食品生物危害性项目的分析检测
--饮用水检测及鉴定
一．实验目的
1、学习从自来水中分离、纯化微生物的原理与方法。 2、学习、掌握自来水中细菌、大肠杆菌的检测与鉴定方法。 二. 实验原理
1、采样：即采集含菌的样品
采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。 2、增殖培养（又称丰富培养）
增殖培养就是在所采集的豆腐干等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离
在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、微生物的形态特征：
细菌是单细胞原核微生物，基本形态为球状、杆状和螺旋状。有些细菌除具有共同结构外还具有鞭毛、荚毛、芽孢等特殊结构。
大肠菌群是一类革兰氏阴性无芽孢杆菌，24h内能发酵乳酸或半乳糖。 三．实验材料
1、器材：小刀一把、培养皿20个、量筒、滴管5个、吸水纸、试管30支、烧杯5个、三角瓶（100ml）6个、玻璃棒、乳钵、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、天平、显微镜、血球计数板、酒精灯、纱布、漏斗、乳糖蛋白胨发酵管、带塞玻璃瓶、、滤纸、pH试纸、刻度吸管（1mL和10mL
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各5个）等。 2、试剂：
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基、革兰氏染液 、乳糖胆盐培养基、95％乙醇、无菌水等。 ３、样品 自来水
（一） 自来水中的细菌含量检测
一、实验目的
（1）学习水样的采取和水样中细菌总数测定的方法 （2）了解和掌握平板菌落计数的原则 二、实验验原理
绝大多数腐生性和致病性的细菌，可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基上进行生长，出现肉眼可见的菌落，虽然这样设计出来的水中细菌的总数实际上是一种近似值，但它基本上能代表水样中细菌的数量。水中的细菌总数的测定和计算是指：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，1ml水样，经37℃，24h培养后所生出来的总菌数（包括腐生和致病细菌），我国饮用水的卫生学指标规定：在1ml自来水中细菌总数不得超过100个（1 ×10）。 三、仪器与用具
无菌培养皿（4个），无菌移液管1mL（10支），无菌移液管10mL（2支），无菌药勺，无菌称量纸，电子天平，恒温培养箱，100mL三角烧瓶（4个），精密pH试纸，菌落计数器。 四、试验步骤
1、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的制备
培养基成分：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15-20g、水1000ml、 配制方法：
（1）称量：按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片；
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（2）溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃摇匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌溶解。将药品完成溶解后，补充水到所需总体积，如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分；
（3）调pH：在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达。反之，用1mol/L HCl进行调节；
（4）分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入三角烧瓶内；
（5）加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能；
（6）包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称，组别，配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用容易解开，同样用记号笔注明培养基名称，组别，配制日期；
（7）灭菌：将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，放回内层锅，并装入培养基，加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，加热，，121°C并同时打开排气，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关上排气，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，维持压力至所需时间。20min后，切断电源或者关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气，旋送螺铨，打开盖子，取出。 （8）倒平板
（9）无菌检查：将培养皿放入37°C温箱培养24h，经过检查，若无菌生长，既可待用。 2、样品的制备
以无菌操作取检样25g，放于225mL无菌水的灭菌乳钵内，经充分研磨制成1：10的均匀稀释液。
用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。
另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。 3、接种
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（1）选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。
