(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109929920 A(43)申请公布日 2019.06.25
(21)申请号 201811551509.X(22)申请日 2018.12.18(30)优先权数据
62/607,739 2017.12.19 US(71)申请人 李劲风
地址 美国俄亥俄州 申请人 郭晓敏
(72)发明人 李劲风 郭晓敏
(74)专利代理机构 北京康信知识产权代理有限
责任公司 11240
代理人 张英 沈敬亭(51)Int.Cl.
C12Q 1/6858(2018.01)C12Q 1/6886(2018.01)C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
用于检测基因融合的多重PCR方法、试剂盒和组合物(57)摘要
本发明涉及用于检测基因融合的多重PCR方法、试剂盒和组合物。用于在分离的基因组DNA中检测至少两个已知的基因融合的存在或不存在的方法，包括使用分离的基因组DNA进行多重PCR。对于每种已知的基因融合，多重PCR使用一个或多个正向引物杂交第一个基因中邻近其融合断裂点位置，并且一个或多个反向引物杂交第二个基因中邻近其融合断裂点位置。引物杂交到相应基因上由多个碱基对隔开的连续隔开的相应位置。检测到的扩增产品分别表示基因融合体的存在。扩增产物可以通过Sanger测序以确定融合断点。通过设计的融合PCR监测鉴定的特异性融合。靶向治疗期间在患者血浆游离DNA中采用多重突变的实时PCR来检测抗药性突变，例如，酪氨酸激酶抑制剂的靶向治疗,来指导二线和三线的靶向治疗。
权利要求书4页 说明书15页序列表42页 附图5页
CN 109929920 ACN 109929920 A
权 利 要 求 书
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1.一种用于检测组织样品中是否存在至少两种已知的基因融合的方法，其中每种基因融合在第一融合断点位置的相应的第一基因和第二融合断点位置的相应的第二基因之间形成，所述方法包括
(a)提供从组织样品中分离的基因组DNA，(b)对分离的基因组DNA进行多重PCR，其中，对于每种已知的基因融合，多重PCR使用一个或多个正向引物和一个或多个反向引物，所述正向引物与邻近第一融合断点位置的相应的第一基因杂交，其中多个正向引物与沿着第一基因的连续的相应位置的相应的第一基因杂交，并且通过第一多碱基对将彼此分开，并且所述反向引物与邻近第二融合断点位置的相应的第二基因杂交，其中多个反向引物与沿着第二基因的连续的相应位置的相应的第二基因杂交并且通过第二多碱基对将彼此分开，以及
(c)检测是否形成一种或多种扩增产物，每种扩增产物分别代表基因融合的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多碱基对和所述第二多碱基对各自为约0.1至约4kb，约0.25至约3kb，或约0.5至约2kb。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多碱基对和所述第二多碱基对各自为约0.5至约1kb。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，用于检测组织样品中三种或更多种已知基因融合是否存在。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中相应的基因融合的第一基因选自由以下各项组成的组：EML4，KIF5B，KLC1，TGF，SEC31A，TPR，SQSTM1，DCTN1，STRN，PPFIBP1和HIP1并且相应的基因融合的第二基因是ALK。
6.根据权利要求5所述的方法，其中相应的基因融合的第一融合断裂点位置选自由以下各项组成的组：EML4内含子2，EML4内含子6，EML4内含子13，EML4内含子14，EML4内含子15，EML4内含子18，EML4内含子17，EML4内含子20，KIF5B内含子24，KIF5B内含子17，KIF5B内含子15，KLC1内含子9，TFG内含子3，SEC31A内含子21，TPR内含子15，SQSTM1内含子5，DCTN1内含子26，STRN内含子3，PPFIBP1内含子8，PPFIBP1内含子12，HIP1内含子21，HIP1内含子28，和HIP1内含子30，和相应的基因融合的第二融合断点位置是ALK内含子19。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中相应的基因融合的第一基因选自由以下各项组成的组：slc34a2，SDC4，CD74，EZR，LRIG3，TPM3，GOPC，和CCDC6，和相应的基因融合的第二基因是ROS1。
8.根据权利要求7所述的方法，其中相应的基因融合的第一融合断点位置选自由以下各项组成的组：slc34a2内含子4，slc34a2内含子12，SDC4内含子2，SDC4内含子4，CD74内含子6，EZR内含子10，LRIG3内含子16，TPM3内含子2，TPM3内含子8，GOPC内含子4，GOPC内含子8，和CCDC6内含子6，以及相应的基因融合的第二融合断点位置选自由以下各项组成的组：ROS1内含子31，ROS1内含子33，和ROS1内含子34。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中相应的基因融合的第一基因选自由以下各项组成的组：KIF5B，TRIM33，NCOA4和CUX1，并且相应的基因融合的第二基因是RET。
10.根据权利要求9所述的方法，其中相应的基因融合的第一融合断点位置选自由以下各项组成的组：KIF5B内含子15，KIF5B内含子16，KIF5B内含子23，KIF5B内含子24，TRIM33内含子14，NCOA4内含子6和CUX1内含子19，并且相应的基因融合的第二融合断点位置选自由
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权 利 要 求 书
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以下各项组成的组：RET内含子11，RET内含子10和RET内含子7。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，用于检测至少三个或更多个基因融合是否存在，其中执行根据步骤(c)的两个或更多个多重PCR，并且其中用于相应的已知的基因融合的引物在多重PCR中分开，以最小化引物之间的二聚体形成。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中检测至少一个扩增产物，所述方法还包括
(d)使从所述组织样品中分离的基因组DNA进行针对每个基因融合的单独PCR，对于该基因融合在步骤(b)使用正向引物和反向引物，相应的单独PCR使用针对相应的基因融合在多重PCR中所使用的正向引物和反向引物；和
(e)在每个单独的PCR中，检测是否形成扩增产物，所述扩增产物代表相应的基因融合存在。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括将步骤(e)中检测的扩增产物测序，和设计在扩增产物的基因融合周围的正向引物和反向引物，其可操作以扩增包含基因融合的片段。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述片段包含约50至约150个碱基对。15.根据权利要求13或14所述的方法，其中将步骤(e)中检测的扩增产物测序是通过Sanger测序来进行的。
16.一种用于评估靶向治疗期间癌症进展或癌症消退方法，包括根据权利要求13-15中任一项所述，确定在患者的组织样品中存在基因融合和设计基因融合周围的正向引物和反向引物，其可操作以扩增包含所述基因融合的片段，和在靶向治疗期间使用PCR中设计的引物监测患者无血浆细胞DNA(cfDNA)中融合产物的量。
17.一种用于监测使用可能产生抗药性的药物靶向治疗患者的方法，包括根据权利要求1-15中任一项所述的方法检测在患者的组织样品中是否存在与药物抗性相关的一个或多个获得的功能突变。
18.根据权利要求17所述的方法，其中在靶向治疗期间检测与药物抗性相关的一个或多个获得的功能突变是否存在的步骤重复至少一次。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述药物是克唑替尼并且检测与药物抗性相关的一种或多种获得的功能突变是否存在的步骤检测克唑替尼抗性ALK突变和克唑替尼抗性ROS1突变是否存在。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法，其中，所述基因组DNA是无血浆细胞DNA。21.根据权利要求17所述的方法，其中所述克唑替尼抗性ALK突变选自由以下各项组成的组：1511Tins，L1152R，C1156Y，I1171T，I1171S，F1174V，F1174C，L1196M，L1198F，G1202R，S1206Y和G1269A，及其组合。
22.根据权利要求17所述的方法，所述克唑替尼抗性ROS1突变选自：L2026M，G2032R，D2032N，L2155S，S1986Y和S1986F，及其组合。
23.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中至少一个已知的基因融合是BCR-ABL1、RBN15-MKL1、NPM1-ALK、IGH-MYC、RUNX1-RUNX1T1、ETV6-RUNX1、IGH-MAF、PML-RARA、FGFR2-KIAA1967、FGFR3-TACC3、CD74-NTRK1、MPRIP-NTRK1、TPM3-NTRK1、LMNA-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、TPR-NTRK1、PEAR1-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、RFWD2-NTRK1、TP53-NTRK1、TFG-NTRK1、NFASC-NTRK1、BCAN-NTRK1、MDM4-NTRK1、RABGAP1L-NTRK1、PPL-NTRK1、CHTOP-NTRK1、
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ARHGEF2-NTRK1、TAF-NTRK1、CEL-NTRK1、SSBP2-NTRK1、GRIPAP1-NTRK1、LRRC71-NTRK1、MRPL24-NTRK1、QKI-NTRK2、NACC2-NTRK2、VCL-NTRK2、AGBL4-NTRK2、PAN3-NTRK2、AFAP1-NTRK2、DAB21P-NTRK2、TRIM24-NTRK2、SQSTM1-NTRK2、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3、EML4-NTRK3、TFG-NTRK3、RBPMS-NTRK3、或LYN-NTRK3。
24.一种用于检测组织样品中是否存在已知的基因融合的方法，其中，所述基因融合在第一融合断点位置的第一基因和第二融合断点位置的第二基因之间形成，所述方法包括
(a)提供从组织样品中分离的基因组DNA，(b)对所述分离的基因组DNA进行PCR扩增，所述PCR扩增使用一个或多个正向引物和一个或多个反向引物，所述正向引物与第一融合断点位置邻近的相应的第一基因杂交，其中所述多个正向引物与沿着第一基因连续的相应位置的相应的第一基因杂交并且通过第一多碱基对将彼此分开，并且所述反向引物与第二融合断点位置邻近的相应的第二基因杂交，其中多个反向引物与沿着第二基因的连续的相应位置的相应的第二基因杂交并且通过第二多碱基对将彼此分开，并
(c)检测是否形成扩增产物，所述扩增产物代表基因融合的存在。25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述第一多碱基对和所述第二多碱基对各自为约0.1至约4kb、约0.25至约3kb、或约0.5至约2kb。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述第一多碱基对和所述第二多碱基对各自为约0.5至约1kb。
27.根据权利要求24-26中的任一项所述的方法，其中所述第一基因是EML4，KIF5B，TGF，SEC31A，TPR，SQSTM1，DCTN1，STRM，或PPFIBP1，并且所述第二基因是ALK。
28.根据权利要求24-26中的任一项所述的方法，其中所述第一基因是slc34a2，SDC4，CD74，EZR，LRIG3，TPM3，GOPC或CCDC6，并且所述第二基因是ROS1。
29.根据权利要求24-26中的任一项所述的方法，其中所述第一基因是KIF5B，TRIM33，NCOA4或CUX1，并且所述第二基因是RET。
30.根据权利要求24-26任何一项所述的方法，其中，所述基因融合是BCR-ABL1、RBN15-MKL1、NPM1-ALK、IGH-MYC、RUNX1-RUNX1T1、ETV6-RUNX1、IGH-MAF、PML-RARA、FGFR2-KIAA1967、FGFR3-TACC3、CD74-NTRK1、MPRIP-NTRK1、TPM3-NTRK1、LMNA-NTRK1、SQSTM1-NTRK1、TPR-NTRK1、PEAR1-NTRK1、IRF2BP2-NTRK1、RFWD2-NTRK1、TP53-NTRK1、TFG-NTRK1、NFASC-NTRK1、BCAN-NTRK1、MDM4-NTRK1、RABGAP1L-NTRK1、PPL-NTRK1、CHTOP-NTRK1、ARHGEF2-NTRK1、TAF-NTRK1、CEL-NTRK1、SSBP2-NTRK1、GRIPAP1-NTRK1、LRRC71-NTRK1、MRPL24-NTRK1、QKI-NTRK2、NACC2-NTRK2、VCL-NTRK2、AGBL4-NTRK2、PAN3-NTRK2、AFAP1-NTRK2、DAB21P-NTRK2、TRIM24-NTRK2、SQSTM1-NTRK2、ETV6-NTRK3、BTBD1-NTRK3、EML4-NTRK3、TFG-NTRK3、RBPMS-NTRK3、或LYN-NTRK。
31.根据权利要求24-30中的任一项所述的方法，还包括通过Sanger测序将步骤(c)检测的扩增产物测序，并设计基因融合周围的正向引物和反向引物，其可操作以扩增包含基因融合的片段。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述片段包含约50至约150个碱基对。33.一种用于评估靶向治疗期间癌症进展或癌症消退的方法，包括根据权利要求31或32所述，确定患者的组织样品中存在基因融合并设计基因融合周围的正向引物和反向引
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权 利 要 求 书
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物，其可操作以扩增包含所述基因融合的片段，以及在靶向治疗期间使用PCR中设计的引物来监测患者无血浆细胞DNA(cfDNA)中融合产物的量。
34.一种用于监测使用可能产生抗药性的药物靶向治疗的患者的方法，包括根据权利要求24-30中任一项所述的方法，在患者的组织样品中检测与药物抗性相关的一个或多个获得的功能突变是否存在。
35.根据权利要求34所述的方法，其中在靶向治疗期间检测与药物抗性相关的一种或多种获得的功能突变是否存在的步骤重复至少一次。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述药物是克唑替尼以及检测与药物抗性相关的一个或多个获得的功能突变是否存在的步骤检测耐克唑替尼ALK突变或耐克唑替尼ROS1突变是否存在。
37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中，所述基因组DNA是无血浆细胞DNA。38.一种用于检测组织样品中是否存在至少一种ALK基因融合的试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID NO：1-5的反向引物和SEQ ID NO：6-141的正向引物。
39.一种用于检测组织样品中是否存在至少一种ROS1基因融合的试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID NO：142-165的反向引物和SEQ ID NO：166-208的正向引物。
40.一种用于检测组织样品中是否存在至少一种RET基因融合的试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID NO：209-216的反向引物和SEQ ID NO：217-251的正向引物。
41.根据权利要求33-35中任一项所述的试剂盒，还包含不含阳性融合DNA的阴性对照分离的DNA样品。
42.一种组合物，包括来自患者非小细胞肺癌肿瘤的分离的DNA样品，SEQ ID NO：1-5的反向引物，和SEQ ID NO：6-141的正向引物。
43.一种组合物，包括来自患者非小细胞肺癌肿瘤的分离的DNA样品，SEQ ID NO：142-165的反向引物和SEQ ID NO：166-208的正向引物。44.一种组合物，包括来自患者非小细胞肺癌肿瘤的分离的DNA样品，SEQ ID NO：209-216的反向引物和SEQ ID NO：217-251的正向引物。45.根据权利要求42-44中任一项所述的组合物，还包含聚合酶。
