纤维素分解菌的筛选和酶学性质分析

韩硕;赵岩;宋天顺;周楚新

【摘 要】从腐烂枯叶及附近土壤筛选到纤维素分解菌并研究其酶学特性.采用改进的赫奇逊分离法筛选纤维素分解菌.结果表明,共分离得到两株产纤维素酶的菌株.经菌落形态观察,初步鉴定一株为真菌(F-1),另一株为细菌(B-1).酶学性质初步研究显示,这两株菌的纤维素酶在酸性条件下具有较高的酶活(真菌F-1最适pH为5.5,细菌B-1最适pH为4.5),酶最适反应温度分别为45℃和35℃,且真菌纤维素酶的耐热性较强；Ca2+对酶反应有抑制作用.如该纤维素酶通过生物酶工程进行工业化生产改造,那么在环境净化方面,尤其是酸性环境下的废物处理中,将会具有很大的应用价值.

【期刊名称】《西北农业学报》 【年(卷),期】2013(022)004 【总页数】6页(P172-177)

【关键词】纤维素分解菌;筛选;产酶条件;纤维素酶活力 【作 者】韩硕;赵岩;宋天顺;周楚新

【作者单位】南京工业大学生物与制药工程学院,国际微生物能源研究所,南京210009;赤峰学院生命科学学院,内蒙古赤峰024000;南京工业大学生物与制药工程学院,国际微生物能源研究所,南京210009;南京工业大学生物与制药工程学院,国际微生物能源研究所,南京210009 【正文语种】中 文

【中图分类】Q939.99

纤维素类物质约占植物干质量的50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳源物质。对人类而言，它又是自然界中数量最大的可再生资源。微生物对纤维素的降解转化是自然界中碳素循环的主要环节，纤维素的转化利用对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义［1］。然而，由于纤维素中存在许多高能氢键，因此其水解、利用较困难，目前只利用其中很小的一部分，大部分的纤维素类物质都被弃置，既浪费资源又会对环境造成极大的污染。因此，合理开发和科学利用这一丰厚的天然资源已成为研究开发的重点领域。利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素则是纤维素利用的有效途径［2］。另外，纤维素酶在食品原料加工、洗涤化工和活性物质提取等方面也具有十分重要的应用价值［3－4］。纤维素酶已成为当前生物、化学等领域的研究热点之一，而筛选高效分泌纤维素酶的菌株则是有效利用纤维素类物质的关键。因此，相关的研究越来越引起人们的重视。专家预测，对扮演绿色化学品的纤维素酶进行开发利用，是新世纪利用可再生性资源的关键。

本试验分离筛选高产纤维素酶的微生物，进而研究其产酶条件和酶促反应最佳环境，为将来有效利用产酶菌株、提高动物饲料转化率、改善堆肥效果、减少环境污染等提供理论依据和技术支持。 1 材料与方法 1.1 样品来源

赤峰市长青公园小树林内的土壤。 1.2 主要培养基

1.2.1 赫奇逊培养基［5］（Hutchinson Medium）

磷酸二氢钾1.0g，氯化钠0.1g，硝酸钠2.5g，硫酸镁0.3g，氯化铁0.01g，氯

化钙0.1g，滤纸若干，蒸馏水1 000mL，pH 7.2左右。

1.2.2 富集培养基［6］ 羧甲基纤维素钠（CMC）20g，NaCl 5.0g，

MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO41.0g，酵母浸出粉5.0g，蛋白胨10.1 g，水1 000mL，琼脂20g，pH 自然，121℃灭菌20min。

1.2.3 鉴别培养基［7］ （NH4）2SO42g，MgSO4 0.5g，KH2PO41.0g，NaCl 0.5g，CMC 20g，刚果红0.4g，琼脂22g，H2O 1 000mL，pH 自然。 1.2.4 种子培养基 葡萄糖 20g、Na2HPO4 2.5g、KH2PO41.5g、蛋白胨2.5g、酵母膏0.5g、水1 000mL、琼脂20g，pH自然，121℃灭菌20min。 1.2.5 产酶培养基 葡萄糖2.3%，蛋白胨0.3%，硫酸铵0.2%，酵母膏0.05%，KH2PO4 0.4%，CaCl2·2H2O 0.03%，MgSO4 ·7H2O 0.03%，均按质量分数配制而成。培养条件优化时依次改变碳源和氮源，具体变动将在文中指出。 1.3 菌种的分离和纯化

