修回日期：２０１１－０９－２０　５期　代拮等：利用Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｐｏａｅ制备Ｔ一２毒素的培养条件和提取方法　４ｌ　Ｔ．２毒素是由拟枝孢镰孢菌、梨孢镰孢菌和　的，并且对Ｔ－２毒素的产业化发展也具有重大意　义。本研究采用不同产毒条件，利用不同的提取　三线镰孢菌等真菌产生的一种高毒性的Ａ型单　端孢霉烯族化合物（学名为４１３－１，５－二乙酰氧基－　８ａ－｛３．甲基丁酰氧基｝－３　一羰基一１２，１３一环氧单端　孢霉　．烯，分子式为Ｃ：　Ｈ，　Ｏ　）（图１）。Ｔ－２毒素　方法，并得到高纯的Ｔ．２毒素。　属于自然发生的毒性强烈的生物毒素…，广泛存　在于自然界中，是评价粮谷及环境中真菌毒素污　０ＣＯＣ心ＣＨ（　染的重要指标之一。Ｔ一２毒素性质稳定，一般的　实物烹调加热方法不能破坏其结构，在室温下放　置６—７　ａ或加热至２００　ｃ【＝１～２　ｈ毒力仍不减弱，　而在碱性条件下次氯酸钠可使之失去毒性，其氧　环和双键被认为是活性单位　。Ｔ－２毒素结构复　杂难以人工合成而导致价格昂贵，因此，利用生物　学方法获得高纯度的Ｔ－２毒素具有重要的经济学　意义，同时还可缓解我国Ｔ－２毒素标准品完全依　赖进口的现状。不同的菌种培养方法所产生的菌　种产毒能力不同，而且在不同的培养条件下，菌种　所产生的毒素量是不一样的。为了采用最简便的　方法得到最高量的Ｔ一２毒素，很多学者都尝试了　不同的培养方法，如Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ…和Ｗｙａｔｔ等　报　道的方法中，先将产毒三线镰孢菌接种在酵母一麦　芽汁琼脂培养基上，于２５　ｃＩ＝培养１４　ｄ后，用灭菌　蒸馏水制成浓厚的孢子悬液。然后，将此孢子悬　液吸取２　ｍＬ接种于３００　ｇ灭菌的白玉米渣中，再　加入１００　ｍＬ灭菌蒸馏水充分混匀，予ｌ５℃培养　３周，亦可获得丰富产量的Ｔ－２毒素（１．４４　ｇ／１．２　ｋｇ）；按照Ｂａｍｂｕｒｇ等　刮的方法，将产毒三线镰　孢菌接种于Ｇｒｅｇｏｒｙ氏培养基中　（黄豆粉２０　ｇ，　葡萄糖２０　ｇ，ＣａＣＯ３　５　ｇ，玉米浆５　ｇ，蒸馏水１　０００　ｍＥ），于８℃培养３０　ｄ，即可获得高产量的Ｔ－２毒　素。王雅玲　对　ｐｏａｅ菌株的生长条件进行了　研究，制定了Ｆ．ｐｏａｅ菌株大量繁殖的可行性方　案，建立了每隔１２　ｈ应激培养，反复若干周的变　温变光培养模式。若将Ｔ－２毒素进行产业化生　产，还需将Ｔ－２毒素分离纯化。Ｔ－２毒素常用丙酮　与水（８４：１６，体积比）　，丙酮与甲醇（８５：１５，　体积比）　，丙酮与氯仿　们进行提取，还有研究　人员用乙酸乙酯¨　进行溶解分离，然后用硅胶　柱¨’川或者是免疫亲和柱ｎ　进行浓缩纯化。　但是不同的极性有机溶剂对Ｔ－２毒素的溶解效果　不同，并且溶解不完全，需要反复多次进行分离浓　缩。探索出镰孢菌高效的产毒方法是非常必要　图１　Ｔ－２毒素结构式　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｔ－２　ｔｏｘｉｎ　１　材料与方法　１．１　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｐｏａｅ的产毒培养　将高产Ｔ－２毒素Ｆ．ｐｏａｅ菌株接种在琼脂糖　ＰＳＡ平板培养基上，光照培养１周，菌落生长相对　饱和时，将菌落分成小块连同培养基接种到装有　Ｆ．ｐｏａｅ菌株ＧＹＭ液体培养基（ＮＨ。Ｈ：ＰＯ　１　ｇ，　ＫＣ１　０．２　ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．２　ｇ，葡萄糖１０　ｇ，酵　母膏５　ｇ，ＣｕＳＯ　・５Ｈ　Ｏ　０．００５　ｇ，蒸馏水１　０００　ｍＬ，ＺｎＳＯ　・７Ｈ２Ｏ　０．０１　ｇ）和优化的Ｇｒｅｇｏｒｙ培养　基（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４　１　ｇ，ＫＣ１　０．２　ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．