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说 明 书
用于检测基因融合的多重PCR方法、试剂盒和组合物
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技术领域
[0001]本发明涉及的方法是用于检测组织样品中是否存在一种或多种已知的基因融合，用于在血清样品中监测检测到的基因融合体，和获得的耐药突变的方法。所述方法，试剂盒和组成物有利于帮助个体患者(例如癌症患者)选择合适的靶向疗法。
背景技术
[0002]基于患者中的一种或多种遗传改变的靶向疗法的开发正在增加。因此，非常需要用于筛选个体患者进行遗传改变的有效且可靠的方法。[0003]肺癌是美国癌症相关死亡的主要原因。大约85％的肺癌是非小细胞肺(NSCLC)，主要包括鳞状细胞癌，腺癌，腺鳞癌和大细胞未分化癌，绝大多数是腺癌。大多数NSCLC被诊断为晚期，具有临床侵袭性，并具有高转移潜力。另外，目前的NSCLC化学治疗方案具有低效力。例如，未经治疗的晚期NSCLC患者的中位生存期为7-15个月，而目前基于铂的双重化疗方案治疗的患者中位生存期为8-12个月。对NSCLC的癌发生和恶性进展机制的研究已经揭示了在该人类恶性肿瘤中不同的驱动基因被改变，并且已经开发了基于NSCLC肿瘤中的某些驱动突变的靶向治疗。识别与非鳞状NSCLC相关的致癌基因突变可以帮助确定哪些患者更有可能从靶向治疗中获益。这些癌基因包括EGFR，KRAS，BRAF，PIK3CA，ROS1并且ALK，ROS1和EGFR突变的分子诊断测试现在推荐用于NSCLC的指导治疗。
[0004]在大约2-7％的NSCLC腺癌患者中观察到棘皮动物微管相关蛋白如4(EML4)和ALK之间的融合。这种和其他ALK基因融合在非吸烟者或轻度吸烟者的腺癌患者中更常见。由于EGFR，ROS1和ALK突变是相互排斥的，因此ALK重排(基因融合)的患者不会受益于针对其他突变的治疗。例如，EGFR靶向酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)。取而代之的是，用ALK抑制剂如克唑替尼(Xalkori)，色瑞替尼(Zykadia)，或布格替尼(Alunbrig)进行治疗。在接受克唑替尼作为二线治疗的患者中，一年总生存率为70％，两年总生存率为55％。相比之下，ALK阳性匹配对照组的一年生存率为44％，两年生存率为12％，而ALK阴性对照组的一年生存率为47％，两年生存率为32％。这些数据表明，ALK基因融合本身的存在并不会产生较差的结果，但在ALK阳性患者中使用克唑替尼可以改善预后。Kwak等，非小细胞肺癌中的间变性淋巴瘤激酶抑制。N Engl J Med.，363(18)：1693-1703(2010)；Crinò等，初步II期结果与克唑替尼治疗晚期ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)：PROFILE 1005，J Clin Oncol.，29(增刊15)：摘要7514(2011)；Shaw等，Ceritinib在ALK重排的非小细胞肺癌中，N Engl J Med.，370(13)：1189-1197(2014)。基于这样的数据，建议在转移性非小细胞肺癌腺癌测试ALK重排，和建议ALK抑制剂克唑替尼用于ALK基因融合阳性患者。[0005]类似地，原癌基因酪氨酸蛋白激酶ROS(ROS1)是一种孤儿受体酪氨酸激酶(RTK)，其形成融合并定义NSCLC中另一种临床上可操作的致癌驱动突变。最近报道，大约1.4％的NSCLC具有ROS1重排。在ROS1融合阳性肿瘤中，已知30％具有复发性易位[5；6][q32；q22]，其产生CD74分子，主要组织相容性复合物，二类不变链(CD74)-ROS1融合激酶。ROS1在进化上和ALK相关，并且据此ALK抑制剂也可以在ROS1融合阳性癌症中使用。
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说 明 书
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在30-50％的散发性甲状腺髓样癌中观察到体细胞获得功能RET突变，并且在30-50％的散发性乳头状甲状腺癌中观察到体细胞RET基因融合。美国食品和药物管理局(FDA)
已批准了两种抑制药凡德他尼(ZD6474)和卡博替尼(XL184)用于晚期的甲状腺髓样癌的治疗。RET融合存在于1-2％的具有亚洲和欧洲血统的NSCLC腺癌患者中。一些研究表明RET融合优先发生在年轻的非吸烟者和轻度吸烟者中。
[0007]这些实施例证明了确定癌症个体是否具有一种或多种基因融合的价值，所述基因融合将影响特定治疗的有效性，特别是在诸如NSCLC的癌症的治疗中。荧光原位杂交(FISH)是目前ALK融合的参考检测方法。该技术使用两种特异性DNA探针，每种探针偶联荧光标记，一种绿色和一种红色，覆盖2p23ALK区域。在野生型场景中，红色信号(3'ALK)和绿色信号(5'ALK)相邻。当这两个信号之间的距离大于信号直径的两倍时，它们被认为是分离的，反映了两个DNA区域的物理分离，因此是易位(基因融合)。
[0008]如果在四个视野中计数的>15％的肿瘤细胞显示绿色和红色信号之间的分离或者是丢失相关的绿色信号的单个红色信号，则FISH认为是易位阳性的。该15％阈值允许由于背景噪声，读数或异常杂交引起的错误。必须计数至少50个细胞，如果存在10％至50％的阳性细胞，则由第二个读者计数另外50个细胞。FISH的优势在于无论变体或融合蛋白如何都能检测ALK重排，以及其与临床功效的相关性。它已被美国FDA批准用于克唑替尼治疗(Vysis ALK分离FISH探针试剂盒；雅培分子公司，德斯普兰斯，伊利诺伊斯，美国)。然而，使用FISH分析检测ALK易位可能具有挑战性：1)该技术相对昂贵，2)对结果的准确解释需要经过培训的细胞学家的专业知识和经验，他们必须查看多个组织切片的测试，3)技术没有确定具体的易位类型，4)技术通常有一个漫长的周转时间。
[0009]免疫组织化学(IHC)是检测肺癌中ALK重排的另一种方法。最初，IHC遇到了敏感性问题，偶尔会出现假阳性结果。但是，新的超灵敏IHC技术似乎提供了更可靠的和敏感的检查方法。阳性阈值通常是视觉的，需要在5-10％的细胞中进行中度至强烈染色。IHC的优点主要是其在时间和人力方面的低成本，但是测试的标准化是困难的。在NSCLC中开发用于ALK检测的IHC的挑战是：1)组织制备，2)抗体选择，3)信号增强系统，和4)最佳评分系统。虽然IHC是一种可靠的筛查工具，但在IHC阳性的情况下需要进行FISH确认，甚至在某些情况下，IHC阴性患者呈现预测性的重排包括年龄较小，轻度吸烟者(≤10包年)也需要FISH确认。阴性要做其他突变检测，特别是EGFR和KRAS。
[0010]逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和定量RT-PCR(QRT-PCR)也被用作ALK易位诊断技术。通常，通过逆转录酶将RNA转化为cDNA，并用特异性引物PCR扩增cDNA。参见，例如，Sanders等人，US 9.175.350B2和Begovich等人，US 2016/0304937 A1。扩增需要特异于每个易位的引物组。这种高度特异性的技术提供了鉴定与ALK相关的融合基因的额外优势。其用途迄今为止有限是于从一个福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)组织样品或来自新鲜或冷冻的肿瘤组织RNA的样品质量。另外，由于基因融合的高度可变性，通过RT-PCR或qRT-PCR检测融合基因可能不成功。[0011]因此，需要一种用于检测基因融合的简单，高通量方法，包括但不限于涉及ALK，ROS1，RET和NRTK1易位的方法。根据本发明的方法检测易位尤其可用于靶向治疗。
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说 明 书
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发明内容
[0012]本发明的一个目的是提供用于检测基因融合体，其中包括提供一种简单的，高通量的方法，但不限于，那些涉及ALK，ROS1，RET和/或NRTK1易位。[0013]在一个实施方案中，本发明涉及检测组织样品中至少两种已知基因融合体的存在或不存在的方法，其中每个基因融合体在第一基因的第一个融合断点位置处和相应的第二基因的第二个融合断点位置之间形成。该方法包含(a)提供从组织样品中分离基因组DNA，(b)对所述分离的基因组DNA，以多重PCR对于每个已知的基因融合，所述多重PCR使用一个或多个杂交的正向引物到相邻的相应的第一基因中的第一融合断点位置，其中所述多个正向引物杂交到相应的第一基因中的沿着所述第一基因连续各自的位置和由第一个多碱基对从彼此分开，以及一个或多个反向引物杂交其与邻近相应的第二基因第二融合断点位置，其中多个反向引物在沿第二基因的连续相应位置与相应的第二基因杂交，并通过第二个多碱基对彼此分开。和(c)检测是否形成一个或多个扩增的产品，每个扩增产物分别代表在基因组水平上存在基因融合体。[0014]在另一个实施方案中，本发明涉及鉴定组织样品中基因融合的方法，当进行所述方法以确定组织样品中至少两种已知基因融合体的存在或不存在时，至少一种在该方法的步骤(c)中检测到扩增产物，(d)将从个体组织样品中分离的基因组DNA进行用于每种基因融合PCR，其中使用正向引物和反向引物。步骤(b)，使用多重PCR中使用的正向引物和反向引物进行各个基因融合的单独PCR；(e)在每个单独的PCR中，检测是否形成扩增产物，扩增产物代表相应基因融合的存在。[0015]在另一个实施方案中，本发明涉及检测组织样品中是否存在已知基因融合体的方法，其中基因融合体形成于第一个基因的第一个融合断点位置和第二个基因的第二个融合断点位置之间。该方法包括(a)提供从组织样品中分离的基因组DNA，(b)对分离的基因组DNA进行PCR扩增，使用一个或多个杂交的正向引物杂交到相应的第一基因中的第一个融合断点相邻位置，其中所述多个正向引物杂交到相应的第一基因中的沿着所述第一基因各自连续的位置并由第一个多碱基对从彼此分开，以及一个或多个反向引物，其与相应的第二个基因第二个融合断点邻近位置杂交，其中多个反向引物在沿第二基因的连续相应位置与相应的第二基因杂交，并通过第二个多碱基对彼此分开。和(c)检测是否形成一个或多个扩增的产品，每个扩增产物分别代表在基因组水平上存在基因融合体。[0016]在具体的实施方案中，该方法可用于检测血浆样品中获得的抗药性突变。[0017]在某些实施例中，本发明还涉及监测检测发现的基因融合的方法。例如，可以使用的方法，通过Sanger测序扩增产物来设计和监测治疗过程，例如，使用多重PCR引物。围绕扩增产物中的基因融合点设计正向和反向引物，可操作地扩增包含基因融合点的片段。然后使用引物监测患者无血浆细胞循环DNA(cfDNA)中的融合产物的量，例如，在靶向治疗期间评估癌症进展或癌症消退。
[0018]在另外的实施方案中，本发明涉及一种用于监测正在用可能产生耐药性的药物进行靶向治疗的患者的方法。根据上述方法，在来自患者的组织样品中该方法包括检测与药物抗性相关的一种或多种获得性功能性突变的存在或不存在。在更具体的实施方案中，本发明涉及一种方法，采用多重实时定量PCR用于监测患者经受克唑替尼靶向治疗，并且所述方法包括检测ALK和如本文所述的使用方法中ROS1克唑替尼耐药性突变。检测耐药突变指
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说 明 书
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导二线或三线靶向治疗。
[0019]在又一个实施方案中，本发明涉及用于检测分离的基因组DNA样品中基因融合的存在或不存在的试剂盒，该试剂盒包含反向引物和正向引物的选择组合。本发明还涉及包含来自从患者非小细胞肺癌肿瘤的分离的DNA样品和反向引物和正向引物的选择组合的组合物。
[0020]本发明的方法，试剂盒和组成物提供了用于检测组织样品中已知基因融合体的存在或不存在的简单且高效的方法。由于存在或不存在这样的基因融合可能是选择癌症等疾病的治疗疗法的重要因素，并且如上所述，为了选择NSCLC的治疗疗法，本方法在靶向患者疗法方面向前迈出了重要一步。另外，本方法开辟了其他方法不能实现的用于监测疾病进展和/或治疗治疗进展的另外的可行方案。鉴于以下详细描述的理解，本发明的这些和另外的优点将变得更加显而易见并。
附图说明
[0021]鉴于附图，可以更全面地理解本发明的以下详细描述，其中：[0022]图1示出了本发明方法的第一实施例的示意图。
[0023]图2提供了实施例1中描述的本发明方法的具体实施方案的示意图。[0024]图3显示了由实施例2中描述的多重PCR产生的电泳凝胶。[0025]图4显示了由实施例3中描述的多重PCR产生的电泳凝胶。[0026]图5显示了由实施例4中描述的多重PCR产生的电泳凝胶。
[0027]图6呈现了用于检测上述获得的克唑替尼耐药ALK突变的竞争性突变特异性
实时定量PCR的示意性表示。
[0028]
图7显示了如实施例5所述的ALK抗性突变L1196M和G1269A的鉴于以下详细描述和下面给出的实施例，将更全面地理解附图。
实时PCR结
果。
[0029]
具体实施方式
[0030]本发明提供了在分离的基因组DNA中使用多重聚合酶链式反应(PCR)为基础的用于检测和一个基因的野生型多核苷酸序列不同的已知基因融合体的存在或不存在的方法。该DNA是从患者个体样品，即临床肿瘤活检，福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)组织样品或新鲜冷冻的组织样品中分离。基因组DNA也可以从患者的血液(血浆)分离，以检测血液疾病中一个或多个易位，如BCR-ABL慢性粒细胞白血病(CML)。[0031]在某些实施方案中，样品是血浆样品，或更具体地，无细胞血浆DNA样品(血浆cfDNA)。在某些实施方案中，可以对血浆cfDNA中突变等位基因进行富集。例如，为了增加血浆cfDNA稀有突变的测试灵敏度，在cfDNA中突变等位基因使用公知的富集方法，例如MutS/L酶结合，或突变体等位基因的优选PCR扩增。在一个实施方案中，使用COLD-PCR(在较低变性温度PCR下的共扩增)。COLD-PCR是一种修饰的PCR方案，无论突变类型和位置如何，均可富集已知和未知的少数等位基因。在过量野生型等位基因存在情况下优先扩增低水平DNA突变的能力可用于检测突变。通过COLD-PCR可将突变等位基因富集10-100倍。在一个具体的实施方案中，COLD-PCR对所有测试突变体基因座进行同时丰富突变等位基因，并且所述
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突变富集样品然后经上所述的突变特异性实时PCR。这些步骤的组合允许检测样品中的低至0.01％(10,000拷贝野生型中只有一个拷贝的突变)的突变基因被检测出来。[0032]本发明的第一实施例的原理图示意性示出。更具体地说，图1示出了由于易位已知基因X外显子1和基因Y外显子C融合。融合位点可以位于基因X内含子1的任何位置，由垂直黑色箭头表示，并且在基因Y内含子b中的任何位置，也由垂直黑色箭头表示。引物被设计成以一定间隔水平杂交，即连续的各个位置，例如每个约0.1至约4kb的，从约0.25至约3kb，约0.5至约2kb，或从约0.5至约1kb，沿着相应的基因相邻融合断点位置，即断裂内含子，如内含子1中的水平灰色箭头所示(正向引物)和内含子b中的水平黑色箭头(反向引物)。如图1中所示，正向和反向引物杂交最接近形成基因融合位点来得到通过正向引物从内含子1和反向引物从内含子B中的融合基因的扩增，在图1中虚线矩形中的引物。因此，融合位点最近的侧翼引物将配对扩增跨越易位点的序列。通过检测PCR中的扩增产物来证实了基因融合的存在。因此，该方法允许使用来自不同已知易位基因的引物一起来确定基因融合的存在(或不存在)，以通过单管中的实时PCR检测基因融合。[0033]更一般地，在一个实施方案中，本发明的方法允许在一个组织样品中检测至少两个已知的基因融合体的存在或不存在。在具体的实施方案中，所述方法可用于检测组织样品中至少三种，四种，五种，六种，七种，八种或更多种已知基因融合体的存在或不存在，其中每种基因融合体在相应的第一个融合断点位置处的第一基因和相应的第二个融合断点位置处的第二个基因的融合。通常，融合断点位置是指在相应基因中发生融合的内含子。该方法包含(a)提供从组织样品中分离的基因组DNA，和(b)对所述分离的基因组DNA进行多重PCR。在多重PCR中，对于每一个至少两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个或更多已知的基因融合体，所述多重PCR使用一个或多个正向引物杂交到所述相应的第一基因中的第一融合断点位置邻近，其中，所述多个正向引物在沿着第一基因的连续相应位置处与相应的第一基因杂交，并且通过第一个多碱基对彼此分开，并且一个或多个反向引物杂交相应第二基因的与第二融合断裂点邻近位置。其中所述多个反向引物在沿着第二基因的连续各个位置与相应的第二基因杂交，并通过第二个多碱基对彼此分开。对于特定已知基因融合体的每个基因，引物的数目，即一个或多个，将取决于融合发生的内含子的长度。另外，对于融合断点在接近外显子的情况下，一个或多个引物可以至少部分地沿着相邻的外显子杂交。对于小的内含子，即小于1kb，位于附近外显子的引物将覆盖内含子中的所有断点。当使用多个引物并且设计以沿着相应基因以一定间隔(即连续的相应位置)杂交时，各个位置分开约0.1至约4kb，约0.25至约3kb，约0.5至约2kb，或约0.5至约1kb，沿着与融合断点位置相邻的各个基因。然后可以在单个PCR反应设置，即单个试管中提供用于每个基因融合的相应引物。从PCR得到的一个或多个扩增产物的表示至少有一种基因融合的在组织中的存在。[0034]由于易位扩增的样品中的特异性，本发明的多重PCR方法在易位鉴定和表征特别有利的，甚至对含有大大过量的野生型分子的背景。例如，该方法允许在高达99％野生型DNA中含有突变基因组DNA样品中检测染色体易位并找到断点。[0035]在本发明的另一个实施方案中，当在所述方法中进行以确定组织样品中至少两种已知基因融合体的存在或不存在时，在步骤(c)中检测到至少一种扩增产物。该组织样品中的特定基因融合可通过(d)使来自个体的组织样品中分离的基因组DNA为其中正向引物(或多个)，以PCR为每个基因融合正向和反向引物被雇用来识别步骤(b)中，相应的各个PCR采
