一九八l、年绍四翔共叶科举位报总第1肚角茶叶中多酚氧化酶研究进展’刘仲华黄建安(湖南农学院园艺系)提共多酚氧化酶是形成红茶品质的关键酶本文根据国内外近几十年关于茶叶中多酚氧化酶的研究报道,结合笔者近年的一些研究工作,较为系统地阐述了多酚氧化酶的提取与测定方法、同工酶组分的分离与性质细胞学定位、在红茶制造中的变化规律及如何调节酶活性增进红茶品质等方面的研究状况,并提出了今后值得进一步研究的课题多酚氧化酶(PPO,EC11031)类及其氧化产物与酶蛋白的结合的结果t‘】是茶树体内存在的极为重要的氧化酶,由于同时,竹尾忠一(19651966)研究发现它在茶树活体代谢及红茶制造中的突出作Twee8nO能作为一种较理想的表面活化剂用,国内外学者一直视之为热门课题,对其作使得80%的酶活性存在于可溶性的上清液过不少的研究,并取得了一些明显的结果中[2]尔后Coggon(1973)采用低温液本文根据前人的研究及笔者近年来所作的部氮冷冻技术调整介质到PH7。,然后加入分工作,对多酚氧化酶的研究现状概述如Tween80(或葡聚糖凝胶G50)等,获下得了活性较高的可溶性粗酶制剂【。]加藤(1976)黄惠华(1984)等在提取介质中加一多阶级化曲的提取与侧定方法的改入多酚类的高效吸附剂不溶性聚乙烯毗咯烷进酮(PVP)制得了活性很高的可溶性酶试茶叶是富含多酚类的植物,多酚类是酶液,且操作简便【‘[]“1山于多酚氧化酶的类的天然抑制剂它与多酚氧化酶酶蛋白不热稳定性差,早期的研究多采用冷丙酮粉法可逆地结合,而使酶活性丧失这就使得茶制备固体的酶试剂,但是越来越多的试验叶中多酚氧酶的提取分离与测定不能象其他发现,尽管冷丙酮能去除部分酚类降低大作物中酶的提取那么方便简单在前期的多数蛋白质的溶解度使酶蛋白可逆地不研究中所获得的多酚氧化酶均属不溶性的酶失活地沉淀在叶组织捣碎的瞬间与多酚类蛋白Sanderson(19641965)首先在提取分开,但是,丙酮也可能引起酶蛋白不可逆介质中掺入了多酚类的吸附剂变性低胺分离出了可溶性很高的多—聚乙内酸,且在实际中往往难以达到足够低的酚氧化酶并温,故丙酮粉法提取的酶制剂活性偏低同工由此证明了以前获得的不溶性酶是由于多酚酶谱带数目减少或谱带活性减弱分离效果.本文承施兆鹏教授指异谨此谢忱/、年第四期一九,、茶叶科学简报63,总第121期欠佳。1.1现在大多数的研究中采用缓冲液,1965)用二乙基胺乙基纤维素(DEAE)4℃)加多酚吸附剂或表面活化剂在低温下(和狡甲基(CM)纤维素离子交换色谱法从茶来提取多酚氧化酶并巳证明,,就多酚氧化,叶中分离和纯化了多酚氧化酶,,获得了五种土168酶提取液的活性强弱看已有的方法巾不榕性PVP缓冲法优于聚酞胺粉缓冲液法和T,een,有效分部测得其分子量为144000含铜量为032%00,,每个分子含6~个铜0法8,而以冷丙酮粉法效果最差,原子‘3’’同时,竹尾忠一等(1965)通过此外另有试验发现硼酸缓冲液法比冷丙.一DEAE和CM纤维素粉于结合的柱层析诩粉法的效果也要好11刘仲华缓冲液法而言工酶谱的表现,(1987)在研,法将多酚氧化酶分成三个组分,并用淀粉凝,究红茶制造中PPO同工酶时发现酶液提取过程中,就PVP是否对匀胶电泳法测得其两种是碱性蛋白质种为酸性蛋白质,,而第三还证实了不同多酚氧化酶,浆进行低温浸提明显地影响PPO活性与同,组分比整个酶蛋白复合体对底物的专一性更强它们对各种儿茶素天然复合物和简单的0~12小时的低温度浸一般1,提可以大大地增强酶液中多酶氧化酶的活化多酚类氧化速率是不同的等(1970,I’‘]而B二。n度和同工酶数目并认为,在低温浸提中同1973,197魂)通过聚丙烯酸胺凝胶电,时发生了束缚态PPO的释放和巳释放的潜在态PPO的活化从而提倡在PPO酶液制泳分离出了六种多酚氧化酶组分子计算机估算其分子里为00,再借助电51500土25备时必须进行低温浸提川法I多酚氧化酶活性的测定早期均采用检压,[.]