AMFR和C-Met在非小细胞肺癌组织中的免疫组织化学表达及其与肿瘤增殖

CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY

中国组织化学与细胞化学杂志

Vol.26.No.5October.2017

AMFR和C-Met在非小细胞肺癌组织中的免疫组织

化学表达及其与肿瘤增殖活性的关系

张祖华1，李鸣2，董利民2 ，江兴堂3*

(1萍乡市人民医院，萍乡 337000；2湘雅萍矿合作医院，萍乡 337000；3厦门大学附属中山医院，厦门

361000)

〔摘要〕目的 通过研究非小细胞肺癌组织中自分泌运动因子受体（autocrine motility factor receptor, AMFR）与肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor, HGF-R/C-Met）的表达，探讨二者与临床病理特征的关系及其与肿瘤细胞增殖活性的关系。方法 采用SP法免疫组织化学检测肿瘤组织中AMFR、C-Met和PCNA的表达，并计算增殖细胞核抗原指数（PCNA Index，PI）。结果 AMFR表达的总阳性率为54.1%，其中，低分化组AMFR阳性表达率明显高于中-高分化组；有淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组阳性表达率。C-Met的阳性率为61.3%，其中，低分化肿瘤组织中C-Met阳性表达率明显高于中-高分化组；有淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组阳性表达率；TNM分期I-IIIA期中C-Met阳性表达率为53.7%显著低于IIIB-IV组阳性表达率。此外，AMFR与C-Met的表达率呈显著正相关，AMFR、C-Met阳性表达组的PI值明显高于阴性组。结论 AMFR、C-Met两者可能在非小细胞肺癌的发展、转移中起着重要的作用。

〔关键词〕非小细胞肺癌；自身分泌活动因子受体；肝细胞生长因子受体；细胞增殖

〔中图分类号〕R73-37 〔文献标识码〕A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 008

Immunohistochemical expressions of AMFR and C-Met in non-small cell lung cancer

and their relationship with tumor proliferative activity

Zhang Zuhua1, Li Ming2, Dong Limin2, Jiang Xingtang3*

（1Pingxiang People’s Hospital, Pingxiang 337000, China; 2Xiangya Pingkuang Hezuo Hospital, Pingxiang 337000, China;

3

Zhongshan Hospital XiamenUniversity, Xiamen 361000）

〔Abstract〕Objective To study the expression of autocrine motility factor receptor (AMFR) and hepatocyte growth factor re-ceptor (HGF-R/C-Met) in non-small cell lung cancer (NSCLC). The relationship between the expressions and cancer clinicopathologic features as well as proliferative activity was also explored. Methods The expressions of AMFR, C-Met and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in tumor tissue specimens were examined using S-P immunohistochemistry. The PCNA Index (PI) was calculated. Results The expression of AMFR highly correlated with C-Met. The overall positive rates were 54.1% (AMFR) and 61.3% (C-Met) in all investigated cases, where patients with poorly differentiated tumor cells and lymph node metastasis had significantly higher positivi-ty than those with well differentiated cells and clean lymph nodes. C-Met expression was also found to correlate with TNF classification where its positive rate was 53.7% and 82.8% in I-IIIA and IIIB-IV respectively. The PCNA Indexes were significantly higher in AMFR and/or C-Met positive tumors than those negative ones. Conclusion The expression of AMFR and C-Met had strong correlation with clinicopathological features and tumor cell proliferation which may suggest they play an important role in the progression and metas-tasis of the cancer.

〔Keywords〕Non small-cell lung cancer; autocrine motility factor receptor; hepatocyte growth factor receptor; cell proliferation

在我国，肺癌发病率及死亡率均迅速增长，生存率仅约10%，大多数患者死于后期肿瘤的复发和转移。恶性肿瘤的复发、浸润及转移与肿瘤细胞运

动能力是呈正向关系的[1]。因此，寻找与肿瘤细胞增殖、运动相关的作用靶点，已成为肿瘤研究的热点。

作为与细胞运动相关的重要细胞因子受体，自分泌运动因子受体（autocrinemotility factor receptor, AMFR）和肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor, HGF-R/C-Met）在肿瘤的恶性演进、侵袭转移及预后均起了重要的作用。目前国内外还未见有AMFR联合C-Met在非小细胞肺癌(non small