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用引物(一个或多个)和多重PCR用于各个基因融合中使用的正向和反向引物在每个单独的PCR中(e)，检测是否形成扩增产物，扩增产物代表相应基因融合的存在。[0036]虽然当针对增加数量的已知基因融合进行多重PCR时，本方法提供了测试时间，努力和成本的减少的优点，但是本发明的方法也可以用于检测是否存在单基因融合。因此，在一个实施方案中，该方法包括检测组织样品中单个已知基因融合的存在或不存在，其中基因融合在第一个基因的第一个融合断点位置和第二个基因的第二融合断点处的之间形成。该方法包括(a)提供从组织样品中分离的基因组DNA，(b)对分离的基因组DNA进行PCR扩增，使用一个或多个正向引物进行PCR扩增，所述正向引物与邻近第一个融合断裂点的相应第一基因杂交。其中多个正向引物在沿第一基因的连续相应位置与相应的第一基因杂交，并通过第一个多碱基对彼此分开，和一个或多个的反向引物与各自第二个融合断点位置附近的第二基因杂交。其中多个反向引物在沿第二基因的连续各个位置与相应的第二基因杂交，并通过第二个多碱基对彼此分开，和(c)检测是否扩增产物形成，扩增产物代表基因融合的存在。
[0037]在本发明中，扩增的产物，例如，来自个体的PCR产物，可以使用本领域已知的任何测序技术。示例性测序方法是Sanger测序，但是本领域已知的其他测序技术也是适用的。从测序的扩增产物中，可以设计在扩增产物中基因融合点周围的正向引物和反向引物，以扩增包含基因融合点的基因片段。合适的片段可具有约50至约150个碱基对，约75至约125个碱基对或约100个碱基对的长度。然后引物对可用于以非侵入性方式监测疾病进展，例如癌症进展或消退，导向性治疗等。例如，如此设计的引物对可随后被用于在从不含细胞的血浆患者的血液样品中分离的DNA的PCR-基于特定易位检测来作为治疗期间的非侵入性易位监控。
[0038]在具体的实施方案中，当患者正在接受已知由于融合基因中的一个或多个获得性功能性突变而随时间产生耐药性的药物治疗时，可以在治疗过程中监测患者以允许患者早期检测的融合基因突变(一个或多个)和患者治疗的修改，例如用第二或第三线治疗药物开始治疗。这些方法在各种癌症治疗中特别有价值，其中已知一线治疗药物随时间会产生耐药性。例如，接受克唑替尼针对的ALK和ROS1易位的一线治疗的患者通常在约一年左右获得耐药性。在超过50％的患者中，获得性抗性是由于ALK和/或ROS1激酶结构域突变，其可以被第二代和第三代TKI抑制剂(即ceritinib和lorlatinib)靶向以限制肿瘤发展。因此，在患者的血浆cfDNA早期检测克唑替尼抗性突变的是显著的进步。在一个具体实施方案中，该方法包括检测一种或多种选自的克唑替尼抗性ALK突变1511Tins，L1152R，C1156Y，I1171T/N/S，F1174C/L/V，L1196M，L1198F，G1202R，S1206Y和G1269A及其组合。在另一具体实施例中，所述方法包括检测从L2026M，G2032R，D2032N，L2155S，S1986Y和S1986F的一种或多种抗克唑替尼ROS1突变及其组合。重要的是，这种类型的监测不能通过目前可用的融合检测方法来完成，即IHC，FISH和实时RT-PCR。使用本发明的方法的监测可以，例如在治疗开始时进行，并且此后定期进行，即每周，每两周，每月，每两月或其他适当时进行。[0039]因此，在一个具体实施方案中，本发明的方法可用于检测组织样品中ALK基因融合的存在或不存在。与ALK融合有关的癌症对ALK抑制剂甚敏感，如crizotinib和ceritinib。由本方法提供的ALK基因融合的有效且强大的测试代表了选择患者靶向治疗的重要且有价值的机会。EML4-ALK是NSCLC中发现的最主要的基因融合体。在非小细胞肺癌KIF5B，KLC1，
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TFG，SEC31A，TPR，SQSTM1，DCTN1，STRN，PPFIBP1和HIP1基因以类似的方式与ALK融合。因此，在根据本发明的方法中，多重PCR中进行以检测存在或不存在的两个直至所有在NSCLC ALK易位的已知的基因融合体。在一个具体实施方案中，多重PCR使用设计的四个杂交在ALK内含子19(约2kb)引物和一个设计的杂交在ALK外显子20(约200bp)的引物。内含子19上连续的两个引物之间的距离约为0.5-1kb并且所有引物设计在与ALK基因的转录方向相反的方向上，即作为反向引物。多重PCR进一步使用引物设计用于杂交，例如，到EML4外显子13和内含子13，外显子16和内含子16，外显子20和内含子20，外显子14和内含子14，外显子15，外显子2和内含子2，和/或外显子17和内含子17，到KIF5B外显子24和内含子24，外显子17和内含子17，和/或外显子15和内含子15，到KLC外显子9和内含子9，到TFG内含子2，和/或内含子3，到SEC31A外显子21和内含子21，到TPR外显子15和内含子15，到SQSTM1外显子5和内含子5，到DCTN1外显子26和内含子26，到STRN外显子3和内含子3，到PPF1BP1外显子8和内含子8，和/或外显子12和内含子12，和/或到HIP1外显子21，外显子28，和/或外显子30。在本发明方法的一个具体实施方案中，以确定存在或不存在两个或更多个基因融合,在所有这些已知的基因融合体中，约150个距离围绕0.5-1kb引物被设计在指定的伙伴基因外显子和内含子，所述的引物方向与基因转录方向相同，即正向引物。在一个具体的实施方案中，基于最大扩增效率所有正向引物被分成两个PCR引物优化组，并且每个组被混合在一起，例如，所指示的5个ALK混合引物用于三个多重实时PCR检测所有已知的肿瘤样本中的ALK易位。[0040]因此，在一个另外的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，用于检测组织样品中的至少一种ALK融合基因的存在或不存在。在更具体的实施方案中，所述试剂盒包含多个反向设计的引物以0.5-1kb间距杂交在ALK内含子19和ALK外显子20，并设计用于杂交多个正向引物到EML4外显子13和内含子13，外显子16和内含子16，外显子20和内含子20，外显子14和内含子14，外显子15，外显子2和内含子2，和/或外显子17和内含子17，到KIF5B外显子24和内含子24，外显子17和内含子17，和/或外显子15和内含子15，到KLC外显子9和内含子9，到TFG内含子2，和/或内含子3，到SEC31A外显子21和内含子21，到TPR外显子15和内含子15，到SQSTM1外显子5和内含子5，到DCTN1外显子26和内含子26，到STRN外显子3和内含子3，到PPF1BP1外显子8和内含子8，和/或外显子12和内含子12，和/或到HIP1外显子21，外显子28，和/或外显子30，用一个大约0.5-1kb的距离在相同或相邻的连续的引物杂交内含子和/或外显子。在更具体的实施方案中，试剂盒包含多个正向引物，其设计为与所有已知的内含子和外显子杂交。
[0041]在另一个具体的实施方案中，可以采用本发明的方法来检测在组织样品中一个ROS1的基因融合存在或不存在。ALK抑制剂也可用于ROS1-融合阳性患者，并且其疗效增加。因此，在根据本发明的方法中，多重PCR进行在NSCLC检测存在或不存在至少两个，直至所有的已知的的ROS1基因融合。在一个具体的实施方案中，多重PCR使用11个引物杂交到ROS1外显子32和内含子31，四种引物被设计成杂交ROS1外显子34和内含子33，和5个引物设计成杂交ROS1外显子35和内含子34。两个相邻引物之间的距离约为0.5-1kb，所有引物的设计方向与ROS1基因方向相反，即作为反向引物。将这些引物混合在一起用于单一多重PCR。在多重PCR还采用设计用于杂交的引物，例如，SLC34A2外显子4和内含子4，和/或外显子12和内含子12，到SDC4外显子2和内含子2；和/或外显子4和内含子4，到CD74外显子6和内含子6，到EZR外显子10和内含子10，到LRIG3外显子16和内含子16，到TPM3外显子2和内含子2和/或外
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显子8和内含子8，到GOPC外显子8和内含子8，和/或到CCDC6外显子6和内含子6。在本发明方法的一个具体实施方式中，以确定在所有这些已知的基因融合体的组成中存在或不存在至少一种基因融合，在总共约35个引物被设计在指定的伙伴基因外显子和内含子，它们之间的距离约0.5-1kb，并且具有和基因转录的方向相同的方向，即作为正向引物。通过与所述20种ROS1引物配对，将这些引物混合在一起进行一次多重实时PCR，以检测肿瘤样品中所有已知的ROS1易位。[0042]因此，在一个另外的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒用于检测组织样品中的至少一种ROS1融合基因的存在或不存在。在更具体的实施方案中，所述试剂盒包括多个反向设计的引物杂交到ROS1的外显子32和内含子31，外显子34和内含子33，以及外显子35和内含子34，与一个距离大约0.5-1kb的连续引物之间杂交在相同或相邻的内含子和/或外显子，以及多个设计用于杂交到正向引物SLC34A2外显子4和内含子4，和/或外显子12和内含子12，到SDC4外显子2和内含子2；和/或外显子4和内含子4，到CD74外显子6和内含子6，到EZR外显子10和内含子10，到LRIG3外显子16和内含子16，到TPM3外显子2和内含子2和/或外显子8和内含子8，到GOPC外显子8和内含子8，和/或到CCDC6外显子6和内含子6。引物用一个大约0.5-1kb的距离连续之间在相同或相邻的内含子和/或外显子处杂交。在更具体的实施方案中，试剂盒包含多个正向引物，其设计为与所有已知的内含子和外显子杂交。[0043]在另一个具体的实施方案中，可以采用本发明的方法来检测在组织样本中的至少一个的存在或不存在已知RET基因融合。可以针对RET融合阳性患者选择靶向治疗。在一个具体实施方案中，本发明的方法采用多重PCR来检测NSCLC中所有已知RET易位的存在。在一个具体的实施方案中，多重PCR四个引物设计成杂交RET外显子12和内含子11，两个引物设计成杂交RET外显子11和内含子10，和两个引物设计成杂交RET外显子8和内含子7。相邻两个引物之间的距离为0.5-1kb和所有引物设计成与RET基因转录方向相反的方向，即作为反向引物。将这八种引物混合在一起。在多重PCR还采用设计用于杂交的引物，例如，KIF5B外显子15和内含子15，外显子16和内含子16，外显子22和内含子22，外显子23和内含子23；和/或外显子24和内含子24，在TRIM33外显子14和内含子14，到NCOA4外显子6和内含子6，和/或到CUX1外显子19和内含子19.在一个特定的本发明方法的实施方式，以确定在所有这些已知的基因融合体存在或不存在至少一种基因融合，总共35个引物被设计成在所述指定的伙伴基因外显子和内含子，这些引物的距离大约0.5-1kb的并且在与基因转录方向相同的方向上，即作为正向引物。在一个具体实施方案中，基于PCR引物优化将这些正向引物分成两组以获得最大扩增效率，通过与八种RET混合引物配对以混合在一起进行两次多重实时PCR，以检测肿瘤样品中所有已知的RET易位。[0044]因此，在一个另外的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒用于检测组织样品中的至少一种RET基因融合的存在或不存在。在一个更具体的实施方案中，试剂盒包含多个设计用于在与RET外显子12和内含子11，外显子11和内含子10，和外显子8和内含子7杂交的反向引物，这些连续引物以大约0.5-1kb的距离杂交在相同或相邻的内含子和/或外显子，并且设计用于杂交的多个正向引物到KIF5B外显子15和内含子15，外显子16和内含子16，外显子22和内含子22，外显子23和内含子23；和/或外显子24和内含子24，在TRIM33外显子14和内含子14，到NCOA4外显子6和内含子6，和/或到CUX1外显子19和内含子19，这些连续引物也以大约0.5-1kb的距离杂交在相同或相邻的内含子和/或外显子。在更具体的实施方案中，试
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剂盒包含多个正向引物，其设计为与所有已知的融合内含子和外显子杂交。[0045]在一个具体的实施方案中，五个多重PCR(如上所述两个用于ALK的基因融合，一个用于ROS1基因融合和两为RET基因融合)可以进行来检测所有已知的在NSCLC的ALK，ROS1和RET易位，这些易位占超过10％以上的肿瘤突变。
[0046]正如在显而易见的本文的方法和试剂盒的描述中，方法和/或试剂盒，用于检测的存在或不存在的多个，即，至少三个，四个，五个，六个，七个，八个，或更多的基因融合，可以使用根据步骤(c)进行两个或两个以上的多重PCR，其中用于所述引物各自的已知的基因融合被多个多重PCR划分，以尽量减少引物之间的二聚体形成，并因此达到最大的扩增效率。也就是说，PCR效率主要受引物之间的自体二聚体化和异体二聚体化。二聚体的形成是基于引物序列，所以在更大数量的引物在一个多重PCR，所述杂二聚体的形成的可能性更高，这将限制PCR检测效率。具有高异二聚体形成的引物可以物理分离，即用于不同的多重PCR反应。例如，在一个实施方案中，使用三重多重PCR进行本文所述的ALK融合多重PCR。当然，尽管需要更多的样品DNA，但可以以更高的PCR效率进行四次，五次或更多次多重PCR。[0047]根据如本文所述的任何试剂盒可包括阴性对照分离的DNA样品，其不含任何感兴趣的基因融合，即没有阳性融合DNA。[0048]根据进一步的实施方案中，本发明涉及组合物包含DNA样品的分离和反向正向引物的选择组合用于并如本文所述的多重PCR的使用。在一个具体的实施方案中，所述分离的DNA样品是从患者的非小细胞肺癌肿瘤。在进一步的实施方案中，所述反向引物与正向引物包括在那些上文或如以下实施例中描述的试剂盒。
[0049]多重PCR可根据本领域中已知的和使用的聚合酶是本领域中已知的技术进行。在具体的实施方案中，PCR中使用的聚合酶可以是Taq聚合酶，或更具体地，platinum Taq聚合酶(Invitrogen)，但是该方法不限于使用这种聚合酶，并且可以在本发明中使用一种或多种其他聚合酶。可以在PCR反应中使用一种或多种增强剂，例如，提高PCR扩增中靶标的产量和/或特异性。通常使用的PCR增强剂包括，但不限于，甜菜碱(betaine)和二甲亚砜(DMSO)。在一个具体实施方案中，5％DMSO包含在PCR反应中以增加多重PCR效率。
[0050]所述发明的方法可以被用来检测任何已知的癌基因易位/基因融合。该方法特异性有利于选择靶向治疗的疗法。例如，每年在美国估计1,500-5,000患者怀有TRK融合阳性的癌症。TRK融合阳性成人和小儿晚期实体瘤存在于多种癌症类型，包括唾液腺肿瘤，其他软组织肉瘤，婴儿纤维肉瘤，甲状腺肿瘤，结肠癌，肺癌，黑素瘤，胃肠道间质瘤，胆管癌，阑尾肿瘤，乳腺癌和胰腺癌。Larotrectinib是临床开发中第一个也是唯一一个选择性pan-TRK抑制剂。2018年11月27日，美国FDA批准使用商标名的Larotrectinib，对携带NTRK基因融合的晚期实体瘤患者的总反应率(ORR)为75％。本发明的方法可用于检测分离的基因组DNA中的TRK融合基因，以提供快速有效的方式来指导Larotrectinib的靶向治疗。在由检测到的特定TRK融合的本发明的方法可以很容易地在个体患者的临床治疗过程中被监测。本发明的方法可用于检测TPM4-ALK基因融合的存在，其可能存在于食管鳞状细胞癌，NPM-ALK基因融合中，其可存在于间变性非霍奇金淋巴瘤(ALCL)和在甲状腺癌中ALK和RET的易位。其可以快速且有效的方式来检测到基因融合/易位来指导靶向治疗和/或用于监测的目的，包括，但不限于，BCR-ABL1(慢性髓性白血病，CML)，RBN15-MKL1(急性巨核细胞白血病，AML)，NPM1-ALK(间变性大T细胞淋巴瘤)，IGH-MYC(Burkitt淋巴瘤/leukemia)，