该法比较准确可靠但是测定程序很,,复杂烦琐Hilton历时较长,且对装置要求严格。,—通过加—大分离胶浓度的聚丙烯酞胺凝胶电泳分离砚56000士2000W—,117000士200I,40500士2500l’‘1——V—刘仲华,,I35000土200,41500士1500(1987)PJ(1974)研究出T一种简便而出了7种PPO组分其中迁移率最大的分,,快速的分光光度测定法[1即利用儿茶素与PPO酶促反应在单位时间内形成有色产物子量最小的组分尚属首次发现其活性很低在正常的凝胶浓度下易于从凝胶筛中洗脱的多少来测定酶的活性后来陈栋(1985)对,出来而难于显色观察或显色后又退去171现该分光光度法作了进一步的改进,,在反应混,有的研究表明中,,多酚氧化酶同工酶分离方法,合液中加入适量的脯氨酸作为有色产物稳定剂并以邻苯二酚代替儿茶素纯品作为底物聚丙烯酞胺凝胶电泳效果最好,淀粉凝胶电泳次之法再次之三而DEAE和CM纤维素层析效果更理想度较高,l‘。1此外[,,有的研究中还采用,了氧电极法测定PPO活性并认为该法灵敏准确性较好“1叶庆生,(1956)多酚叙化晚的细胞学定位则采用同工酶谱扫描根据各谱带峰面积之茶叶中多酚氧化酶的细胞学定位问题曾有过不少报道的和来相对地测定PPO活性但这仅仅是一种,其中主要是采用差式离心(1947,半定量的方法比性I,,,故在不同的试验中无绝对可法来确定酶蛋白与哪些细胞器结合在一起Li和Bonner11950)最先认为该[‘.酶是与叶绿体结合在一起的二1竹尾忠一00xg多.暇化.同工曲的分离及其性质(1966)则发现与叶绿素结合在一起的多酚多酚氧化酶同工酶的分离始于本世纪六氧化酶只是少数15000x,4大部分则与在1~十年代首先,3endall和Gregory等(19g离心力下沉淀下来的颗粒结合在一一九/、八年第四期茶叶科攀蔺报hava和Pop,总策121期inghe(1972)的研究中并未观起。[’71Bokueo,(1970)研remas察到还有少数酶蛋白’.976是与线粒体结合在一起的[1加藤(1)究认为除与叶绿素结合外篓凋阶段酶活性的增加点受到TMK战,t,1关于萎凋过程中多酚氧化酶活性增加这一持续廿余年的观uallil,等人用PVP从提取液中除去多酚然后采用蔗糖密度梯度离心法在8000xg下离心分离,,(1982)的试验的挑他的试验表明,萎凋过程中多酚氧化酶,出了多酚氧化酶从而认为PPO的存在部位,活性随着叶子失水而逐渐降低当以适当的与过氧化物酶体过氧化氢酶和苹果酸脱氢,方式补充水分后是他认为,,酶活性又会得以恢复但,酶这类标志物结合在一起creane而不与线粒体尽管萎凋期间酶活性有所下降尔后,叶绿体细胞色素C氧化酶和叶绿素等结合,但仍有充分的活性足以氧化新梢中的有效底物]名心]川Wikmsigh(1967)使用荧光抗体技术对多酚氧化酶的组织定位发现其大部分分布于叶表皮细胞内皮均有[’吕1,:【。1有的学者由此认为,,适度轻萎凋的红茶品质较优的原因即在于此肖伟祥和叶庆生(1985“”l【幼叶上下表1986)1的试验,卜,而老叶则仅存在于下表皮细胞中,也得到了类似的结果[’2为了弄清造刘仲总之多酚氧化酶的定位问题就现有的,成这一问题两种研究结果的根本原因凝胶电泳分离同工酶相结合的方法研究尚难于达到统一的结论还有必要运用华等(1987)采用酶活性测定与聚丙烯跳胺对红茶制造中多酚氧化酶及同工酶的变化作了较系现代生物技术对其作进一步的探讨四多.