（2）用灭菌吸管吸取1ml样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。
（3）加12～15ml平板计数琼脂（约45℃左右）到平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加有1ml稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。 4、培养
待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进37℃的恒温培养箱培养24h。培养箱应保持一定的湿度，经24h培养的琼脂培养基的失重不得超过15％。 5、菌落计数和记录
（1）培养后，立即计数每个平板上的菌落数。25～250个菌落为合适范围。如不能立即计数，应将平板存放于0～4℃，但不得超过24h。
（2）操作者对同一平板复核自己的计数结果，其差异应在5％之内，而其他人对这一平板重复计数，其差异应在10％这内。否则，应找出原因，加以校正。 （3）计算和记录数据
适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释度倍数计算出每克（毫升）样品中平板菌落数。
记录时，只有在换算到每克（毫升）样品中平板菌落数时，才能定下两位有效数字，第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式。
6、结果
实验记录，报告每克样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。
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（二）自来水中大肠菌群的检测
一、 目的
1、 掌握测定大肠菌群的测定原理和方法； 2、 了解MPN测定法在食品卫生检测中的意义。 二、 原理
大肠菌群系指一群好氧及兼性厌氧，在37℃经24h能发酵乳糖、产酸、产气的革兰氏阴性无芽孢的小杆菌。大肠菌群的测定根据大肠菌群的定义，即利用它们能利用乳糖产酸、产气的特性设计的初步试验、初发酵阳性管数查MPN表，计算每100mL（g）检样中大肠菌群的最大可能数。
大肠菌群主要来源与人和动物的粪便。凡是被粪便污染的食品，就有可能受到肠道致病菌的污染。如果食品中检测出大肠菌群，并且超出了食品卫生国家标准，说明食品被粪便污染及食品中可能存在肠道致病菌，故以大肠菌群数作为食品被粪便污染的指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。 三、 材料与用具 1、样品：自来水 2、培养基的制备 （1）伊红美蓝琼脂培养基
培养基成分：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20g、2％伊红水溶液20ml、％美蓝水溶液13ml、蒸馏水1000ml (2)乳糖胆盐培养基
培养基成分：蛋白胨20g、猪胆盐5g、乳糖5g、％溴甲酚紫水溶液、蒸馏水1000ml 配制方法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正，加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。
2）以无菌操作将检样25mL放于有225mL灭菌生理盐水，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。
3）待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3管，置37℃ 温箱内，培养24h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性。
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3、试剂 0.85%生理盐水 器材设备和材料
恒温箱：36±1℃、冰箱:0～4℃、℃、 天平、 显微镜10×100、乳钵、 平皿:直径为90mm、吸管、广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL 、玻璃珠:直径约5mm、载玻片 、酒精灯、试管架、无菌试管16mm×160mm，灭菌刀，剪子，镊子 四、 方法
1、 样品处理和稀释
样品处理和制备1:10、1:100、1：1000等系列稀释操作方法和实验一相同。 2、 乳糖发酵试验
选择合适的稀释度，每个稀释度接种3个试管，将待测样品接种于乳糖发酵培养基内，接种量1mL，用单料乳糖发酵管。可按下述方法进行：先取1:10稀释浓度样液10mL分别接种于3管双料乳糖发酵管；再取10稀释液1mL分别接种3管单料乳糖发酵管；最后取1:100稀释液1mL分别接种3管单料乳糖发酵管。在试验中，可以将大肠杆菌和产气杆菌的生理盐水混合液接种1支单料乳糖发酵管中作为对照。将上述所有发酵管标记号所含检样量、组别、日期后置于36℃恒温箱内，培养24h。如果所有乳糖发酵管中都不产气，则可报告为大肠杆菌阴性，如有产气，按下程序进行。 3、 分离培养
将所有产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝培养基平板上，倒置于36℃恒温培养箱中凝固培养18~24h后取出，观察菌落形态，并作出革兰氏染色和证实实验。 4、 证实实验
在上述EMB平板上挑取可疑大肠杆菌群菌落（典型的大肠杆菌的菌落颜色呈紫黑色兼有色金属光泽；非典型大肠杆菌菌群的菌落中心呈紫黑色但全无金属光泽，或呈紫红色、棕色、红色、粉红色，或中心紫黑色周边粉红色等）1~2个进行革兰氏染色。若镜检为G菌，则将另一半菌落分别接种于乳糖发酵管中，置于36℃恒温箱内培养24h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气者，并且经过革兰染色确定为G无芽孢杆菌，即可报告为大肠杆菌群阳性。 5、报告
根据证实为大肠杆菌群的阳性管数，查大肠杆菌群的MPN检索表，报告每100mL检样中大肠菌群的量的可能数（MPN）。
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