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RUNX1-RUNX1T1(急性髓性白血病)，ETV6-RUNX1(B细胞前体急性)淋巴细胞白血病)，IGH-MAF(多发性骨髓瘤)，PML-RARA(急性早幼粒细胞白血病)，CD74-NTRK1(非小细胞肺癌)，MPRIP-NTRK1(非小细胞肺癌)，FGFR2-KIAA1967(肺鳞状细胞癌)，FGFR3-TACC3(各种癌)，和其他的，包括但不限于TPM3-NTRK1，LMNA-NTRK1，SQSTM1-NTRK1，TPR-NTRK1，PEAR1-NTRK1，IRF2BP2-NTRK1，RFWD2-NTRK1，TP53-NTRK1，TFG-NTRK1，NFASC-NTRK1，BCAN-NTRK1，MDM4-NTRK1，RABGAP1L-NTRK1，PPL-NTRK1，CHTOP-NTRK1，ARHGEF2-NTRK1，TAF-NTRK1，CEL-NTRK1，SSBP2-NTRK1，GRIPAP1-NTRK1，LRRC71-NTRK1，MRPL24-NTRK1，QKI-NTRK2，NACC2-NTRK2，VCL-NTRK2，AGBL4-NTRK2，PAN3-NTRK2，AFAP1-NTRK2，DAB21P-NTRK2，TRIM24-NTRK2，SQSTM1-NTRK2，ETV6-NTRK3，BTBD1-NTRK3，EML4-NTRK3，TFG-NTRK3，RBPMS-NTRK3和LYN-NTRK3。本发明的方法也适用于在检测已知在发生基因融合体存在的恶性实体肿瘤和肉瘤，包括但不限于，甲状腺癌，肾细胞癌，软组织肉瘤，尤因肉瘤，等等。[0051]可以使用任何合适的方法来检测扩增产物。在一个实施方案中，检测产物通过电泳完成。在一个特定的实施方案中，所述检测是使用实时PCR检测系统，如或
绿色。由于扩增的易位PCR片段可以高达2kb，因此可以使用与组合的
Invitrogen platinum Taq聚合酶，例如，在ABI StepOne实时PCR系统上进行多重实时PCR。[0052]在可用于促进监测患者治疗的某些实施方案中，对扩增产物进行Sanger测序，例如，使用多重PCR引物。围绕基因融合点设计正向和反向引物，其可操作以扩增包含基因融合点的片段。然后使用引物监测患者无血浆细胞DNA(cfDNA)中的融合产物的量，例如，产生抗药性后患者的治疗。[0053]例如，ALK阳性患者经克唑替尼靶向治疗几个月后将获得克唑替尼耐药性。获得的克唑替尼耐药可能是由于新的致癌突变，如肿瘤中的EGFR，KIT或KRAS突变，或主要是ALK激酶结构域的二级点突变，这些点突变赋予对第一代ALK激酶抑制剂的抗性。第二代和第三代ALK抑制剂，例如，Alectinib,C eritinib和lorlatinib，可以克服克唑替尼耐药性。在现有ALK抑制剂处理之前和期间患者的这些次级克唑替尼抗性-ALK突变的鉴定可以使临床医生检测抗性的发展提前于通过成像技术来检测疾病进展。所描述的本发明方法提供了一种基于多重竞争性突变检测方法绿色或的Taqman实时PCR来检测来自克唑替尼耐药的ALK阳性NSCLC患者的血浆cfDNA中的0.1-0.01％耐克唑替尼1511Tins，L1152R，C1156Y，I1171T，I1171S，I1171N，F1174V，F1174C，F1174L，L1196M，L1198F，G1202R，S1206Y和G1269A的ALK突变。例如，在图6中示意性地示出了方法，并且该方法可以用于确定随后的治疗决定。选择性地，突变等位基因可以如上所述从患者血浆cfDNA富集。
[0054]如已报道了癌症最终发展由于ROS1获得性突变如克唑替尼抗性L2026M，G2032R，D2032N，L2155S，S1986Y和S1986F在。cMET/RET/VEGFR抑制剂卡博替尼(XL184)和lorlatinib可有效克服ROS1克唑替尼耐药突变。本发明提供了一种基于竞争的多重突变检测方法绿色或Taqman实时PCR从无细胞血浆cfDNA检测0.1-0.01％耐克唑替尼ROS1突变L2026M，G2032R，D2032N，L2155S，S1986Y和S1986F的NSCLC患者，这可以影响随后的治疗决策。选择性地，突变等位基因可以如上所述从患者血浆cfDNA富集。
[0055]本发明的方法可以与特定基因融合连接的检测来进一步举例说明如实施例中描述的方法。[0056]例1
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在该示例中，引物根据本发明，以检测存在或者不存在EML4内含子6或内含子13和
ALK内含子19之间的基因融合/易位的设计的方法中使用具体而言，特别地，五个多核苷酸的反向引物对准在已知的易位中，ALK外显子20和内含子19(SEQ ID NO：1-5)被设计成在约0.5-1kb的距离处彼此分开的连续相应位置杂交。据易位参与内含子的大小，十个多核苷酸的正向引物已知的易位对准在EML4外显子13和内含子13(SEQ ID对齐NO：6-15)被设计用于杂交在连续的各自位置彼此分开在一个距离约0.5-1kb，并且26个正向引物上已知的易位对准EML4外显子6和内含子6(SEQ ID16-41)被设计用于杂交在连续的各自位置彼此分开的距离约0.5-1kb，如图示意性地在图2。任何在EML4内含子6和内含子13断点和ALK内含子19断点之间的任何易位将由多重PCR一对断点附近的引物被检测出。[0058]例2
[0059]在这个例子中，根据ALK基因融合监测本发明使用，在多重PCR方法中基因融合产品产生并用作样品。[0060]更特别地，通过融合PCR，其允许来自不同染色体两个PCR产物的连接产生模板。例如，在产生一个ALK内含子19和EML4内含子13融合模板，EML4内含子13片段的扩增使用SEQ ID NO：26(5'-CTTCCTTCAGAGTAGGAGGTTC-3')和SEQ ID NO：27(5'-ATTACATAGGGTGGGAGCCAAACCAGTATGAAACTCTGTGCAGT CATAAG-3')，其融合到ALK序列的5'端。ALK内含子19片段的扩增使用SEQ ID NO：29(5'-GATTCAGTGGGTAGATTCTGTGTG-3')和SEQ ID NO：28(5'-CTTATGACTGCACAGAGTTTCATACTGGTTTGGCTCCCACCCTAT GTAAT-3')，其融合到EML4序列在该5'端并和SEQ ID NO：27是互补的。这两种PCR的HiFi platinum Taq聚合酶(Invitrogen)扩增如下进行：在94℃变性2分钟；通过38个循环在94℃变性30秒进行PCR扩增；退火50-65℃，30秒；在68℃下延伸1分钟；最后在68℃下延伸5分钟。两个PCR产物在琼脂糖凝胶上运行，以确认扩增正确，并通过纯化QIAGEN试剂盒，PCR净化柱，并且该浓度被测定。将PCR产物稀释至约1ng/μl并以1：1的比例混合。通过使用混合稀释的PCR产物作为模板，使用SEQ ID NO：26和27的引物建立最终PCR，并且用HiFi platinum Taq聚合酶(Invitrogen)进行如下的最终PCR扩增的热循环：94℃变性2分钟；通过38个循环在94℃变性30秒进行PCR扩增；在50-65℃退火30秒；在68℃下延伸2分钟；最后在68℃下延伸5分钟。将PCR产物在琼脂糖凝胶上运行，以确认所述正确的ALK内含子19：EML4内含子13融合扩增，经QIAGEN试剂盒，PCR净化柱纯化以及浓度测定。模仿通过融合PCR产生的已知ALK，ROS1和RET易位融合模板来使用本发明的方法。融合PCR产物稀释到0.001pg/ul和与0.1pg/ul正常基因组DNA混合，来模拟在10000拷贝的野生型等位基因中的1％易位等位基因。[0061]使用模仿的融合PCR产物为模板，根据本发明的方法多重易位检测PCR中被设置有五个ALK引物和从伙伴基因52个引物在一个反应之后上述相同的热循环程序。将实施例1中描述的引物与包括所有已知ALK易位配偶体的以下额外引物一起使用：EML4外显子20和内含子20(SEQ ID NO：42-43)，EML4外显子14和内含子14(SEQ ID NO：44-46)，EML4外显子15(SEQ ID NO：47)，EML4外显子18和内含子18(SEQ ID NO：48-50)，EML4外显子2和内含子2(SEQ ID NO：51-62)，EML4外显子17和内含子17(SEQ ID NO：63-76)，KIF5B外显子24和内含子24(SEQ ID NO：77-79)，KIF5B外显子17和内含子17(SEQ ID NO：80-81)，KIF5B外显子15和内含子15(SEQ ID NO：82-88)，KLC1外显子9和内含子9(SEQ ID NO：89-91)，TFG外显子3和内含子3(SEQ ID NO：92-103)，SEC31A外显子21和内含子21(SEQ ID NO：104-106)，TPR外
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显子15和内含子15(SEQ ID NO：107-108)，SQSTM1外显子5和内含子5(SEQ ID NO：109-117)，DCTN1外显子26和内含子26(SEQ ID NO：118-119)，STRN外显子3和内含子3(SEQ ID NO：120-129)，PPFIBP1外显子8和内含子8(SEQ ID NO：130-132)，PPFIBP1外显子12和内含子12(SEQ ID NO：133-137)和HIP1外显子21，外显子28，外显子30和内含子30(SEQ ID NO：138-141)。
[0062]使用所述的融合的PCR产物作为模板来检测这些易位中来测试多重PCR方法的效率。所有指定的ALK易位引物包括在两个主混合物中以扩增ALK易位。没有易位的人癌细胞系HCT116被使用作为一个阴性对照。我们在Hct116基因组DNA中掺入100％，10％，1％的所有融合PCR模板。热循环按如下进行：在94℃变性2分钟；通过38个循环进行PCR扩增，94℃变性30秒；在50-65℃退火30秒；在68℃下延伸2分钟；最后在68℃下延伸5分钟。在多重PCR中加入5％DMSO作为添加的增强剂。PCR产物的五分之一分别在1％琼脂糖凝胶上运行，并在得到的凝胶图像被示出在图3中。
[0063]图3示出的两个多重PCR结果是从检测ALK和EML4，KIF5B，KCL1和TFG之间易位。在第一次多重PCR中，PCR中包括5个ALK引物和来自伴侣基因的52个引物。在第二多重PCR，五个ALK的引物和来自伙伴基因53个引物被加入PCR。约从10,000个拷贝的野生型DNA中的100个拷贝的各个易位模板(约1％)成功被本发明所述的多重PCR检测到。[0064]在进一步的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，用于检测组织样品中的至少一种ALK融合基因的存在或不存在，所述试剂盒包含如上所述的SEQ ID NO：1-5的反向引物和SEQ ID NO：6-141的正向引物。[0065]例3
[0066]在这个例子中，根据本发明融合产物产生和作为样品用于多重PCR以检测ROS1的基因融合。使用实施例2中描述的技术将ROS1内含子31,33,34分别与所有已知的配偶体内含子进行融合。
[0067]在NSCLC中有三种ROS1内含子参与ROS1易位。设计已知易位内含子上的反向引物。特别是，15个ROS1外显子32和内含子31的反向引物以约0.5-1kb的距离排列(SEQ ID NO：142-156)，4个在外显子34和内含子33上的反向引物(SEQ ID NO：157-160)，和5个外显子35和内含子34上的反向引物(SEQ ID NO：161-165)被使用。以下使用的引物覆盖了所有已知的ROS1易位配偶体：slc34a2外显子4和内含子4(SEQ ID NO：166-168)，slc34a2外显子12和内含子12(SEQ ID NO：169-171)，SDC4外显子2和内含子2(SEQ ID NO：172-176)，SDC4外显子4和内含子4(SEQ ID NO：177-181)，CD74外显子6和内含子6(SEQ ID NO：182-185)，EZR外显子10和内含子10(SEQ ID NO：186-187)，LRIG3外显子16和内含子16(SEQ ID NO：188-190)，TPM3外显子2和内含子2(SEQ ID NO：191-195)，TPM3外显子8和内含子8(SEQ ID NO：196-197)，GOPC外显子4和内含子4(SEQ ID NO：198-200)，GOPC外显子8和内含子8(SEQ ID NO：201-205)，和CCDC6外显子6和内含子6(SEQ ID NO：206-208)。[0068]所述的融合的PCR产物中加入作为模板，以测试本发明的多重PCR方法在检测ROS1易位的效率。所有这些ROS1易位引物都包含在一个主混合物中以扩增ROS1易位。没有易位的人癌细胞系HCT116被包括作为一个阴性对照。在Hct116基因组DNA中掺入100％，10％，1％的所有融合PCR模板。热循环按如下进行：在94℃变性2分钟；通过38个循环进行PCR扩增，94℃变性30秒；在50-65℃退火30秒；在68℃下延伸2分钟；最后在68℃下延伸5分钟。在
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多重PCR中包括5％DMSO作为添加的增强剂。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，如图4所示。[0069]图4示出的单个多重PCR检测ROS1分别和CD74，SLC34A2，EZR，TPM3，LRIG3，CCDC和GOPC之间易位的结果。多重PCR采用20个ROS1引物和来自合作伙伴基因的37个引物。在10,000拷贝的野生型DNA中的约100拷贝的易位模板(约1％)被多重PCR成功地检测到。[0070]在进一步的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，用于检测组织样品中的至少一种ROS1融合基因的存在或不存在，所述试剂盒包含如上所述的反向引物SEQ ID NO：142-165和正向引物SEQ ID NO：166-208。[0071]例4
[0072]在这个例子中，根据本发明融合产物产生和作为样品用于多重PCR以检测RET的基因融合。使用实施例2中描述的技术来产生融合产物。[0073]在NSCLC中有三个RET内含子参与RET易位。在该实施例中，四个反向引物排列在RET外显子12和内含子11(SEQ ID 209-212)上，其间具有约0.5-1kb的距离，两个反向引物在外显子11上的和内含子10(SEQ ID 213-214)上，具有距离约0.5-1kb，两个反向引物在外显子8和内含子7(SEQ ID 215-216)上，在其间约有0.5-12kb的距离，被使用。使用以下引物覆盖所有已知的RET易位配偶体：KIF5B外显子15和内含子15(SEQ ID 217-226)，KIF5B外显子16和内含子16(SEQ ID 227-228)，KIF5B外显子22，外显子23和内含子23(SEQ ID 229-231)，KIF5B外显子24和内含子24(SEQ ID 232-235)，TRIM33外显子14和内含子14(SEQ ID 236-237)，NCOA4外显子6和内含子6(SEQ ID 238-240)，和CUX1外显子19和内含子19(SEQ ID 241-251)。
[0074]通过将RET内含子11，10，7与所有伙伴的内含子来生成融合PCR产物。所述融合的PCR产物根据本发明作为一个模板加入来测试多重PCR检测的那些易位的效率。将指定的RET易位引物包括在两个主要混合物中以扩增RET易位。加入没有易位的人癌细胞系HCT116作为一个阴性对照。在HCT116基因组DNA中掺入100％，10％，1％的所有融合PCR模板。热循环按如下进行：在94℃变性2分钟；通过38个循环的PCR扩增，94℃变性30秒进行；在50-65℃退火30秒；在68℃下延伸2分钟；最后在68℃下延伸5分钟。5％DMSO作为添加的增强剂被加入多重PCR。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上运行，如图5所示。[0075]图5示出的两个多重PCR分别检测RET分别和KIFB，TRIM33，NCOA和CUX1之间易位的结果。在第一个多重PCR，PCR包含8个RET的引物和从伙伴基因上19个引物。在第二个多重PCR，8个RET的引物和从伙伴基因上16个引物被列入PCR。在10,000拷贝的野生型DNA中的约100拷贝的易位模板(约1％)被多重PCR成功地检测到。[0076]在进一步的实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，用于检测组织样品中的至少一种RET基因融合的存在或不存在，所述试剂盒包含如上所述的SEQ ID NO：209-216的反向引物和SEQ ID NO：217-251的正向引物。[0077]实施例2-4表明，5个多重PCR可以(两个用于ALK的基因融合，一个用于ROS1基因融合体，和两个用于RET基因融合)在NSCLC检测出所有已知的ALK，ROS1和RET易位，从而提供了一种有效的方法，用于确定患者是否适合于使用一种或多种药物的靶向治疗，所述药物对其中出现一种或多种这种基因融合显示出治疗NSCLC的改善结果。[0078]在一些实施例中，通过ABI的StepOne plus仪器进行多重实时PCR运行来检测易位。在实时PCR混合物，被加入而不加ROX参照染料(ABI的StepOne plus仪器中
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ROX被取消作为一个程序安装的参比染料)。包含在PCR反应的引物多，引物二聚体更容易地形成，这可被在阴性和空白对照扩增表明。一个样品的多重PCR阳性通过比较一个阴性样品和一个无模板空白的熔解曲线来确定(未在此示出)。[0079]例5