级化曲在红茶制造中的变化统的研究,结果发现多酚氧化酶在萎凋过,(一)萎凋过程中多酚氧化酶的变化程中的变化动态依酶试液的制备方法而异红茶制造中,对品质起决定作用的茶黄0~12小时)中浸提法(即匀浆液低温浸提1素茶红素是多酚类经酚氧化酶酶促氧化的结多酚氧化酶活性随萎凋失水而增加2,且在果t,.1因此研究多酚氧化酶在红茶制造中,含水量为65%左右达到顶峰(约为鲜叶的近倍)的变化意义重大ouchav五十年代末Bk,,a但过度的萎凋却使多酚氧化酶活性等曾研究指出酶,,红茶萎凋过程中[““多酚氧化下降3同工酶谱分离表明,活性的增加主要I过氧化物酶和过氧化氢酶及脱氢酶的活表现在分子量较高的PPO等组分上PPOZ和PPO性均有所增高】)对红茶竹尾忠一(1965而未能发现有任何新的酶蛋自制造中多酚氧化酶活性的变化作了较系统的形成的,萎凋期间多酚氧化酶各组分的相对活总的趋势表现为高分子组分,研究快t,,认为鲜叶中的多酚氧化酶活性在萎凋,性发生了变化性减弱时逐渐增加萎凋温度越高,,酶活性增长越3相对活性加强这正与,而低分子组分的相对活3e轻萎凋和重萎凋叶的多酚氧化酶活性在高达鲜叶的2一倍二nP夕rH(1984)的发揉捻时均快速增加现相吻合即萎凋期间低分子PPO可能聚合形成高分子PPO而使总的活性增加然而时,,川并且竹尾忠一还通过鲜叶真空渗入蛋s!““!白质生物合成的特效抑制剂如杀稻瘟菌素(blastieidin)和嗦吟霉素A(Pu,当用不浸提法制备多酚级化酶酶试液,romyein随着凋萎失水时舌性下降多酚氧化西A)等试验发现萎凋期间多酚氧化酶活,,且酶的主要活性及活性的变化均主要地表现性的增加严重地受上述物质抑制由此认为白形成的结果I:“在低分子量的PPO6上,,但进一步的研究发多酚氧化酶在萎凋期间活性增加是新的酶蛋Ierra但是Pe和W,现不浸提法中酶试液很可能提取的酶蛋自仅是那些易于释放成游离态的PPO及刚从i。k-八年策四期一九/、,茶叶科学简报1期总第12,潜在态转化成活化态的游离态PPO这些部分尚不能反映多酚氧化酶的主体,红茶中存在残余的酶活性ghley这是Cl[:’1ou-因而所得(1950)应用KCN作为酶活性抑制结论也是欠妥的,同时,在萎凋叶水合试验,剂进行对比试验后得出的结论性,他认为中发现萎凋叶复水PPO活性将仍出现上升多酚氧化酶和过氧化物酶都有较强的热稳定热处理后,趋势升,,但过度的吸水PPO活性又会下降尽,仍有残余酶活性,并随着贮管水含与失水两过程中PPO活性均表现上但在同工酶上看(二)藏吸湿而逐步得以恢复这一结论得到了肖,水合时的活性增强并)的试验的支持并且认为在霉变伟祥(199夕1t不是失水时活性增强的简单继续[茶中微生物分泌的酶也是不可忽视的酚氧化酶同工酶的变化,I名.1揉捻(切)和发酵过程中多酚,刘仲华(1987)研究了红茶干燥过程中多结果发现,氧化酶的变化竹尾忠一(1965)研究认为发酵叶多酚氧化,一经毛火处理,,绝大部分的多酚氧化酶组分,梅活性在揉捻时高达鲜叶的,2~3倍,揉捻,得以钝化唯有在发酵中起重要作用的PPO1仍能残余一定的活性即使经过足火再次钝以后则随同发酵进程而降低发酵温度高时梅活性降低的幅度与速率亦较大并设想发酵中酶活性的降低是由于形成了不溶性的氧化的多酚类与酶蛋白复合物(1972)和Clou化,红毛茶中仍有极低活性残余,PPOI组分属于对多酚类和温度的稳定性均很强的多酚氧化酶组分的酶,它的残余可能与红茶的“tZ’1Pereraghley(1950)也证实T发后熟作用五”是有关的I’1醉期间由于酶蛋白与多酚类及其氧化产物结。合使多酚氧化酶活性降低的事实忿1且C1oughley(2952)还探明T发酵工序中温度润节多.妞化阵活性控翻红茶品、质处理对多酚氧化酶和过氧化物酶活性影响的多酚氧化酶性质及其在红茶制造中的变化动态的研究程度,认为多酚氧化酶比过氧化物酶对发酵t:.】促使有些学者试图通过调节温度更为教感,刘仲华等(1987)则研,,发酵叶中多酚氧化酶活性来增进红茶品质度究认为萎凋叶一经揉捻多酚氧化酶总活性就呈现明显的降低随着发酵的进行呈持续,除适当控制红茶制造的工艺技术指标(如温湿度通气条件等)外,,,还对一些酶性下降趋势不同的多酚氧化酶同工酶对多酚,添加剂作过尝试拉维的研究发现量的o。