叶绿素酶研究的新进展

《生命的化学｝２００２年２２卷４期　文章编号：１０００．１３３６（２００２）０４－０３７３－０２　叶绿素酶研究的新进展　詹　索　（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡２１４０３６）　摘要：叶绿素酶催化叶绿素水解生成脱植醇叶绿素，是叶绿素降解中的关键酶之一。本文从叶绿素　酶的基因克隆出发，就近年来在该酶的基因表达调控、细胞内定位、同功酶性质以及糖基化作用等方　面的进展做了简要综述。　关键词：叶绿素酶；叶绿素；质体　中图分类号：Ｑ９４５　目前，克隆出的叶绿素酶基因共有４种并且　均在大肠杆菌中表达成功。它们分别是藜叶　绿素酶ＣａＣＬＨ、柑桔叶绿素酶ＣＨＬＡＳＥ１和　拟南芥叶绿素酶ＡｔＣＬＨ１、ＡｔＣＬＨ２。　序列比较发现，尽管它们的Ｎ端氨基酸　序列各不相同，同源区域仅占３１％～４２％，　但仍有一些共同点：均具有以丝氨酸为活性　叶绿素降解与农作物衰老、果实成熟和　树木落叶等植物生理现象密切相关。叶绿素　酶作为催化该降解反应的关键酶一直受到人　们的关注。近年来，随着基因克隆的成功，对　该酶的生理功能、细胞内分布以及与植物激　素的关系等有了新的认识。　１．叶绿素酶的生理功能　叶绿素酶（Ｅ．Ｃ．３．１．１．１４）是最早被发　现的植物酶种之一。１９１３年，Ｗｉｌｌｓｔ＇ａｔｔｅｒ和　中心的脂肪酶保守区，这与叶绿素酶的水解　特性相一致。在所有被克隆的叶绿素酶中Ｎ　端都具有各自的转运肽：ＡｔＣＬＨ２具有典型的　叶绿体导向转运肽，而ＡｔＣＬＨ１却不具备此　类转运肽。ＣａＣＬＨ含有典型的内质网（ＥＲ）　导向转运肽序列。ＥＲ被认为是蛋白质糖基　化的主要场所，这与叶绿素酶被认为是糖蛋　白，能够有效的被Ｃｏｎ　Ａ亲和色谱分离相一　致　。ＣＨＬＡＳＥ１的转运肽由２１个氨基酸构　成，由于ＣＨＬＡＳＥ１的Ｎ端序列与从叶绿体　中分离得到的叶绿素酶Ｎ端序列相同，所以　此转运肽被认为和叶绿体导向有关，但与经　典的叶绿体转运肽相比仍有一定的差异　。　３．叶绿素酶的细胞内分布　３．１质体内叶绿素酶　研究结果表明，至　少有一种叶绿素酶存在于质体中。叶绿素酶　Ｓｔｏｌｌ发现叶绿素酶催化叶绿素水解生成脱植　醇叶绿素，并提出脱植醇反应可能是叶绿素　降解的第一步。近年来的研究表明，在叶绿　素的降解产物中缺乏植醇基团，从而证实了　他们的推论，确定了叶绿素酶在叶绿素降解　中的关键作用　Ｊ。　２．叶绿素酶的基因克隆　自发现之后的近九十年中，叶绿素酶的　分离方法、酶学性质以及内外因子如植物激　素、温度对酶活性的影响等得到了广泛的研　究。尽管从各种不同植物和藻类中多次提纯　了叶绿素酶，并且得到了相应的抗体和Ｎ端　序列Ｅ２．３　３，但是全氨基酸序列、功能基团、调　节和表达等相关信息，直到１９９９年两个独立　的克隆成功支持了上述论点。ＡｔＣＬＨ２和　ＣＨＬＡＳＥ１中叶绿体转运肽的存在与叶绿素　酶的质体内定位相一致。非变性凝胶电泳和　叶绿体组分的酶活性检测表明，叶绿素酶位　于叶绿体内膜上　ｊ。由于叶绿素蛋白质复　合物位于类囊体上，所以叶绿素酶对叶绿素　降解的调节被简单地解释为酶和底物在空间　的研究小组相继克隆出叶绿素酶基因之前，　在相当长的一段时间里一直是一个迷ｌ４　ｊ。　收稿日期：２００２．０４．Ｏｌ　作者简介：唐蕾，女，硕士，讲师。　《生命的化学｝２００２年２２卷４期　上的分离。在叶绿素降解时，衰老细胞合成　叶绿素转运蛋白，该蛋白质穿梭于叶绿体膜　和类囊体之间担任叶绿素的传输任务。　３．２　质体外叶绿素酶　根据转运信号肽　的分析结果，ＣａＣＬＨ和ＡｔＣＬＨ１存在于细胞　器而非叶绿体中，尚不清楚叶绿素是如何从　叶绿素酶是如何启动降解过程的产生质　疑　。　５．２　叶绿素酶糖基化　研究表明叶绿素　酶是糖蛋白，氨基酸序列分析说明ＣａＣＬＨ不　类囊体传输到叶绿素酶所在的细胞器。ｓａ—　ｔｏｈ等在花椰菜中克隆了水溶性“叶绿素蛋　白”。该蛋白质从类囊体上结合叶绿素。因　为该蛋白质前体含有ＥＲ一导向信号肽序列，　所以被推测为质体外的叶绿素运载者　。　４．叶绿素酶的诱导表达　仅含有典型的ＥＲ导向信号肽序列，而且有　天冬酰胺糖基化位点。但是在ＣＨＬＡＳＥ１、　ＡｔＣＬＨ１和ＡｔＣＬＨ２中并不存在ＥＲ和高尔　基体导向信号序列。