[0080]在一些实施方案的方法中所描述的，易位检测PCR以50μl反应体积使用以下程序在一个PCR仪器运行。将10微升PCR产物与1微升20倍稀释的混合，并在不含ROX参比染料的ABI StepOne plus仪器上运行以获得熔解曲线。通过比较样品熔解曲线与阴性样品和没有模板空白来确定多重PCR的阳性。40微升的对应的阳性PCR产物用QIAGEN试剂盒凝胶纯化柱纯化并从两端测序来确定多重PCR的引物。从而获得样品中的确切易位断点。基于易位断点序列，设计二个可扩增易位的且扩增产品小于100bp的PCR引物。扩增的易位PCR经纯化，并测定产物浓度，使用连续稀释的PCR作为实时PCR的标准曲线。
[0081]
抽取10毫升易位测定的患者血。使用QIAGEN试剂盒cfDNA提取试剂盒提
取无细胞的血浆DNA并洗脱在30微升无RNA和DNA酶水。设计的特异的易位引物的主混合物在ABI的StepOne plus的实时PCR设置如下，10微升患者cfDNA和稀释的易位标准作为模板来测量易位等位基因在样品中的拷贝数。同时，10微升患者的cfDNA的内参ERV3
主混合物实时PCR也在ABI StepOne plus实时PCR仪器上运行。例如，可以在靶向
治疗期间每三周进行患者血浆cfDNA易位监测实PCR。[0082]例6
[0083]在这个例子中，通过融合PCR产生抗ALK克唑替尼突变L1196M和G1269A的两个模板。SEQIDNO252(5'-GAAAGTTCTCCTCTGTGTTTGTCTCTAGTTTGG-3')和SEQIDNO253(5'-CCCTGCCCCGGTTCATCCTGATGGAGCTCATGGCGGGGGGA-3')含有L1196M点突变被用于扩增一个744bp片段上游的点突变位点；SEQIDNO254(5'-TCCCCCCGCCATGAGCTCCAtCAGGATGAACCGGGGCAGGG-3')含有L1196M点突变和互补于SEQIDNO253和SEQIDNO255(5'-GGCCCTACTGCCCTGTGTGTC-3')被用于扩增一个631bp片段下游指向突变位点。两种PCR产物纯化，稀释和混合在1：1的比率作为一个模板建立融合PCR使用引物SEQIDNO252和255，以获得一个ALKL1196M模板。类似地，SEQIDNO256(5'-CAACTGGCAGAAACCAGCCCGT-3')和SEQIDNO257(5'-TCTCGGGCCATCCCGAAGTCTGCAATCTTGGCCACTCTTCCAGG G-3')含有G1269A点突变被用于扩增一个539bp片段上游的点突变位点；SEQIDNO258(5'-CCCTGGAAGAGTGGCCAAGATTGcAGACTTCGGGATGGCCCGA GA-3')含有G1269A点突变和互补于SEQIDNO257和SEQIDNO259(5'-GCCACTTAGAATTCCTGAGTACTGAGG-3')被用于扩增一个713bp片段下游到点突变位点。将两种PCR产物纯化，稀释并以1：1混合作为模板以使用引物SEQIDNO256和259建立融合PCR以获得ALKG1269A模板。
[0084]在该突变特异性PCR，设计用于ALKL1196M突变实时PCR引物和探针是突变特异性引物SEQIDNO260(5'-CCGCCATGAGCTCCAt-3')，SEQIDNO261(5'-CCACCAGAACATTGTTCGCTGC3')以及修饰过的封闭探针SEQIDNO262(5'-GCTCCAGCAGGATGAACC/3Phos/)。设计用于ALKG1269A突变实时PCR的引物和探针是突变特异性引物SEQIDNO263(5'-GAAGAGTGGCCAAGATTGc-3')，SEQIDNO264(5'-CGGAGGGGTGAGGCAG-3')和修饰的阻断探针SEQIDNO265(5'-GCCAAGATTGGAGACTTCGG/3Phos/)。在实时PCR20微升的反应中，1微升从100,000至10个拷贝系列稀释的ALKL1196M或G1269A，2X的10微升
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绿色主混合物，1微升的2微摩尔SEQ260，1微升的2微摩尔SEQ261，1微升的8微摩尔
SEQ262，1微升的2微摩尔SEQ263，1微升的2微摩尔SEQ264，1微升的8微摩尔SEQ265和3微升水都包括在内。多重突变实时PCR在ABIStepOnePlus仪器上进行，热循环程序在95℃变性10分钟；95℃变性15秒，50-65℃退火30秒，40个循环；接下来熔解曲线95℃15秒，60℃进行1分钟，95℃15秒，在每0.3℃温度上升时收集荧光信号。两个ALK突变L1196M和G1269A的Ct值和熔融温度在图7中得以描述。根据测量的Ct阴性和无模板对照显示扩增，但熔解曲线表明这些都是非特异性PCR引物二聚体。多重突变特异性实时PCR结果显示低至0.01％突变等位基因(10000个野生型拷贝大约1个突变的拷贝)可通过本发明被检测到。[0085]值得注意的是，所有10个已知的ALK克唑替尼耐药性突变以如上所述的本发明可在患者血浆cfDNA使用两个多重突变特异性实时PCR检测到。[0086]值得注意的是，所有5个已知的ROS1克唑替尼耐药性突变以如上所述的本发明可在患者血浆cfDNA使用两个多重突变特异性实时PCR检测到。
[0087]该实施例和本文所述的具体实施例在本质上仅是示例性的并不意在限制由权利要求限定的本发明的。鉴于本说明书，其他实施方案和实施例及其优点对于本领域普通技术人员而言是显而易见的，并且在要求保护的发明的范围内。
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序列表<110> 李劲风（Li, Jingfeng）郭晓敏（Guo, Xiaomin）<120> 用于检测基因融合的多重PCR方法、试剂盒和组合物（Multiplex PCR Methods for Detecting Gene Fusions, Kits and Compositions）
<130> 4016757-211517<150> 62/607,739<151> 2017-12-19<160> 265<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 1gcagtagttg gggttgtagt c 21<210> 2<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 2gctctgaacc tttccatcat acttag 26<210> 3<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 3gagttggaga agagccacat c 21<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 4tgctgccatc tcccttctac 20<210> 5<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
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<400> 5gttgggagct tccgttttgg 20<210> 6<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 6tactgtagag cccacacctg 20<210> 7<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 7caggtcctct ttgccctttt c 21<210> 8<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 8gcacagtgtc tggcatttgc 20<210> 9<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 9gaagaatggc agtgggttga g 21<210> 10<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 10cctgtggcag tcttaccaac 20<210> 11<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 11ggcaggcagt gtaaacttgc 20<210> 12
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序 列 表
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<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 12gagaactatg aaactcccac acc 23<210> 13<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 13agcaagccct ttcctgtctc 20<210> 14<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 14caagaggact aagggctgtt tattg 25<210> 15<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 15cctcagaagg tcaaccaaag atg 23<210> 16<211> 27<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 16ggcataaaga tgtcatcatc aaccaag 27<210> 17<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 17gtgatttgag ctagatgaat ccagc 25<210> 18<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
23
CN 109929920 A
序 列 表
4/42页
<400> 18ctcagtttcc tgtcttgcca ac 22<210> 19<211> 27<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 19ctttagtagg tcttactttc tcccttc 27<210> 20<211> 29<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 20gaaatatagt ggcatctact gaaataggg 29<210> 21<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 21gtggcttgtt ccaaatcatc tgc 23<210> 22<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 22gggacttcag gcaccatgta 20<210> 23<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 23ctggaggaga atctgaatgt cc 22<210> 24<211> 28<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 24cattctaaca ggttacagtt ctgatgtg 28<210> 25
24
CN 109929920 A
序 列 表
5/42页
<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 25gttaggggta aaatgacctg tatcac 26<210> 26<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 26gcaggtgctt ttgttcagag c 21<210> 27<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 27gaaaggacgg aagaccaatg c 21<210> 28<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 28gttgtggtta gtagcagtct tcc 23<210> 29<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 29cgtccctgaa ctacactcac 20<210> 30<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 30ttgagaaagc agagccaggg 20<210> 31<211> 29<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
25
CN 109929920 A
序 列 表
6/42页
<400> 31catgcttaca gattccattg tttcattgg 29<210> 32<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 32cgaagttctg ctgttgcctt tg 22<210> 33<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 33gcagaaacat cttcctcttc tactg 25<210> 34<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 34gtctggggaa atgaacaaca gc 22<210> 35<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 35cccaaggtaa agagtgtctt cc 22<210> 36<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 36gcactacatc atgcctttgc ttttc 25<210> 37<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 37gtgatgttga aaccatagtg tggg 24<210> 38
26
CN 109929920 A
序 列 表
7/42页
<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 38ggttgtatca gcctctggtt g 21<210> 39<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 39ttgtatgtag gtcactggga tgc 23<210> 40<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 40gatacctatg ctgccaataa ggaaac 26<210> 41<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 41catccagtag cgtggtagac 20<210> 42<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 42catcacacac cttgactggt c 21<210> 43<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 43cagggaggaa tatgatagat ggg 23<210> 44<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
27
CN 109929920 A
序 列 表
8/42页
<400> 44actggaggag ggaaagacag 20<210> 45<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 45gttcactcct tcctttccca tttc 24<210> 46<211> 31<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 46atgtgatttc atgtgagcta atagaactta c 31<210> 47<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 47gctgtagcag aaggaaaggc 20<210> 48<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 48ctatccacac agacgggaat g 21<210> 49<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 49ggcccttcaa gtcctttaga atc 23<210> 50<211> 28<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 50gacgtggact ttattgacca tttgttac 28<210> 51
