牛奶中酪蛋白的提取与分析

实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析 实验材料：牛奶 小组成员： 实验时间：

一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析 二：报告撰写者 三、小组成员

实验仪器 温度计、布氏漏斗（*）、pH试纸（*）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（*）、电子天平（*）、2个1000ml的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm×8cm 厚度120nm）成品（*）、培养皿9—10cm（*）、毛细管（*）、尺子、铅笔、单面刀片（*）、镊子、普通滤纸（*）、电泳槽、玻璃板8cm×12cm（*）、752型分光光度计（*）、细布（*）0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml的移液管、试管、试管架、 四、实验材料

牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典） 五、实验试剂 特仑苏400ml、金典200ml、1.66g巴比妥（*）、12.76g巴比妥钠（*）、0.5g氨基黑10B（*）、50ml甲醇AR（*）、100ml冰醋酸AR（*） 、95%的乙醇250ml（*)、95%的乙醚100ml（*）、0.2mol/L的乙酸100ml（*）、0.2mol/L的乙酸钠100ml（*）、25g氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg五水硫酸铜（*）、60mg酒石酸钾钠（*） 所需试剂配制方法：

乙醇乙醚混合液的配制： 10ml95%的乙醇

配制乙醇乙醚1:1的混合液

10ml95%的乙醚

乙醇钠缓冲液的配制： 0.2mol/L的乙酸51ml

配制pH4.6的乙酸钠缓冲液（0.2mol/l）

0.2mol/L的乙酸钠49ml 巴比妥钠缓冲液的配制： 巴比妥1.66g

配制巴比妥钠缓冲液（pH8.6,0.06mol./L）,

巴比妥钠12.76g

将上述二者混合后定容于1000ml

染色液的配制： 0.5g氨基黑10B 50ml甲醇AR +40ml蒸馏水，混匀既得染色液 10ml冰醋酸AR 漂洗液的配制： 45ml95%乙醇AR 5ml冰醋酸AR 混匀得染色液 蒸馏水

透明液的配制： 25ml的冰醋酸AR 混匀得透明液 75ml的无水乙醇AR

0.05mol/L氢氧化钠溶液的配制： 16g的氢氧化钠固体定容至1000ml 10%氢氧化钠溶液的配制： 5g的氢氧化钠固体定容至50ml 双缩脲试剂的配制：

溶于5ml蒸馏水，在搅拌情况下，加入15mg五水硫酸铜

10%氢氧化钠溶液3ml，用蒸馏水稀释到60mg酒石酸钾钠

10ml，用棕色瓶避光保存

标准酪蛋白溶液A的配制（10mg/ml）： 用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml

从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液1、2的配制（2-9mg/ml）：

用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml 标准酪蛋白溶液B的配制（1500μg/ml）： 用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制

从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液3、4的配制（50-1500μg /ml）： 用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制

七、实验目的

1. 掌握从牛奶中提取酪蛋白的方法 2. 了解蛋白质分离纯化的基本办法

3. 学习电泳的基本原理及掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离酪蛋白的具体操作

4. 掌握双缩脲法和紫外吸收法测定蛋白质含量的原理及操作方法并比较两种方法 5. 熟悉分光光度计的原理和操作 6. 比较特仑苏与金典中的酪蛋白含量 八、实验原理

酪蛋白在其等电点时静电荷为零，同种电荷的相互排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调节到PH4.6，酪蛋白就可以从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶解于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白中除去脂类杂质。

酪蛋白并不是单一的一种蛋白质，而是多种性质类似的蛋白质的统称。其一般由αs—，β—，γ—，κ—4种类型组成。它们各自的等电点（pI）具有一定的差异，本实验将酪蛋白溶液点样于用pH8.6(高于酪蛋白各型等电点)缓冲液浸泡过的醋酸纤维膜上，并在该缓冲液体系中进行电泳，使酪蛋白分子上带上不同量的负电荷，在电泳过程中酪蛋白分子由负极向正极移动，同时酪蛋白各类型分子的相对分子量也不同，因此在电泳过程中其迁移率也不同，从而把酪蛋白的各种类型分离开来。