〔收稿日期〕2017-03-12 〔修回日期〕2017-09-25〔作者简介〕张祖华,男（1984年），汉族，主治医师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：xmzsjxt@163.com

476中国组织化学与细胞化学杂志

第26卷

cell lung carcinoma, NSCLC) 上表达的报道。本实验通过免疫组织化学方法检测上述两者在非小细胞肺癌组织中的表达，着重讨论二者与非小细胞肺癌的病理组织学分级、肿瘤TNM分期及淋巴结转移间的相关性，探讨其是否参与非小细胞肺癌的发展、浸润及转移。与此同时，通过检测、计算肿瘤细胞增殖活性相关指标，讨论上述两个细胞因子与肿瘤细胞增殖活性的关系，以揭示两者作为肺癌治疗靶点的潜在价值。

材料和方法

1 标本

收集厦门大学附属中山医院病理科2009-2012年间手术切除的非小细胞肺癌病例存档蜡块共计111例,术前均未接受任何治疗；其中男性75例，女性36例；中位年龄为62岁（33~82岁）；有无吸烟史的分别是62例和49例，肿瘤大小大于3cm及小于或等于3cm的分别有60例和51例。经病理学诊断，鳞状细胞癌39例，腺癌57例，其他类型（包括表皮粘液样癌、腺鳞癌等）15例；低分化癌23例，中-高分化88例；TNM 分期根据2009年UICC修订版，基于肿瘤复发及转移的概率以及与预后的关系，将肿瘤的分期分为两组，其中I-IIIA期82例，IIIB-IV期29例；有淋巴结转移58例，无淋巴结转移的为53例。2 免疫组织化学染色

浓缩型兔抗人AMFR多克隆抗体 (ab 76841) 购自Abcam公司，工作浓度为（1:200）；即用型兔抗人C-Met（ZA-0412）试剂购自北京中杉金桥，即用型兔抗人PCNA试剂购自福州迈新公司；S-P免疫组织化学试剂盒及DAB试剂盒购自福州迈新公司。非小细胞肺癌组织常规石蜡包埋，4μm厚连续切片4张，采用S-P法进行AMFR和C-Met免疫组织化学染色，主要步骤如下：常规脱蜡，水化； 85℃抗原修复过夜，3% H2O2消化内源性过氧化物酶；10%羊血清封闭；一抗4℃冰箱过夜；二抗，室温孵育30min；DAB镜下控制染色，流水冲10min；苏木素核复染；脱水、透明、封片、观察。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照，用以证实含有靶抗原阳性切片作为阳性对照。3 结果判定

AMFR[2]以癌细胞内出现明确的胞膜或胞质着

棕黄色为阳性，阳性百分率<10%为阴性（-），10%~50%为阳性（+），≥50%为强阳性（++），只计数癌细胞，不计数非癌组织。C-Met[3]阳性染色判断：不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深棕黄色为3分，染色范围：阳性细胞数<30%为1分，≧30%为2分，以染色深度与阳性细胞的百分比乘积为判定标准，0-1分为（-），2-3分为（+），4-6分为（++）。增殖细胞核抗原指数（PCNA Index, PI）的计算：低倍镜下选取肿瘤细胞丰富的区域，连续观察10个高倍镜视野，计算每个高倍镜下100个肿瘤细胞中PCNA阳性细胞核数，取其平均值。4 统计学方法

应用SPSS17.0统计分析软件，采用x2检验、Fisher确切概率法、AVONA方差分析及Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义，以P＜0.01为差异有极显著统计学意义。

结 果

1 AMFR表达率与NSCLC的分化程度和淋巴结转移相关

免疫组织化学染色显示，AMFR阳性免疫反应产物主要位于肿瘤细胞胞质及胞膜上（图1），且跟具体肺癌病理分型无关。AMFR在NSCLC中的表达与临床病理特征的关系如（表1）：AMFR的阳性表达为33例，强阳性表达为27例，总阳性率为54.0%（60/111）；其中，低分化组阳性表达率（78.3%）明显高于中-高分化组（47.7%）；有淋巴结转移组阳性表达率为75.9%，明显高于无淋巴结转移组阳性表达率30.2%；AMFR的表达与患者年龄、性别、抽烟史、肿瘤大小、组织学类型及TNM分期无关。2 C-Met表达率与NSCLC的分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关