28
CN 109929920 A
序 列 表
9/42页
<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 51gctcttgagt cacgagttca g 21<210> 52<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 52gatagtgcag tcagccaacc 20<210> 53<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 53caatgacaaa ggacaagggg c 21<210> 54<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 54gtctctaaag tgagtctagg atcag 25<210> 55<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 55caggacactt gactgaggta g 21<210> 56<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 56aggggatgat ggagtgtctg 20<210> 57<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
29
CN 109929920 A
序 列 表
10/42页
<400> 57gagaaaagtg acgaagagcc tg 22<210> 58<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 58ctcctctctg tgaactatcc c 21<210> 59<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 59gcatgtggta ggtcattctg g 21<210> 60<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 60gaggtaacac ttaataccct cttgag 26<210> 61<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 61caaggtatgg cttctttgga gg 22<210> 62<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 62cttatgatgt tgtgtcttct gaccac 26<210> 63<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 63ataggaacgc actcaggcag 20<210> 64
30
CN 109929920 A
序 列 表
11/42页
<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 64gaagctgatg taacaccatt gagc 24<210> 65<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 65ccatctgagg tgtagtgctg 20<210> 66<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 66ggcagtccat ttggggattg 20<210> 67<211> 27<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 67gagtaagcac agtgtgaata aagcatc 27<210> 68<211> 33<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 68gttaatgctc acatagaaag gattcttttt aac 33<210> 69<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 69cattttaaga ccaggcacaa tggc 24<210> 70<211> 29<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
31
CN 109929920 A
序 列 表
12/42页
<400> 70gttgtaatca ttatgggatt ctgtaaggc 29<210> 71<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 71ctcagggagt gtccaaagag 20<210> 72<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 72gcatgtggct tcaaagtgcc 20<210> 73<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 73ctggcctgcc tgtcagaaaa c 21<210> 74<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 74ccacgttaaa ccataccact aagc 24<210> 75<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 75ccatcccatc cattttcttc ctg 23<210> 76<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 76gcaaagagac aggaatggca g 21<210> 77
32
CN 109929920 A
序 列 表
13/42页
<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 77cgcaaacgct atcagcaaga ag 22<210> 78<211> 31<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 78ttggtgcagg aagtgttttt tttgtgtttt a 31<210> 79<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 79ggtcctagag aaaaggatgt tacag 25<210> 80<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 80cgatgccctc agtgaagaac 20<210> 81<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 81ggatttccca cagttacgaa gc 22<210> 82<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 82gcagaaatag gaattgctgt ggg 23<210> 83<211> 31<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
33
CN 109929920 A
序 列 表
14/42页
<400> 83atttataatg aatgggcttg tggttgcttt a 31<210> 84<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 84gttactgttt gttgatggag gcaag 25<210> 85<211> 35<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 85gttgttgttc ttaagttaca gtttacagtt ttatg 35<210> 86<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 86attcatgtgt aggctgagca tgg 23<210> 87<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 87ctggccctgt tgttgagttt tg 22<210> 88<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 88cagtgaccac aattccttct gg 22<210> 89<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 89caaggaaagt tcaagcaagc agaaac 26<210> 90
34
CN 109929920 A
序 列 表
15/42页
<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 90ggtggctttt tcctccatag c 21<210> 91<211> 29<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 91catgctgtaa gaagtagtat ctaacaagg 29<210> 92<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 92ctatgggaga gtccaactat gttc 24<210> 93<211> 31<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 93cttaagggac aagatagaaa agattacaga g 31<210> 94<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 94ggtggtgata gtagagattt tagcc 25<210> 95<211> 32<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 95aaaacaaaac aaaacgagaa cataagagca ag 32<210> 96<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
35
CN 109929920 A
序 列 表
16/42页
<400> 96gcttggtcag taggctatgc 20<210> 97<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 97ctggcttctt tagagactat tggac 25<210> 98<211> 31<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 98gaataaaagg gaattctttt ttgtgaggca g 31<210> 99<211> 27<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 99ggcatttatt acgtagaaca actgctg 27<210> 100<211> 31<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 100gatgggtgtt tagtaagttt atcttgttgt g 31<210> 101<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 101gttctggtaa gatgtatcag tgtgc 25<210> 102<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 102ggtgcttcag gagtttgtat gtatg 25<210> 103
36
CN 109929920 A
序 列 表
17/42页
<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 103caagagggat aacagaccta tcag 24<210> 104<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 104taccacctta tccacagcca c 21<210> 105<211> 32<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 105gaatgtgttc tgtgctaaaa tgaatgttat tg 32<210> 106<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 106cctaatctgg gtttaggtct ttgc 24<210> 107<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 107caaacttgag agtgccctta ctg 23<210> 108<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 108caatagccac tctaatgatg gtagc 25<210> 109<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
37
CN 109929920 A
序 列 表
18/42页
<400> 109cttctggtcc atcggaggat 20<210> 110<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 110cttctagttc aagatgacgg tgg 23<210> 111<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 111aacagtggaa caccgaggtc 20<210> 112<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 112ggcttagact gttgtggaag ttag 24<210> 113<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 113tctgcttaca ggcgagtctc 20<210> 114<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 114tgctgaggga ggttgaatgc 20<210> 115<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 115gccattatct tctagattga aagcgg 26<210> 116
38
CN 109929920 A
序 列 表
19/42页
<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 116gcacagaggt attaggaaac gg 22<210> 117<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 117gcagatgtga actccagcag 20<210> 118<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 118gcagagaagg cagaactaaa gc 22<210> 119<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 119gacaaagtct ctgttactga cacc 24<210> 120<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 120gaagcctcca agctatgatt ctg 23<210> 121<211> 30<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 121acttattagt aggtattagg gaagaatgac 30<210> 122<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
39
CN 109929920 A
序 列 表
20/42页