并收到了一定的效果,马类及其氧化产物的敏感度不同及PP05,在萎凋过程I在每公斤揉切叶中添加适可以使茶黄素含,巾酶谱活性明显增强的组分PPO活性,PPO3ZM磷酸调节酸度,在揉捻与发酵中尚能保持相当的,量提高20~40%7英镑0,,每公斤的售价可以提高到PH是逐渐降S7它们可能就是催化儿茶素类氧化聚合[“‘】红茶发酵中,形成有色产物的主要酶蛋白然而低分子量,,低的前期约为PH对多酚氧化酶活性的PPO6PPO7不论其萎凋叶活性有多高揉捻以后即完全从同工酶谱上消失参与多酚类的氧化发挥有利而后期则对过氧化物酶有利,为的而不了保证发酵中多酚氧化酶活性发挥有最适宜因此,从酶性氧化角度的PH环境o刘仲华等(1957)以PH,,56看,萎凋中酶活性的增强对红茶品质的形成,IM柠檬酸缓冲液喷洒发酵叶,结果能明有着深远的影响17j不萎凋红茶是不可取的显地减缓多酚酶化酶活性降低的速率过氧化物酶的活性水平降低使两者的活性比保三)干燥与多酚氧化酶的残余活性持较高的水平,从而调节了多酚酶化产物形一九/、/、年第四期茶叶科攀简报,总第121姗成与积累的比例2〔口1获得了较好的成茶品质,物分泌的多酚氧化酶(MPPO)粗制剂添加到揉捻叶中(每公斤鲜叶加10~0克1多酚氧化酶是含铜酶蛋白兰卡茶叶研究所曾报道在缺C铜作为辅基MPPO),发现添加1%外源PPO处理能导,在其活性表达上起着不可缺少的作用,斯里刘仲0%致发酵时间缩短而茶汤色度增加添加1,,,,MPPO的处理汤色带黑香气增加凡添加u的茶树上喷Cu能明显地加快发酵pm,,增进品质Cu’。】【MPPO处理的明显增加13六,茶汤中TF和TR的含量均华(1957)以ZopSO,‘溶液喷洒于鲜恶〕叶上(TR再按常规工艺加工,明显地提高了发毛茶中TF/TR及,酵叶中多酚氧化酶活性+多姗妞化.今后的研究裸.TR)/TB之比值增大色差计测色结,国内外几十年来虽然对多酚氧化酶作过以上这些研究,果表明善t‘,茶汤红亮度和叶底红明度均有所改对其基本的性质巳有不少的1了解,,,但笔者认为以下几个方面的问题还有茶叶中的多酚氧化酶除少量分布于细胞待进一步的探讨1质中呈游离状态外大部分则存在于线粒体,红茶发酵的关键是多酚氧化酶催化儿,叶绿体等细胞器中呈束缚状态而在红茶发酵中起主要作用的是后者然而如何使,茶素氧化聚合形成邻醒作定论再进一步氧化聚合,形成茶黄素和茶红素等氧化产物但是,这虽然已束缚态的不溶性多酚氧化酶尽快释放成游离态的可溶性多酚氧化酶,多酚氧化酶各组分是否对各,并使游离出来的种儿茶素具有明显的选择性呢虽然竹尾忠一曾作过这方面的探讨但所得结论尚较含PPO尽快地由潜在态转化形成活化态是提高红茶品质的关键刘仲华(1987)运用低,糊如果有选择性的话,这将会对品质带来浓度的TP(一种活性蛋白质)和LA(一种有机酸)处理揉捻叶LA效果更好何影响呢?另外各种PPO同工酶是否都具有同样的最适PH题弄清楚以后,,能使发酵叶中的多酚作用温度呢?当这些问氧化酶活性比对照提高05~15倍,且TP比我们便可以有意识地创造条,两者均能不同程度地加快发酵速度改善120,并使毛茶的色香味得到明显的件使负责参与茶黄素形成的PPO同工酶组分的活性得以最大限度的发挥增进品质它们均无任何毒性且用量极微可望作为一种理想的品质增益剂加以实际应用]2现有的研究中均是从改变环境条件等不太直接的因素出发来增强多酚氧化酶的活随着酶研究手段的改进,纯化的活性外性我们是否可以通过深入的研究寻求一种,源多酚氧化酶已开始运用于茶叶加工ltzerSe-该酶的天然激活剂这种激活剂是通过改变,等首先应用从茶鲜叶中提取的多酚氧酶蛋白的构型或构象或者是切除某一部位,化酶使从绿茶中提取出的茶汁变成速溶红使其活性中心充分发挥作用等来表达到使酶活性成倍地增加的目的同时茶