将从菌源地采样得来的样品稀释成一系列不同的 稀 释 度，取 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6 6种稀释度，涂布于赫奇逊培养基（Hutchinson Medium）和CMC培养基上，每个稀释度涂布3个平板，30℃培养箱培养。长出菌群后，从培养基上挑取周围有明显透明水解圈的菌落，显微镜下进行检验。 将得到菌株用刚果红鉴别培养基平板平行筛选，其中平板5次重复，30℃恒温箱中培养4～7d，挑选出在平板上生长快、且透明水解圈大的单菌落，并对菌落进行编号。 1.4 酶活力测定

在250mL三角瓶中装50mL培养基，将各菌株接种，30℃、旋转摇床振荡培养24h作种子液。用1 000μL移液枪量取500μL转接于250 mL三角瓶中的50mL培养基中，于30℃振荡培养48h，在4℃、10 000r／min离心20min除去菌体。取上清液作为粗酶液。

DNS法［8］绘制标准曲线。在测定条件下，使用200μL分解φ＝1%CMC溶液每分钟产生1μg葡萄糖定义为1个纤维素酶活力单位。以2mLφ＝1%CMC溶液为底物（用pH 7.0，0.2 mol／L Na2HPO4－0.1mol／L 柠 檬 酸 缓 冲 液 配制），加200μL上清液，再加2 800μL蒸馏水，于47℃保温30min，然后加入2.0mL DNS试剂，沸水浴煮5min，然后一起放入凉水至室温，在540nm测光密度值，以相应空白样（2mLφ＝1%CMC溶液为底物，3mL灭菌的发酵培养液，于47℃保温30min，然后加入2.0mL DNS试剂，沸水浴煮5min，然后一起放入凉水至室温）调零。筛选出产纤维素酶活力较高的菌株作进一步的鉴定和产酶条件的研究。 1.5 数据处理

采用SPSS17.0统计分析软件对试验数据进行差异显著性检验。 2 结果与分析 2.1 形态学鉴定

从腐烂枯叶及附近土壤中初步筛选到降解纤维素的菌数株，初步分离得到9株纤维素分解菌，经划线分离、点种后观察其菌落形态见表1。 2.2 刚果红染色结果

用刚果红染液将这9株菌染色后发现菌落周围均有较明显的水解圈，因此，确定这9个菌株均具有不同程度的纤维素降解能力。将降解能力较强的菌株进行纯化，筛选出两株产酶量高的菌株，其中7号菌表现出真菌特征，命名为F－1；9号菌表现出细菌特征，命名为B－1。

对刚果红鉴别培养基上水解圈直径和菌落直径进行测量和比较，试验结果用“测量直径±标准差”表示，其结果见表2及图1。

根据表2所示结果，利用水解圈的大小同酶活性的线性关系，初步估计酶活力大小，从图1中可以看出，菌落周围出现水解圈，这是因为纤维素分解菌能分泌纤

维素酶而将平板培养基中的CMC降解成小分子的低聚糖及纤维二糖、葡萄糖等。水解后的糖类同刚果红染粒可形成红色沉淀［9－10］。 2.3 纤维素酶学性质分析

2.3.1 培养条件对目标菌株产纤维素酶的影响碳源比例：纤维素酶是诱导酶，在微生物发酵过程中，作为生长碳源的物质主要是促进菌体的生长，而诱导碳源则主要是诱导菌体产酶，纤维素酶作为菌体的一种次级代谢产物，只有在菌体达到一定的生长阶段才能产生，因此考察葡萄糖与羟甲基纤维素钠两种碳源的比值对产酶的影响十分必要［7］。不同碳源比例对产酶影响的结果见图2。由图2可知，当葡萄糖和CMC质量比为3∶1时，真菌F－1酶活达到最大值，而葡萄糖和CMC质量比为2∶2时，对细菌B－1产酶最有利，酶活达到最大值。