<400> 122gagtgtctgt tcttgtgacc tg 22<210> 123<211> 27<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 123gtttttcaga cctagtacca aatccag 27<210> 124<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 124ccaggagaga atgtaggaag ttag 24<210> 125<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 125cgtccagacc ttcatatttc tactg 25<210> 126<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 126ggaaagaact gcgagcttag c 21<210> 127<211> 31<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 127catctgaagt cttgaaatgg caatgtaaat g 31<210> 128<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 128ccagtcccta ttgtatctcc ac 22<210> 129
40
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序 列 表
21/42页
<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 129ggctcttcta ccatcattcc tc 22<210> 130<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 130ggacagtgag agacttcagt atg 23<210> 131<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 131gtttcgtatc cacagtagag gtc 23<210> 132<211> 28<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 132gattctgtcc ttttgtctta gtgatgag 28<210> 133<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 133cttcgacagt gcctgaacag 20<210> 134<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 134gagtgcctct ctaaggagtt g 21<210> 135<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
41
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序 列 表
22/42页
<400> 135ctcgcaacgt aagcactgga 20<210> 136<211> 30<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 136gcaaatgaac ctctaataat cagtgttgac 30<210> 137<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 137caagagcaca gcagtgatga aaac 24<210> 138<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 138gacttctcca ttccataacc ctg 23<210> 139<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 139gattcagtcc ttgttgctct agg 23<210> 140<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 140gcagaaggag cgtcaaaaac tg 22<210> 141<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 141caggtgctga gaaatggagt g 21<210> 142
42
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序 列 表
23/42页
<211> 29<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 142gctcatctca gagttaaggt atatctttc 29<210> 143<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 143gttttggagc attttccctc cattc 25<210> 144<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 144gttgagggat aggagctgag 20<210> 145<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 145actgggccca ttccttaacc 20<210> 146<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 146taccatctca cgcgagtcag 20<210> 147<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 147ccccatggac aggaataatg ag 22<210> 148<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
43
CN 109929920 A
序 列 表
24/42页
<400> 148gagacacaac aacaaacttt gggc 24<210> 149<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 149ccagaaagat ctcaaatcgt cacc 24<210> 150<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 150gacttagact gccacgcaat ag 22<210> 151<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 151ccctgcaaca gctcctgaaa t 21<210> 152<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 152gaaacacgtg ggaaaacacc c 21<210> 153<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 153aaggcctaaa gtgaacccca g 21<210> 154<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 154ggggagaaat gcagcatcca t 21<210> 155
44
CN 109929920 A
序 列 表
25/42页
<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 155aaggaagagc agtgagccca 20<210> 156<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 156cttcagcttt ctcccactgt attg 24<210> 157<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 157ccaaaggtca gtgggattgt aac 23<210> 158<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 158cttaggtagt ttcagttgtg tagagg 26<210> 159<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 159gcagtatgcg taagtcaagg g 21<210> 160<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 160gggggtggct gattattatt gg 22<210> 161<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
45
CN 109929920 A
序 列 表
26/42页
<400> 161gcatagcagg cattagccag 20<210> 162<211> 29<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 162gcagagtaca agagtgttta tcattgttg 29<210> 163<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 163gctatttgtc ttcccacaca gg 22<210> 164<211> 28<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 164gcttcaaagt gctctcataa agattgtg 28<210> 165<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 165atcaaagatt gtcactggcc tcc 23<210> 166<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 166gagagagaca ccaaagggaa g 21<210> 167<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 167cattctttcc cagagccctc 20<210> 168
46
CN 109929920 A
序 列 表
27/42页
<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 168ggctaagggt ggatagagag 20<210> 169<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 169aggtagaaga cggcgaacca 20<210> 170<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 170gaccagcact gtccaataca c 21<210> 171<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 171cttgcacaaa gtaacataga tggtcc 26<210> 172<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 172taccagacga tgaggatgta gtg 23<210> 173<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 173ttagaagtgg ggatggggtg 20<210> 174<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
47
CN 109929920 A
序 列 表
28/42页
<400> 174cacatagtcg cccaggaaat g 21<210> 175<211> 27<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 175gttacgagcc cattattggg aaaaatg 27<210> 176<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 176tttagagctg atgaagcctc tgc 23<210> 177<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 177gaggagaatg aggttatccc c 21<210> 178<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 178gagttcttta ctggaatgtg cgg 23<210> 179<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 179taatcagcac ccaggagcct 20<210> 180<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 180tcctctcgga gcctgaaagt 20<210> 181
48
CN 109929920 A
序 列 表
29/42页
<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 181catacctgtc tatgaagtgt aggc 24<210> 182<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 182gtttgaaatg agcaggcact cc 22<210> 183<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 183agtagaaggt caaagggcca c 21<210> 184<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 184aagccacttg ggaagaaggc 20<210> 185<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 185agcccccatt acacctcttt g 21<210> 186<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 186gagaaaccgt ggagagagag 20<210> 187<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
49
CN 109929920 A
序 列 表
30/42页
<400> 187gactaaaacc caaaggcgtg ttc 23<210> 188<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 188aagccaccac cagtttgtca c 21<210> 189<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 189gacccttgct ttcaatgctg c 21<210> 190<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 190tcttgctgcc cagtttctgc 20<210> 191<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 191tgaagaagag ctggaccgtg 20<210> 192<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 192gaatcatagg taggggtgag g 21<210> 193<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 193ctaagggtac gttactactg tgc 23<210> 194
50
CN 109929920 A
序 列 表
31/42页
<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 194gagtgtggaa aacaagttgc agaac 25<210> 195<211> 28<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 195cttggccagg atgtattacc tttataac 28<210> 196<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 196cgtgctgagt ttgctgagag 20<210> 197<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 197gttggtaact gccatccacc 20<210> 198<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 198gaaagaagca caacttgaag ctgaag 26<210> 199<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 199tgccttgaga ccagtacagc 20<210> 200<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
51
CN 109929920 A