酪蛋白各组分的含量、等电点及大小 蛋白质名称 αs—酪蛋白 β—酪蛋白 γ—酪蛋白 κ—酪蛋白 含量（%） 45~55 25~35 8~15 3~7 等电点 4.1 4.5 4.1 5.8~6.0 相对分子质量 23000 24000 19000 21000 沉降系数 3.99 1.57 1.4 1.55 双缩脲在碱性溶液中能与二价铜离子产生紫红色络合物，该反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中因含有两个以上的肽键，因此也能发生双缩脲反应。蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子产生紫红色络合物，其颜色的深浅在一定范围内与蛋白质的含量称正比，与蛋白质的氨基酸组成及相对分子质量无关。故可用双缩脲反应来测定蛋白质的含量，测定范围为0.5-10mg/ml蛋白质。

由于蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等残基中具有共轭双键，使得蛋白质在280nm处具有最大吸收值，且其光吸收值与浓度在一定范围内成正比，因此，该法可用作蛋白质定量测定。该法测定蛋白质含量时具有简单、灵敏、快速、不消耗样品、不受低浓度盐干扰等优点，但该法准确度较差，特别是如果样品中含有嘧啶、嘌呤等吸收紫外光的物质时，会出现较大的干扰，这时，就需要通过紫外吸收差来求蛋白质浓度，但也存在着一定的误差。 九、实验步骤

（一）酪蛋白的提取

1、酪蛋白的等电点沉淀

做六组平行试验，每组分别：将100ml的牛奶放到500ml的烧杯中，加入40度左右的乙酸钠缓冲液，直到pH达4.6左右，用pH试纸调试。将上述悬浊液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤，收集沉淀。

2、除去脂类杂质

将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30ml95%的乙醇中。将此悬浮液倾入布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚混合液总洗涤沉淀两次，最后再乙醚洗涤沉淀两次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去。在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到的即为酪蛋白。准确称重。

（二）酪蛋白的分离与分析

3、醋酸纤维薄膜的准备（2张）

将醋酸纤维薄膜缓缓进入盛有巴比妥钠缓冲液的器皿中，全部润湿10-30min，至膜上无白点存在。 4、样品处理

分别取出从特仑苏和金典中制备的酪蛋白0.1g，加5ml0.05mol/L的NAOH溶解，备用。

5、仪器和薄膜的准备

电泳装置的准备：用四层干净的滤纸作滤纸桥，将其用缓冲液润湿，铺垫在电泳槽支架上，电泳槽内加入巴比妥钠缓冲液至刻度线处，并使两槽中的缓冲液保持在同一液面。注意滤纸桥的底边必须进入缓冲液中，并将电极仪连接好。

用镊子将浸泡好的醋酸纤维薄膜从缓冲液轻轻取出，注意用镊子夹在薄膜的一边角处，将无光泽面朝上，平放在干净滤纸上，其上再放一层滤纸，用手轻压，以吸取薄膜上多余的缓冲液。 6、点样

取出湿润的醋酸纤维素薄膜，夹在两层滤纸间吸取多余的缓冲液，无光泽面向上，在距离薄膜一端1.5cm处，用铅笔轻轻画一直线。用玻璃棒粘取酪蛋白样品液，涂于盖玻片边缘处，将盖玻片截面与薄膜无光泽面（涂有醋酸纤维素）画线处垂直接触，轻轻3-5s，是样品渗入膜内，然后轻轻提起盖玻片，点样完毕。 7、放膜

揭开电泳槽盖子，把薄膜两端平贴在滤纸桥上，放膜时需特别注意：点样面朝上（与滤纸直接接触形成电流闭合环路），点样端放于电泳槽负极端（酪蛋白已带上负电荷，电泳时从负极向正极移动）。把膜放好拉直后立即盖上电泳槽盖子，以防膜边干。 8、电泳

打开电泳仪电泳开关，调节电压至90-110V，电流0.4-0.6mA/cm，电泳时间45-60min。在电泳过程中，应该注意控制电压和电流强度，以防过高或者过低，并保持电泳的连续性。 9、染色与漂洗脱色