２　ｇ，葡萄糖１０　ｇ，酵母膏５　ｇ，０．００５　ｇ／Ｌ　ＣｕＳＯ　・　５Ｈ２Ｏ　１　ｍＬ，０．０１　ｇ／Ｌ　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　１　ｍＬ，蒸馏水　１　０００　ｍＬ）上。本实验采用２种不同的条件来进　行产毒培养（表１）。　表１产毒培养条件　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｏｘｉｎ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　１．２　方法　１．２．１　Ｔ－２毒素的２种提取方法条件一得到　的样品采用丙酮法处理，条件二得到的样品采用　乙酸乙酯法处理。①丙酮法：采用旋转蒸发仪浓　缩悬浮液，用氯仿丙酮混合液（８５：１５）洗涤３　４２　微生物学杂志　次，加２倍体积丙酮到浓缩液，沉淀出胶粘状物　的氯仿．丙酮，用旋转蒸发仪提取再过滤，并将氯　仿一丙酮回收，可仅需要１．５　Ｌ的氯仿一丙酮。　乙酸乙酯法中培养物提取液（含大量Ｔ－２毒　质，将此物质滴加到己烷内，将１５％体积的丙酮　倾人己烷混合液内，混匀后将已烷丙酮混合液倾　出，反复滗析３次。将提取液浓缩，加入１．２　ｇ的　活性炭，摇匀，过滤，用１０　ｍＬ丙酮洗涤５次，当丙　酮浓缩到１５　ｍＬ时再过滤１次，除尽多余碳末。　素）的浓缩过程较为烦琐，需要根据不同浓度的　富集液调整相应的真空度和温度。　２．３影响提取速度的因素　将己烷滴加到溶液内，直到有轻度浑浊，再滴加几　滴甲苯使溶液澄清。室内放置１８　ｈ，８０　ｃ【＝干燥，　２．３．１　温度　在一定的时间内，吸光度值与Ｔ一２　毒素的含量成正比，即吸光度值越大，提取速度越　可得到结晶；②乙酸乙酯法：用乙酸乙酯溶解经旋　转蒸发所得油状物，用０．５％的Ｈ　ＳＯ　进行广谱　除杂。将上层溶液（乙酸乙酯层）蒸发浓缩，将浓　缩物用４：１的甲醇一水溶解，用正己烷（上层）萃　取除杂，用氯仿一乙酸乙酯提取，蒸发后得到粗制　Ｔ。２毒素。用硅胶柱氯仿一丙酮洗脱，苯一己烷重结　晶２次，再经免疫亲和柱层析，得到高纯Ｔ－２　毒素。　１．２．２影响提取速度的因素　①温度对提取速　度的影响：分别在０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、　９０、１００℃下，对相同的样品，采用相同的条件进　行提取，然后用分光光度计测定其吸光值；②有机　溶剂浓度对提取速度的影响：丙酮在氯仿一丙酮混　合液中的百分比分别为０、０．１、０．２、０．３、０．４、　０．５、０．６、０．７、０，８、０．９、１．０的条件下，对条件相　同的样品进行Ｔ　２毒素的提取，然后分别测定吸　光度值，确定其对提取速度的影响；③蒸气压对提　取速度的影响：分别采用０、１００、２００、３００、４００、　５００、６００、７００、８００、９００、１　０００　Ｐａ的蒸气压对相同　样品进行提取，一定时间后测定其分光光度值。　２结果与分析　２．１产毒菌株的培养条件　条件一中菌株接种到ＧＹＭ培养基后经４周　的变温变光培养，得到大量菌丝悬浊液。条件二　中菌株生长期间，菌株量差异大，３０　ｄ后，观察各　培养瓶中的菌株生长情况发现各瓶中菌株量基本　一致。　２．２提取　丙酮法中试验测得，油状物体积６０　ｍＬ，浓缩　至１５　ｍＬ加己烷甲苯放置１８　ｈ，加热使部分蒸发　得小颗粒结晶。用丙酮洗绦残渣，得到大量的　结晶。　提取时，若按Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ的方法将需要大量　大。由图２可知，温度与吸光度值成正比，即温度　与提取速度成正比。４０℃之前，提取速度的增幅　较小，４０～８０℃提取速度随温度的升高而骤增，　之后变化又呈缓慢状态。　Ｏ　８　能　螫　８　ｃ　图２提取过程中温度和提取速度的关系　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｐｅｅｄ　２．３．２有机溶剂　０　０．２　０．４　０．６　０．８　１．０　１．