序 列 表
32/42页
<400> 200ccttgaggat acctgttctt ttcag 25<210> 201<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 201cgtagagtat gaagatgaga gtgg 24<210> 202<211> 30<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 202ttggtttagt tcctttgcta tcatttagac 30<210> 203<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 203ggaattgcta cataacttca tggtcc 26<210> 204<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 204ctgtcgggat tagaaagcct g 21<210> 205<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 205gatacctgcc ataagaggga ag 22<210> 206<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 206cacagtatct ggaggaggaa c 21<210> 207
52
CN 109929920 A
序 列 表
33/42页
<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 207cgggataagg tagtggtaag ataac 25<210> 208<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 208ccttttgtag gtcagattat ccacag 26<210> 209<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 209ccgttgcctt gaccactttt c 21<210> 210<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 210caaagttcta tccacacatt gggc 24<210> 211<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 211tccttggctc acacccttac 20<210> 212<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 212atggaaatgg gggcagaaca c 21<210> 213<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
53
CN 109929920 A
序 列 表
34/42页
<400> 213tgaggagatg ggtggcttgt 20<210> 214<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 214ctggcagggg aggtcaaaat 20<210> 215<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 215tcacactcca gccgtctctt 20<210> 216<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 216gttcctaaga gggcatggat g 21<210> 217<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 217ggaaatgacc aaccaccaga aaaaac 26<210> 218<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 218gattagttca cggaccagac atag 24<210> 219<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 219gagagcctac taaaaagccc ag 22<210> 220
54
CN 109929920 A
序 列 表
35/42页
<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 220cgcagaacac cagagagatg 20<210> 221<211> 35<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 221gttgttgttc ttaagttaca gtttacagtt ttatg 35<210> 222<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 222cctatgtggt tactttgagg ttttgg 26<210> 223<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 223gtgtttgctc ttgtcagttt cttgg 25<210> 224<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 224cctggcctcc tattgttgag t 21<210> 225<211> 27<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 225gtgtaccagg attcattgtt tcacatc 27<210> 226<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
55
CN 109929920 A
序 列 表
36/42页
<400> 226gttcatcctt tccctgccac 20<210> 227<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 227cctgagggaa ctggcatgat a 21<210> 228<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 228cagaatgatg tgactggtgg taac 24<210> 229<211> 23<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 229cttcagactt tacacaacct gcg 23<210> 230<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 230gagtgctgag attgattctg atgac 25<210> 231<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 231gtcttttggg gagagtggtc 20<210> 232<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 232cgcaaacgct atcagcaaga ag 22<210> 233
56
CN 109929920 A
序 列 表
37/42页
<211> 24<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 233ctagagaagc aagcaagaat ggtc 24<210> 234<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 234gattgaaggt gcaagccacc 20<210> 235<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 235ggtcctagag aaaaggatgt tacag 25<210> 236<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 236gggtcatcag gaagaactgc 20<210> 237<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 237cattctggag ttccttgagt gg 22<210> 238<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 238caactgtcct gctctttgaa gc 22<210> 239<211> 26<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
57
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序 列 表
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<400> 239ctaggttggt agttcttgga atgtag 26<210> 240<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 240ttcctggaga agagaggctg 20<210> 241<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 241agagagaggc ggagacctta 20<210> 242<211> 25<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 242gtttccagac tctctttcaa tgctg 25<210> 243<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 243ccaacagtga ctccgtcaag 20<210> 244<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 244caccccagac tgtggctttt a 21<210> 245<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 245actgaatgtc cccttggctc 20<210> 246
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序 列 表
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<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 246tagaaggtga gcggtcactg 20<210> 247<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 247cacctcattt agttcgtgcg ag 22<210> 248<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 248ctgcccggca ttattcagag 20<210> 249<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 249ctttcaggag ccaggattcc 20<210> 250<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 250ggaccttgaa tcccaccttg t 21<210> 251<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 251atcctgccat caccatccac 20<210> 252<211> 33<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）
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序 列 表
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<400> 252gaaagttctc ctctgtgttt gtctctagtt tgg 33<210> 253<211> 41<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 253ccctgccccg gttcatcctg atggagctca tggcgggggg a 41<210> 254<211> 41<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 254tccccccgcc atgagctcca tcaggatgaa ccggggcagg g 41<210> 255<211> 21<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 255ggccctactg ccctgtgtgt c 21<210> 256<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 256caactggcag aaaccagccc gt 22<210> 257<211> 45<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 257tctcgggcca tcccgaagtc tgcaatcttg gccactcttc caggg 45<210> 258<211> 45<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 258ccctggaaga gtggccaaga ttgcagactt cgggatggcc cgaga 45<210> 259
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序 列 表
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<211> 27<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 259gccacttaga attcctgagt actgagg 27<210> 260<211> 16<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 260ccgccatgag ctccat 16<210> 261<211> 22<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 261ccaccagaac attgttcgct gc 22<210> 262<211> 18<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<220><221> misc_feature<222> (18)..(18)<220><221> misc_feature<222> (18)..(18)<223> 3-phos<400> 262gctccagcag gatgaacc 18<210> 263<211> 19<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<400> 263gaagagtggc caagattgc 19<210> 264<211> 16<212> DNA
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<213> 智人（Homo sapiens）<400> 264cggaggggtg aggcag 16<210> 265<211> 20<212> DNA<213> 智人（Homo sapiens）<220><221> misc_feature<222> (20)..(20)<223> 3-phos<400> 265gccaagattg gagacttcgg 20
序 列 表
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说 明 书 附 图
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图1
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说 明 书 附 图
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说 明 书 附 图
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图4
图5
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图6
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