电泳关闭后，关闭电源，用镊子立即取出薄膜，直接浸泡在染色液中染色3-5min，取出后用漂洗液漂洗数次，每次约10min，直至背景蓝色脱尽。然后用蒸馏水清洗一下，用滤纸吸去膜上多余的水分，用电吹风的冷风将薄膜吹干。 10、透明

将吹干后的薄膜进入透明液中15s左右，立即用镊子取出，平放在干净的玻璃板上，轻轻赶去气泡，铺平膜，用电吹风冷风将膜吹干，即得到一张透明的电泳区带图谱。 11、定量

将漂洗干净的薄膜用滤纸吸干后剪下各蛋白质区带，分别浸泡于盛有4ml0.4mol/L的NAOH溶液中，37度保温5-10min，待色泽全部被浸出后，将溶

液在590nm波长下比色。分部测出各蛋白质部分的吸光度，和它们的总吸光度。

（三）牛奶中酪蛋白含量的测定——双缩脲法

12、标准曲线的制作

取21支干燥干净试管编号（每个编号3支平行试管），按下表加入各试剂 10mg/ml标准酪蛋白溶液A/ml 蒸馏水/ml 双缩脲试剂/ml 蛋白质含量/ml A540 1 0 1.0 4.0 0 2 0.1 0.9 4.0 1.0 3 0.2 0.8 4.0 2.0 4 0.4 0.6 4.0 4.0 5 0.6 0.4 4.0 6.0 6 0.8 0.2 4.0 8.0 7 1.0 0 4.0 10 将各试管混匀后，在室温下放置30min，每次均以1号试管调零测定各管在540nm波长下的吸光度。取3组测定的平均值，以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐 标，绘制蛋白质标准曲线，并计算二次线性回归方程。 13、样品测定及分析——特仑苏

取三支试管，分别吸取1.0ml酪蛋白样品液1，然后加入4.0ml双缩脲试剂，室

温下放置30min。以1号试管调零测定540nm波长下样品液的吸光度。对照标准曲线或代入二次线性回归方程求出样品液中蛋白质的含量。 14、样品测定及分析——金典

取三支试管，分别吸取1.0ml酪蛋白样品液2，然后加入4.0ml双缩脲试剂，室

温下放置30min。以1号试管调零测定540nm波长下样品液的吸光度。对照标准曲线或代入二次线性回归方程求出样品液中蛋白质的含量。

（四） 牛奶中酪蛋白含量的测定——紫外吸收法

15、标准曲线的制作

将标准酪蛋白溶液B用0.05mol/L氢氧化钠溶液分别配制成一系列浓度的标准酪

蛋白溶液：50,100,200,400,600,800,1000,1500μg/ml。以0.05mol/L氢氧化钠溶液作为对照调零，选用光程1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定上述各标准溶液的光吸收值，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘出蛋白质标准曲线，并计算二次线性回归方程。 16、样品测定及分析——特仑苏

取一定的酪蛋白样品液3，以0.05mol/L氢氧化钠溶液作为对照调零，选用光程

1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定酪蛋白样品液的光吸收值，对照标准曲线或代入二次线性回归方程，然后求出样品液中蛋白质的含量。 17、样品测定及分析——金典

取一定的酪蛋白样品液4，以0.05mol/L氢氧化钠溶液作为对照调零，选用光程

1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定酪蛋白样品液的光吸收值，对照标准曲线或代入二次线性回归方程，然后求出样品液中蛋白质的含量。

十、实验预期结果

1、提取的酪蛋白为白色粉末状，中夹杂黄色块状物体。其产率的计算公式为=测得含量/理论含量*100% （理论含量特仑苏为3.3g/100g，金典为3.5g/100g） 2、电泳后得到的图谱应该为四条条带:αs—，β—，γ—，κ—4种类型. 3、αs—酪蛋白、β—酪蛋白、γ—酪蛋白、κ—酪蛋白的理论含量（%）分别为：45-55、25-35、8-15、3-7.

十一、参考文献

现代生物化学实验技术 蒋立科 杨婉身 中国农业出版社 2003.8版 生物化学实践设计与实践 蒋立科 罗曼 高等教育出版社 2007.10 版 生物化学实验 黄建华 袁道强 陈世锋 化学工业出版社 2009.3 版

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