中性粒细胞相关实验方
法
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常用中性粒细胞分离方法(外周血、骨髓提取均可)
(一)Percoll非连续密度梯度离心法(张灿老师课题组使用方法)
优点:Percoll的主要成分是硅石胶,对中性粒细胞的化成成分和活性无影响。回收率高,存活率高。
缺点:可能会有部分红细胞分离不干净,影响不大。
(二)Ficoll-Hypaque密度梯度离心法
优点:回收率高和percoll差不多。
缺点:由于Ficoll结构中的长链烃组成具有LPS样作用,因此在分离过程中,会对中性粒细胞有激活作用。 (三)Dextran作用下红细胞自然沉降法
优点:能够完全分离红细胞 缺点:回收率最低
(四)裂解红细胞法
优点:能够完全分离红细胞 缺点:回收率低
纯度、回收率和存活率检测方法
纯度:瑞吉染色 存活:台盼蓝计数
回收:分离后(计数)/分离前(血常规检测)
Percoll非连续密度梯度离心法(张灿老师实验室的方法)和培养
备注:使用外周血或骨髓提取都是可以的,一般来说,外周血每1ml能够提取1*10^6 cell,数量比较少,如果骨髓提取,一只小鼠约能提取1*10^7 cell。 外周血和骨髓提取除了来源不一样,分离方式是相同的。
1.试剂耗材:
percoll原液(pharmacia or sigma) 10*PBS RPIM1640培养基 2.溶液配制
(1)用percoll原液和10*PBS按照9:1的比例(v/v)配成混合液,定义为100%percoll。
(2)用1*PBS和100%percoll 配置55%和65%的percoll。(溶液配制均在无菌环境下操作) 3.分离步骤
(1)小鼠酒精浸泡消毒。
(2)小鼠颈椎脱臼处死,立即切下其后肢的胫骨和股骨,并分离除去所有组织、皮肤。将胫骨和股骨浸泡在不含有血清的RPIM1640培养基中。 (3)剪短胫骨股骨两端,用1ml注射器想胫骨股骨中吹灌不含有血清的RPIM1640培养基重悬得到骨髓细胞重悬液,一直吹到骨片泛白为止。 (4)将含有骨细胞的RPIM1640培养基4000rpm离心3分钟。 (5)用RPIM1640培养基重悬得到骨髓细胞。(2ml)
(6)取一个新离心管,加入2ml65%percoll分离液,再加入2ml55%percoll分离液,最后加入2ml骨髓细胞液。(缓慢不要破坏溶液界面)
(7)2500rpm离心30分钟。吸取55%和65%交界面,加入1*PBS,1000rpm离心3分钟,弃上清,重复3次。
(8)用RPIM1640培养基重悬得到小鼠骨髓中性粒细胞悬浮液。
注意:
(1)中性粒细胞为终末细胞,不可传代寿命短。 (2)张老师组一般细胞和药物共同富裕1小时。 (3)3-4小时以内,细胞状态都比较好。
PS:也可以用45%55%80%三层分离,500 g离心30分钟,弃上清和55%以上部分,下午55-80%交界面。加入1倍体积的1*PBS,200g离心3分钟,。。。后同。
人血浆提取问题
1.新鲜血液,中性粒细胞寿命较短。 2.采学后,用EDTA抗凝处理。
3.具体需血量根据需求来定:每1ml血=1*10^6 cell。 文献说如果做wb,大约要30 ml血液。
后续的一些实验方法
1.中性粒细胞tranwell药物趋化实验 (1)分离中心粒细胞,测定细胞数
(2)transwell小室下室加600ul的趋化因子+无血清培养液 (3)上室加入100ul细胞+无血清培养液 (4)孵育2小时
(5)拿出小室,将上室取出放新的孔内,先将膜上细胞擦去后,再予以离心,将膜下粘附细胞离心至下室,然后予以CCK8间接测定细胞。 (6)会有细胞掉到下室,有文献是分开固定计数的。
2.中性粒细胞株
只有中性粒前体细胞的细胞株,然后诱导分化得到中性粒细胞。 HL60. NB4均可。
3.流式检测凋亡
检测和材料接触后凋亡情况
用Annexin v 和PI双染,分离后直接标记,标记后应立即检测
4.瑞氏染色
有染色试剂盒,按照说明书操作即可。
5.尾静脉回输观察
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