在大肠杆菌中表达的具　有活力的叶绿素酶并没有经过糖基化。叶绿　素酶糖基化的作用尚不清楚。　５．３　同功酶的作用　叶绿素酶在植物和　藻类中有着广泛的分布，分子量从２７～６５　ｋＤ不等，这种差异来源于植物种类的不同或　同功酶的存在。在藜的叶绿素酶分离中曾发　现３种离子色谱性质不同的叶绿素酶，其中　外源激素在叶绿素降解中发挥着重要的　作用。乙烯处理能够增强ＣＨＬＡＳＥ１　ｍＲＮＡ　的含量和叶绿素酶的合成，而６一苄基腺嘌　呤，１一甲基环丙烷和延缓衰老促进剂赤霉素　Ａ　的预处理均可显著降低乙烯的增效作　用　ｊ。在拟南芥中，ＡｔＣＬＨ１曾经被报道为　ＣＯＲＩ１，一个受ｃｏｒｏｎａｔｉｎｅ诱导但产物不明的　基因　Ｊ。ｃｏｒｏｎａｔｉｎｅ是一种植物毒素，能导致　叶片的缺绿病状。植物衰老促进剂甲基茉莉　酸（ｍｅｔｈｙｌ　ｉａｓｍｏｎａｔｅ）可增加ＡｔＣＬＨ１　ｍＲＮＡ　的浓度，以及相应蛋白质含量和叶绿素酶活　力。而ＡｔＣＬＨ２　ｍＲＮＡ的浓度却不受甲基茉　莉酸的影响。　５．叶绿素酶研究中存在的问题及展望　叶绿素降解是一个自然现象，据统计全　世界每年约有１０亿吨叶绿素被降解　。叶　绿素酶基因的克隆成功是在分子水平上研究　叶绿素代谢的重大突破，在农业、园艺和食品　工业中具有潜在的应用前景。但是，分子克　隆的结果同时产生了一些新的疑问。　５．１　叶绿素降解的启动　虽然乙烯处理　的两种被确定了Ｎ端序列，但却未能克隆成　功。鉴于质体内与质体外叶绿素酶存在的推　论，叶绿素降解的途径并非单一。因而叶绿　素酶同功酶的基因克隆；利用不同的手段进　行酶的细胞内定位；研究酶和底物的特定三　维空间作用等将会进一步促进对叶绿素酶功　能的了解。　参考文献　［１］Ｍａｔｉｌｅ　Ｐ　ｅｔ　ａ１．ＡｎｎｕＲｅｖＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，　１９９９，５０：６７—９５　［２］Ｔｒｅｂｉｔｓｈ　Ｔ　ｅｔ　ａＬ　ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９９３，９０：　９４４ｌ－－－９４４５　［３］Ｔｓｕｃｈｉｙａ　Ｔ　ｅｔ　ａ１．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　ｌＯ２６一ｌＯ３　１　ｉｏｌ，１９９７，３８（９）：　［４］Ｊａｃｏｂ—Ｗｉｌｋ　Ｄ　ｅｔ　ａ１．Ｐｌａｎｔ　Ｊ，１９９９，２０：６５３—６６ｌ　［５］Ｔｓｕｃｈｉｙａ　Ｔ　ｅｔ　ａ１．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９９９，９６：　ｉ５３６２一ｉ５３６７　［６］　Ｍａｔｉｌｅ　Ｐ　ｅｔ　ａ１．Ｐｌａｎｔａ，１９９７，２０１：９６—９９　［７］　Ｓａｔｏｈ　Ｈ　ｅｌ　ａ１．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３：３０５６８－－３０５７５　［８］Ｐｏｒａｔ　Ｒ　ｅｔ　ａ１．Ｐｏｓｔｈａｒｖｅｓｔ　Ｂｉｏｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９，１５：　ｌ５５一ｌ６３　可显著增加ＣＨＬＡＳＥ１　ｍＲＮＡ的水平，促进　果实的成熟，但在自然情况下，ＣＨＬＡＳＥ１始　终处于低水平组成型表达，在果实成熟阶段　ＣＨＬＡＳＥ１的表达并没有增加。作者在银杏　的研究中发现，在秋季叶绿素降解阶段，叶绿　素酶的活力迅速下降　。这些使得人们对　［９］Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ　ＣＥ　ｅｔ　ａ１．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９８，１１６：ｌＯ３７—　１０４２　［１０］Ｋｃ￣ｕｔｌｅｒ　Ｂ　ｅｔ　ａ１．Ａｃｃ　Ｃｈｅｍ　Ｒｅｓ　１９９９，３２：３５—４３　［１１］Ｔａｎｇ　Ｌ　ｅｔ　ａ１．ＺＮａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ，２０００，５５ｃ：９２３—９２６