初始pH：为保证菌株在相对恒定的pH条件下进行产酶，本试验进行不同pH梯度的发酵培养试验，并对其酶活性进行测定，其结果见如图3、图4。如图3所示，细菌B－1在pH为3.6时产酶最好；pH小于3.6时，pH的增加有利于其产酶。当pH大于3.6时，pH的增加，会抑制细菌B－1产酶。如图4所示，真菌F－1在pH为3.2时产酶最好，随着pH的增加呈下降趋势。郑亚平等［9］研究表明，真菌所产纤维素酶环境为偏酸性的。

表1 各菌株的菌落特征及水解圈描述Table 1 Morphological characteristics and hydrolysis ring of strains菌株Strain 菌落形态特征Morphological characteristics 水解圈Hydrolysis ring 1 Obvious 2乳白色，表面光滑 Milk white，smooth surface 明 显黄 色，表面光滑Yellow，smooth surface 明显但不大Obvious but small 3灰白色，表面粗糙Gray，rough surface 明显但不大Obvious but small 4亮白色，表面粗糙Bright white，rough surface 不太明显Not very obvious 5淡黄色，表面粗糙Light yellow，rough surface 不太明显Not very obvious 6淡黄色，表面粗糙Light yellow，rough surface 不太明显

Not very obvious 7黑 色，表面粗糙Black，rough surface 明 显Obvious 8淡黄色，表面粗糙Light yellow，rough surface 明 显Obvious 9粉白色，表面光滑 White－pink，smooth surface 明 显Obvious

表2 不同菌株的水解圈直径与菌落直径测量及比较结果Table 2 Diameter comparison of colony and hydrolytic ring between different strainsus 3.27±0.011 0.83±0.039 3.94细菌diameter真菌Fung项目Item水解圈直径／cm Hydrolytic ring diameter菌落直径／cm Colony diameter水解圈直径／菌落直径Hydrolytic ring diameter／Colony Bacteria 2.64±0.057 0.74±0.028 3.57

图1 刚果红培养基中各菌菌落生长情况（左为B－1菌株，右为F－1菌株）Fig.1 Strain colony grown on bacterium medium Congo red（Left for B－1strains，right for F－1strains） 2.4 纤维素酶的酶学特性初步研究

图2 不同碳源比例下菌株产纤维素酶的结果Fig.2 Results of cellulase production with different carbon source

图3 在不同初始pH培养基中细菌B－1产纤维素酶的结果Fig.3 Results of cellulase production of B－1 with different initial pH

图4 在不同初始pH培养基中细菌F－1产纤维素酶的结果Fig.4 Results of cellulase production of F－1with different initial pH

2.4.1 酶作用最适温度 由图5可知，所试条件下，温度太高或太低都会影响菌株的生长和产酶能力。细菌B－1纤维素酶的最适反应温度为35℃左右。真菌F－1纤维素酶的最适反应温度为45℃左右。

2.4.2 酶反应最适pH 由图6可知，真菌F－1纤维素酶的最适pH为5.5。细菌B－1纤维素酶的最适pH为4.5。由此可以推断，两株菌纤维素酶是一种酸性酶，

并且在pH较低的时候，酶的活力相对较高，一般的酶在如此低的pH的条件下，酶的活力都很低，可见其耐酸性较强。

2.4.3 金属离子对纤维素酶活性的影响Ca2＋：在酶与底物反应的条件下（最适温度，最适pH），在底物溶液中加入不同浓度的Ca2＋，测其酶活力，并与原酶活力进行比较，其结果见图7。从图7可以看出，随着Ca2＋浓度的增大，真菌纤维素酶活力逐渐下降，对酶有显著的抑制作用，而对于细菌纤维素酶活力虽然有抑制作用，但对Ca2＋浓度不是很敏感。这可能是因为Ca2＋能控制细胞的生理状态，调节质膜的通透性，维持细胞体内的渗透压等［10］，当Ca2＋大量存在于培养液中时，就会使培养液中的渗透压过大而不利于菌株的生长。

