重组人生长激素作用下成骨细胞细胞周期及细胞骨架改变的体外研究

成骨细胞；重组人生长激素；细胞周期;细胞骨架

【Abstract】 AIM: To observe the changes of the cell cycle and cytoskeleton of rat calvarial osteoblasts after stimulated by recombinant human growth hormone (rhgh ).

METHODS: Osteoblastic cells from rats were incubated in the medium supplemented wiht rhgh at different doses (10, 200 μg/L), and then the changes of cytoskeleton and cell cycle were detected. RESULTS: Quantitative analysis showed that osteoblasts were arrested in S phase and G2/M phase, however, green fluorescent density and red fluorescent density (nuclei) were not significantly changed. The filamentous Factin distributed in bunches and was stained strongly and evenly. The outline of nucleus was clear. CONCLUSION: Rhgh exerts a direct anabolic effect on osteoblasts, but no obvious effect on cytoskeleton of rat osteoblasts.

【Keywords】 osteoblasts; recombinant human growth hormone; cell cycle; cytoskeleton

【摘要】目的： 观察重组人生长激素（rhgh ）对体外成骨细胞（OB）细胞周期及细胞骨架Factin的影响. 方法：用浓度为10和200 μg/L的重组人生长激素加入大鼠OB培养体系，观察对大鼠OB的细胞周期及细胞骨架的影响. 结果： 定量分析表明，在rhgh 作用下，成骨细胞S期、G2/M期细胞百分比增加,OB的绿色荧光强度、红色荧光强度无显著变化. Factin纤维呈束状平行排列，荧光染色强，分布均匀. 结论：重组人生长激素对OB的合成代谢有直接影响,但对细胞骨架无显著影响.

【关键词】 成骨细胞；重组人生长激素；细胞周期;细胞骨架

口腔颌骨、牙槽骨骨量丢失是影响牙齿留存、义齿及种植体修复效果的重要因素. 骨质疏松症(osteoporosis, OP）患者的颌骨具有不同程度的骨量丧失,OP与牙齿脱落之间也有密切的相关性［1］. 生长激素在人体生长发育中起着重要的作用，能促进蛋白质合成，影响脂肪和矿物质代谢，促进内脏、骨骼和全身生长. 基因重组人生长激素（recombinant human growth hormone, rhgh ）与人体生长激素具有同等的作用. rhgh 影响骨代谢的作用机制一般有直接和间接两种方式. 直接方式是指rhgh通过成骨细胞（osteoblast, OB）的相关受体发挥作用［2］；间接方式是可以通过促进胰岛素样生长因子(IGFI)的合成促进骨形成［3］. 我们观察不同浓度的rhgh 对体外培养OB细胞周期及细胞骨架的影响，以期对颌骨骨质疏松的防治提供实验依据.

1材料和方法

1.1材料rhgh(长春金赛药业有限责任公司）；出生2 d的SD大鼠（第四军医大学实验动物研究中心）；FITC标记的鬼笔环肽（Phalloidin）（Sigma） ；碘化丙啶（PI）（Sigma）; Triton X100(华美生物工程公司)；流式细胞仪（美国）；激光共聚焦显微镜 BioRad MRC1024 （美国）.

1.2方法

1.2.1大鼠颅骨OB的体外培养取出生2 d的SD大鼠，弯剪断头，将头部浸入PBS培养液中分离颅盖骨. 将分离好的颅盖骨在含血清的DMEM的培养液中剪碎，大小约为1 mm3. 用眼科镊将组织块接种于25 mL培养瓶的底部并用探针均匀拨开，每瓶接种约20～30块. 将培养瓶底部向上加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，盖好瓶盖后再松半圈，放入

CO2孵箱中，37℃ 500 mL/L CO2孵育2 h，然后翻转使瓶底朝下,以后每3 d换液1 次,待细胞铺满培养瓶时,以2.5 g/L胰蛋白酶消化,并传代培养,所用实验细胞均为第6代细胞.

1.2.2OB的鉴定免疫组化检测细胞I型胶原的表达阳性，重氮盐法检测细胞具有碱性磷酸酶活性，四环素荧光染色法检测细胞具有矿化能力，提示实验原代培养细胞为OB.

1.2.3实验分组① 空白对照组用基础培养基；② 实验组培养基中含有重组人生长激素，浓度为10和200 μg/L.

1.3观察指标

1.3.1OB细胞周期的测定将培养的细胞经胰蛋白酶消化、混匀后，以5×107/L的密度接种于6孔板中，培养24 h，再每两孔分别换用浓度为10和200 μg/L的重组人生长激素培养液和基础培养液，继续培养48 h, 2.5 g/L胰蛋白酶消化收集各组细胞. 加入PI染料，4℃染色30 min，上机流式细胞术（FCM），联机专用软件进行处理. 同样步骤重复测定3次.