类似这种利用鲜叶中提取的多酚氧化酶,要求它无任来促进茶叶的发酵已取得了不少的专利尤何毒性且不损茶叶本身风味这样一种物质飞跃如果能够发现其在速溶红茶中应用较多此外澳大利亚巳,,那将会使红茶的品质有质的从其它植物中(如马铃薯皮蜿豆悬铃木属和苹果的愈伤组织)提取多酚氧化酶促进速3固定化酶的研究成果在食品领域的应,溶茶发酵l,’]最近加藤(1987)运用微生用已越来越广茶叶中酶的固定化研究尚少一九八八年第四期茶叶科学简报3114总第121幼见报道,如果能够以某种载体以适当的方式,,Bokuc加枯苦::《制茶工艺学与生物化学》NO38分把多酚权化酶固定化再把它运用于红茶发,醉这将会使品质得到较大的改观并且固定化酶在经适当的方式处理后又可反复使用,1982竹尾忠一Buzun(农业科技译丛(Do)1973一9615既方便又相对经济些4等:klAkadNaukSSSR》197316人们对多酚氧化酶的细胞学定位问题,NO61452as虽然作过不少的研究但结论仍是众说纷云,W4iekreminghe:(茶叶研究进展》1050丛各持异议.卜随着现代科技的进步,,一6已有越来17瘾的先进手段运用于细胞器的分离及酶类的定位研究我们很有必要借助这些先进方,竹尾忠一《农业科技译》1973N03102一10681BPPopov(彭继光译)48《茶叶通讯》法对PPO的定位作进一步的研究以澄清这1980NOZbesErt:一基本的而又十分重要的问题主要参考文献1Sa29120RoAH(卢世昌译):《茶叶通讯》1963N0563一74《茶叶通讯》1056:肖伟祥NO31973g一119,nderon:(TeaQ)196536103一11121竹尾忠一竹尾忠一(农业科技译丛)NO3竹尾忠,89es《农业科技译丛》1973NQ34一822一102:《农业科技译丛》1973NO3103JinhCJ(国外农学一茶叶》1055nNQ236一109445to一24CMRUllahNOS:,:《JSeiFoodAgrie》Ka:(PlatCeuPhysiol》10761982492一495171045:一1053《同工酶技术在植物198442程启坤“《国外科学一茶:叶》1984NOZi5黄惠华等用)资源研究中应52N02一10(油印本):PY“二3erH(顾谦译)11一15《国外农学一茶o67须海荣等《福建茶叶》19889一210叶》1986N02u:刘仲华等红茶制造中多酚氧化酶的研究(待发26JBClo1980ghley920(JSeiFodAgrie》表)831u一923(王自佩译):10中茶所社:《茶树生理生化实验手册》农业出版7225Cloglh:ey《国外农学一茶叶》1983nNO4一18NOe16一159Hilto15一2PJ:《TroPSCi》107416肖伟祥《中国茶叶》1055:92:刘仲华等张堂恒译张堂恒从酶学角度提高红茶品质初探(待发《茶叶译丛》(茶叶生化)19630111陈栋《茶树根系生理研究若千方法》(单行表)3。本)1985:,96胡振长叶庆生(:食品科学)1955NO262一10815132一6121《安微农学院学报》1986NO:(茶叶》1055NOz“4一s5599目尸、勺尸一29加藤场产:(日本农化学会志》i。吕7N0,一601、产、尹、尹、尹、沪、产、产、,-、创产、、曰曰、.尸气、沪气、沪、、产,,、沪.‘沪八产.尸、加尸,、洲.、“,、“尸、洲户、沪曲、.产、(上接第13版)培技术经验总结本文,使乌龙茶的高产优质受到难于弥补的影响4主要是对我们所开展的工作的反映,几年的作为栽培技术系统,,人在其中具有主,实践中我们从成功中取得经验的同时也从失败中吸取了教训,要作用技术的落实是人为的结果,应充分乌龙茶栽培技术环节环,重视管理方法与管理责任制问题到充分发挥使技术得环紧扣前期是基础的基础稍一疏忽,就将