２　丙酮占有机溶剂百分比　图３提取过程中有机溶剂量和提取速度的关系　Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｔ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｐｅｅｄ　由图３可知，Ｔ　２毒素的提取速度与丙酮占　有机溶剂的百分比的影响关系不太明显，但总趋　０　７　Ｏ　６　Ｏ　５　５期　代拮等：利用Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｐｏａｅ制备Ｔ－２毒素的培养条件和提取方法　４３　势还是呈现下降状态，即丙酮在有机溶剂中所占　和压强的条件。用丙酮溶解残渣得到的结晶，远　多于己烷中的丙酮所溶解的，可能是培养的菌丝　中含有的化学物质与Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ所用的菌丝不　的百分比越高，则越不利于Ｔ．２毒素的提取。　２．３．３蒸汽压　由图４可知，Ｔ－２毒素的提取速　度随蒸汽压的增大而降低。因此，需要较大的蒸　同，或加热后的结晶溶有杂质，溶解条件使晶体结　气压以提高提取速度。　迥　世　蒸汽压／ｋＰａ　图４提取过程中蒸气压和提取速度的关系　Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｖａｐｏｕｒ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｐｅｅｄ　３　讨　论　丙酮法的优化及存在的问题：丙酮法中菌丝　多粘于壁上，因此Ｔ一２毒素也会粘于壁上，为了得　到毒素，多次用氯仿一丙酮混合液（８５：１５）洗涤，　洗涤液可再用于洗涤蒸发水分后的菌丝，合并洗　涤液浓缩，可大量减少氯仿一丙酮的用量。Ｂｕｒ．　ｍｅｉｓｔｅｒ的方法所获得的油状物少，而且得到的毒　素量远小于改进后所得的毒素。胶粘状物质滴加　到己烷中，沉于瓶底，互相黏着，贴于壁上，需要不　停地搅拌，让毒素充分溶解于己烷中的丙酮。己　烷丙酮甲苯溶液静置１８　ｈ后，需要加热，才可得　到结晶。毒素溶液蒸发时，挥发出的溶剂有毒，而　在旋转蒸发仪内蒸发会因容积太大使毒素损失，　可以放在通风橱内蒸发，减少毒素损失。用红外　光谱仪检测，对样品做色谱图分析可确定样品含　有Ｔ一２毒素。得到Ｔ一２毒素结晶５　ｇ，远多于Ｂｕｒ—　ｍｅｉｓｔｅｒ方法所得到的１　ｇ左右　。　菌株在培养过程中，条件简单，方法容易控　制，为大规模连续培养及产业化提供了可能。在　蒸发和提取过程中，菌株的浓度对效率的影响不　大，可利用尽可能多的菌株或分离物提取，并且溶　剂可回收连续利用。所以可以考虑以旋转蒸发仪　为模型，开发大量连续提取方法。但需探讨温度　构发生改变，所以溶解条件需探讨。　乙酸乙酯法的优化及存在的问题：乙酸乙酯　法中经优化的Ｇｒｅｇｏｒｙ氏培养基是液体培养基，　为了菌株的快速繁殖，保持整个过程中的营养分　布均匀很重要。通过观察菌株的生长情况发现，　起始生长阶段不同培养瓶的菌株量差距大，可能　是接种菌量不同造成。但３０　ｄ后，各培养瓶菌株　量相差无几，造成此结果的原因可能是菌种的衰　亡速度不同。　Ｔ－２毒素的纯化：硅胶柱层析洗脱液经苯．己　烷重结晶２次后最主要的问题是注意不能使结晶　温度太高，因为超过１２０℃，Ｔ一２毒素很容易分　解，且很可能导致其他杂质的干扰作用加重，从而　给纯化Ｔ－２毒素带来很不利的影响。　经过对比分析，得知２种方法均在前人研究　基础上对培养基进行了优化，并且Ｔ－２毒素的得　率高，尤其是方法一中的得率是Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ的５　倍。经过免疫亲和柱层析后，进行了红外光谱和　核磁共振的检测（另外报道），结果表明所得物质　是Ｔ一２毒素。这对今后国内Ｔ－２毒素的产业化发　展具有重要的意义。　参考文献：　［１］Ｓｉ・ｙｕａｎ　Ｌ．Ｉ，Ｊｕｎ—ｌｉｎｇ　ｃ．，Ｚｈｏｎｇ－ｌｉ　Ｓ．，ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｔ－２　ｔｏｘｉｎ　ａｎｄ　ｓｅ－　ｌｅｎｉｕｍ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ［Ｊ］．Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖ　Ｓｃｉ　Ｂ，２００８，９（１）：　２２＿３３．　［２］　王雅玲．养殖环境真菌气溶胶及相关真菌毒索的检测［Ｄ］．　泰安：山东农业大学，２００６：６．　［３］ＢｕｒｍｅｉｓｔｅｒＨ．Ｒ．，Ｅｌｌｉｓ　Ｊ．Ｊ．，Ｙａｔｅｓ　Ｓ．Ｇ．．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆＢｉｏ．　１ｏｇｉｃａｌ　ｔｏ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｔｗｏ　Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ　Ｅｌａｂｏｒａｔｅｄ　ｂｙ　Ｆｕｓａｒｉｕｍｒ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｏｌｏｇｙ，１９７１，４９（２１）：６７３—　６７５．　［４］Ｗｙａｔｔ　Ｒ．Ｄ．，Ｃｏｌｗｅｌｌ　Ｗ．Ｍ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ　Ｐ．Ｂ．Ｎｅｕｒａｌ　Ｄｉｓｔｕｒｂ．　ａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｃｋｅｎｓ　Ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　Ｄｉｅｔａｒｙ　Ｔ－２　Ｔｏｘｉｎ［Ｊ］．Ａｐｐｌ　Ｅｎ—　ｖｉｏｒｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９７３，２６（５）：７５７－７６１．　［５］Ｂａｍｂｕｒｇ，Ｊ．Ｒ．，Ｍａｒａｓａｓ，Ｗ．Ｆ．，Ｒｉｇｇｓ，Ｎ．Ｖ，ｅｔ　ａ１．Ｔｏｘｉｃ　ｓｐｉｒｏｅｐｏｘｙ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｆｕｓａｒｉａ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｈｙｐｈｏｍｙｅｅｔｅｓ　［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９６８，１０（４）：４４５．　微４５５．　生物学杂志　３１卷　［１１］刘艳，曹艳红，孙丽艳．培养时间对尖孢镰刀菌产毒影响的　初步观察［Ｊ］．中国地方病防治杂志，２００９，２４（４）：２６１－２６２．　［１２］王莉娜摘译．液相色谱一连续质谱法分析麦芽和啤酒中单端　胞霉烯［Ｊ］．啤酒科技，２００７，（１）：６５－６７．　［１３］邵志宇，冯永红，邓云霞．互花米草内生真菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｐ．　［６］Ｂａｍｂｕ￣Ｊ．Ｒ．，Ｒｉｇｇｓ　Ｎ．Ｖ．，Ｓｔｒｏｎｇ　Ｆ．Ｍ．．Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｔｏｘｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｗｏ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　Ｔｒｉｃｉｎｅｔｕｍ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄ—　ｒｏｎ，１９６８，２４（８）：３３２９￣３３６．　［７］Ｋ．Ｆ．Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ａｌｌｅｎ　Ｏ．Ｎ．，Ｒｉｋｅｒ　Ａ．Ｊ．，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ａｓ　ａｇｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｄａｍｐｌｉｎｇ—ｏｆｆ　ｆｕｎｇｉ［Ｊ］．　