1.3.2OB细胞骨架的激光共聚焦显微镜（laser confocal scaning microscope, LSCM）观察① 将含有不同浓度重组人生长激素的OB悬液接种于内含多聚赖氨酸包被的盖玻片的培养板中，置于孵箱中，使细胞贴壁并均匀铺于盖玻片上. 对照组和不同浓度的实验组各制备6块细胞爬片. ② 取出细胞爬片，PBS轻洗1遍，950 mL/L乙醇固定30 min. 2 mL/L Triton X100室温下渗透10 min，PBS轻洗1遍. 5 mL/L牛血清蛋白（BSA）37℃孵育10 min，以封闭非特异性抗原，PBS轻洗1遍. 50 mg/L（PBS稀释）FITC鬼笔环肽室温下染色30~40 min，PBS清洗2遍. 加入5 mg/L碘化丙啶（PI），染色8~10 min，PBS轻洗2遍，缓冲甘油封片. 上述过

程均需避光操作. ③ 通过LSCM 观察OB微丝结构. 选用可见光激光光源，可输出488，514 nm波长激光，LSCM对细胞的扫描参数均为PMT1：Iris,1.2; Gain,1105; offset,0. PMT2: Iris,6.4; Gain,1052;offset,0. 计算机采集和保存图像. 应用Lasersharp图像处理软件，随机测量爬片上的OB荧光强度，进行定量分析.

统计学处理： 计量数据用x±s表示. 用SPSS12.0 for Windows软件进行方差分析（analysis of variance, ANOVA），多个样本均数两两比较（multiple comparison）用SNKq检验. 2结果

2.1OB细胞周期的测定细胞周期可分为间期和M期两个阶段. 细胞中多数细胞处于间期. 在间期中，包括DNA合成期（S期)，S期DNA含量将加倍. S期荧光强度占受测细胞总荧光强度的百分数为S期分数. FCM检测OB表明, 在10和200 μg/L重组人生长激素作用以后, OB细胞周期发生了改变, S期细胞百分比高于空白对照组，差异有统计学意义,两实验组间无统计学意义（P>0.05）.表1OB细胞周期定量分析

2.2OB细胞骨架的改变鬼笔环肽仅与Factin结合,与微丝有强亲和作用. 细胞图像中由FITCPhalloidin标记的Factin呈绿色荧光，主要见于胞质中(图1)；PI标记的核酸呈红色荧光，主要分布于胞核中(图2);两者重叠处为黄色(图3). 激光共聚焦显微镜观察在不同浓度的rhgh作用下，OB绿色荧光密度及红色荧光密度与对照组相比无统计学意义. 实验组间比较也无统计学意义（P>0.05）（表2）.表2成骨细胞荧光强度定量分析结果 3讨论

传统的治疗骨质疏松药物如雌激素、降钙素等都是通过降低骨转换、抑制破骨细胞性骨吸收而发挥作用，可以阻止患者骨量进一步丢失，但不能恢复已经丢失的骨量和退变的骨结构［4］. 人体生长激素的分泌量随着衰老而递减，特别是妇女绝经后rhgh 的分泌量将明显下降. rhgh具有刺激骨形成的作用，有可能成为一种新的能够防止骨丢失的药物. 国外临床实验表明对生长激素缺乏的患者，注射重组人生长激素1 a后，可以提高患者腰椎的骨矿物质密度［5］. 体外研究也显示，重组人生长激素对大鼠的OB增殖和碱性磷酸酶活性具有显著影响［6］.

本结果表明，重组人生长激素改变了OB细胞周期, 提高了细胞的S 期百分比，表明OB的DNA 合成速度增高, 细胞增殖加速. 同时，本实验采用激光共聚焦显微镜扫描成像系统结合FITCphalloidin标记的Factin, PI标记核酸的荧光探针双重标记技术对OB的细胞骨架进行形态观察，结果显示在不同浓度的重组人生长激素作用下OB的细胞骨架并未发生显著改变 . 细胞骨架

系统是细胞质内的一种纤维状蛋白基质，包括微管、微丝、中等纤维和微梁网格等. 细胞骨架参与细胞运动、分裂分化、细胞内物质运输以及跨膜信息传递等多种功能［7-8］. 完整的细胞骨架是细胞内源性信使协调作用的基础，而微丝则是参与介导细胞变形及运动等重要生理活动的蛋白. Factin是微丝的主要成分，参与细胞形态维持、细胞正常结构等多种功能，其结构重排及聚合和解聚的变化，在一定程度上反映了细胞的功能状况. 细胞骨架的改变是细胞凋亡的一个重要标志［9］. 实验观察到在不同浓度的重组人生长激素作用下OB的细胞骨架Factin纤维呈束状平行排列，荧光染色强，分布均匀；细胞体中央可见椭圆形红染的细胞核. 定量分析也证明绿色荧光强度和红色荧光强度并无显著差异，说明Factin在重组人生长激素作用下并未发生明显改变.

本结果表明, 在所用的实验条件下,重组人生长激素能促进OB的DNA 合成速度增高, 使细胞增殖加速；同时并未引起细胞骨架改变而引起细胞凋亡. 在细胞学水平上为国产rhgh治疗骨质疏松疾病、防止口腔骨量丢失，促进口腔保健提供了一定的实验参考.