图5 不同温度下纤维素酶活力的变化Fig.5 Cellulase activity with different temperature

图6 不同pH下纤维素酶的变化Fig.6 Cellulase activity with different pH Mg2＋：在酶与底物反应的条件下（最适温度，最适pH），在底物溶液中加入不同浓度的Mg2＋，测酶活力，并与原酶活力进行比较，其结果见图8。从图8中可以看出，镁离子浓度在0.4mmol／L时真菌酶活力最高，而细菌在Mg2＋浓度为0.6mmol／L时酶活力最高。可能是由于Mg2＋在总的酶促反应中可传递氢原子、电子、特定原子或作为某些化学基团的中间载体。

Zn2＋：在酶与底物反应的条件下（最适温度，最适pH），在底物溶液中加入不同浓度的Zn2＋，测酶活力，并与原酶活力进行比较，其结果见图9。从图9中可以看出，Zn2＋浓度为0～0.2 mmol／L时，真菌纤维素酶和细菌纤维素酶的活力逐渐上升，0.2～0.8mmol／L酶活力达到最大，且比较稳定，高于0.8mmol／L时，酶活力逐渐下降。推测是纤维素酶通过Zn2＋的结合和释放调节酶促反应，在一定范围内适宜的Zn2＋浓度促进酶反应，当Zn2＋浓度过高时，反而会抑制酶促反应的进行。

图7 不同浓度Ca2＋下纤维素酶活的变化Fig.7 Cellulase activity with different concentrations of calcium ions

图8 不同浓度Mg2＋下纤维素酶活的变化Fig.8 Cellulase activity with different concentrations of magnesium ions

Co2＋：在酶与底物反应的条件下（最适温度，最适pH），在底物溶液中加入不同浓度的Co2＋，测酶活力，并与原酶活力进行比较，其结果见如图10。从图10中可以看出，在Co2＋浓度在0.4 mmol／L时真菌酶活力最高，而细菌在Co2＋浓度为0.6mmol／L时酶活力最高。可能是Co2＋作为辅酶参与酶促反应，将作用物与酶螯合起来形成一种络合物，起桥梁基团的作用。

图9 不同浓度Zn2＋下纤维素酶活的变化Fig.9 Cellulase activity with different concentrations of zinc ion

图10 不同浓度Co2＋下纤维素酶活的变化Fig.10 Cellulase activity with different concentrations of cobalt ions 3 讨论

本研究针对培养基碳源比例、培养基的初始pH两个方面对产纤维素酶的影响，初步确定筛选产纤维素酶的菌株时的部分外界参数，对菌株的大量筛选奠定技术基础。从中发现，两株菌都能在酸度较大的的条件下生长，具有良好的耐酸性特性，在最适产酶条件下，酶活力最高可达22.08U／mL（图3），可以解决一般纤维素分解菌不能在低pH环境下分解纤维素的难题，而这些特性还未见报道，值得进行进一步研究。

随后又对纤维素酶的酶学特性进行了分析，发现这两株菌分泌的纤维素酶活力比较强，在酶的最适反应条件下，酶活力最高可达14.56U／mL，与先前的报道［11－13］相比相对较高，推测可能与方法和反应条件有关。而且该菌纤维素酶具有较广的酶促反应的pH，它们所产的酶最适反应温度分别为45℃和35℃，且真菌

F－1的耐热性较强，70℃时仍有一定的酶活力。酶学性质研究表明两菌株的纤维素酶属于酸性酶。而且能够pH承受范围比较大，对于外界pH环境适应能力比较强，有一定的抵御外界不良环境的能力，具有很强的生长优势。并且该菌有较好的产酶能力，为工业生产提供了低成本的前提，具有较好的应用前景。

另外，细菌的胞外酶活性普遍低于真菌，以后的筛选工作可重点放在真菌上，对于已经获得的菌种，下一步应该通过分子生物学手段进行菌种鉴定，然后可以利用诱变或构建基因工程菌来提高菌株的酶活性［14］。 参考文献：

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