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ，１９５２，６（３９）：４０５－４１５．　Ｆ４中的活性代谢物［Ｊ］．中国天然药物，２００７，５（２）：１０８．　１ｌ１．　［８］Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　Ｍ．Ｖａｌｌｅ　Ａ，Ｍａｔｅｏ　Ｅ　Ｍ．，Ｒｕｆｉｎｏ　Ｍ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　［Ｉ４］马其云，顾国明．Ｔ－２毒素提取分离方法的改进［Ｊ］．军事医　ｔｙｐｅ　Ａ　ａｎｄ　ｔｙｐｅ　Ｂ　ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｅｅｎｅｓ　ｉｎ　ｐａｐｒｉｋａ　ａｎｄ　ｃｈｉｌｉ　ｐｅｐｐｅｒ　ｕ—　ｓｉｎｇ　ＬＣ・ｔｒｉｐｌｅ　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ—ＭＳ　ａｎｄ　ＧＣ—ＥＣＤ［Ｊ］．Ｔａｌａｎｔａ，２０１１，　８４（４）：ｌ１１２—１ｉ１７．　［９】Ｓｏｓｐｅｄｒａ　Ｉ．，Ｂｔｅｓａ　Ｊ．，Ｓｏｒｉａｎｏ　Ｊ．Ｍ．，ｅｔ　ａ１．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ｑｕｉｃｋ　ｅａｓｙ　ｃｈｅａｐ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｒｕｇｇｅｄ　ａｎｄ　ｓａｆｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　Ａ－・ａｎｄ　Ｂ・－ｔｒｉｃｈｏ－　ｔｈｅｃｃｎｅｓ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ妇０ｕｒ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ　ｙ　Ａ，　２０１０，１２１７（９）：１４３７—１４４０．　［１Ｏ］Ｍａｓａｙｏｓｈｉ　Ｔ．，Ａｔｓｕｏ　Ｕ．，Ｎａｏｋｉ　Ｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　Ｍｕｌｔｉ－ｍｙ—　ｃｏｔｏｘｉｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｂｅｅｒ－－ｂａｓｅｄ　Ｄｒｉｎｋｓ　ｂｙ　ａ　Ｍｏｄｉｉｆｅｄ　ＱｕＥＣｈ－－　ＥＲＳ　Ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　Ｕｌｔａｒ・Ｈｉｇｈ・・Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ－・　ｐｈｙ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｔａｎｄｅｍ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１　１，６（２７）：６２９－６３５．　欢迎投稿　学科学院院刊，１９８９，１３（５）：３８６￣９０．　［１５］李军，许烨，隋凯．免疫亲和柱净化／柱前衍生化一高效液相　色谱荧光检测法测定粮谷中的Ｔ－２毒素［Ｊ］．色谱，２００６，２４　（３）：２５６－２５９．　［１６］葛宝坤，赵孔祥，王伟．免疫亲和柱净化．液相色谱一串联质谱　法测定中药材中的１４种真菌毒素［Ｊ］．色谱，２０１１，２９（６）：　４９５－５００．　［１７］张辉珍．食品中丙烯酰胺等有毒有害物质检测方法建立及　其应用研究［Ｄ］．青岛：青岛大学，２０１０：５．　［１８］杨超．四种真菌毒素检测方法的建立以及赭曲霉毒素Ａ脱　出方法的初步研究［Ｄ］．青岛：中国海洋大学，２００９：６．　［１９］马丽景，许书免，饶正华．高效液相色谱紫外法测定饲料中　的Ｔ－２毒素［Ｊ］．饲料研究，２００６，（４）：６０－６２．　欢迎　、Ｉｊ—　　阋