S-P法免疫组织化学染色显示，C-Met主要表达于肿瘤细胞胞质中（图2），且上述染色在不同肺癌病理分型中无明显差别。C-Met在NSCLC中的表达及与临床病理特征的关系（表1）：C-Met的阳性表达为46例，强阳性表达为22例，总阳性率为61.3%（68/111）。在分化程度不同的非小细胞肺癌组织中，C-Met阳性表达存在差异：低分化肿瘤组织中，C-Met总阳性表达率为73.9%（17/23），而在中-高分化组中，阳性表达率58.0%（51/88）；

第5期张祖华等.AMFR和C-Met在非小细胞肺癌组织中的免疫组织化学表达及其与肿瘤增殖活性的关系 477

I-IIIA期中阳性表达率为53.7%（44/82）低于IIIB-IV期阳性表达率为82.8%（24/29）；在111例NSCLC患者中，无淋巴结转移的共有53例，其中，C-Met

阳性表达率37.7（20/53），低于有淋巴结转移组中的表达率82.8%（48/58）。C-Met的表达与年龄、性别、吸烟史、肿瘤大小及组织学类型无关。

图1 AMFR在非小细胞肺癌（鳞癌）组织中的免疫组织化学表达。B，A中方框内放大图像；比例尺，100μm

Fig. 1 Immunohistochemical examination of NSCLC (squamous cell carcinoma) tissue. A, expression pattern of AMFR; B, enlarged image inside the box from A; scale bar, 100μm

表1 NSCLC组织中AMFR和C-Met的表达与临床病理特征的关系

Tab. 1 Relationship between the expressions of AMFR and C-Met in NSCLC tissues and tumor clinicopathological characteristics

临床病理特征

Clinicopathologicalcharacteristics

性别年龄抽烟史肿瘤大小

男女＞55≤55有无＞3≤3腺癌

病理学类型

鳞癌其他

分化程度TNM分期淋巴结转移

低中-高I-IIIAIIIB-IVN0N1-N3

-3318371426252229291575464383714

AMFR表达

+2492211211221121416382522111320

++18923415121710148510171710324

8.3255.43429.505

＜0.05＞0.05＜0.01

4.054

＞0.05

χ20.6012.7241.3034.530

P>0.05＞0.05＞0.05＞0.05

C-Met表达-2914291424191924231556373853310

+3016379242226202615573931151828

++1661661481578951012139220

10.2408.17630.651

＜0.01＜0.05＜0.01

3.266

＞0.05

χ20.3841.9630.7933.567

P＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

图2 C-Met在非小细胞肺癌（腺癌）组织中的免疫组织化学表达。B，A中方框内放大图像；比例尺，100μm

Fig. 2 Immunohistochemical examination of NSCLC (squamous cell carcinoma) tissue. A, expression pattern of C-Met; B, enlarged image inside the box in A; scale bar, 100μm

478中国组织化学与细胞化学杂志

第26卷

3 AMFR和C-Met表达与NSCLC细胞增殖活性呈正相关

PCNA是评价细胞增殖状态的重要指标，与细胞增殖周期有关[4]。免疫组织化学检测显示，PCNA定位于NSCLC（鳞癌和腺癌）细胞核，阳性染色为

细胞核出现棕黄色颗粒（图3）。对增殖细胞核抗原指数与AMFR和C-Met的表达强度的关系分析显示，AMFR和C-Met的表达与NSCLC细胞的增殖均呈显著正相关（表2）。

图3 PCNA在非小细胞肺癌组织中的免疫组织化学表达。A，鳞癌；B，腺癌；比例尺，100μm

Fig. 3 Immunohistochemical examination on the expression of PCNA in NSCLC tissue. A, squamous cell carcinoma; B, adenocarcinoma; scale bar，100μm.

表2 AMFR和C-Met表达与PI的相关性

Tab. 2 Correlation between PI value and the expressions of AMFR and C-Met in NSCLCAMFR表达

-+++

例数513327

PI值31.5±14.656.7±11.975.7±8.1

＜0.01P

C-Met表达

-+++

例数434622

PI值36.1±20.857.4±16.961.9±21.6

＜0.01P

4 NSCLC中AMFR与C-Met表达之间呈正相关

在111例NSCLC 中，AMFR及C-Met均呈强阳性表达的有16例，均呈阳性表达的有22例，两者同时阳性表达率约34.2%，两者阳性表达率成显著正相关（表3）。

表3 在NSCLC 中AMFR和C-Met表达间的相关性Tab. 3 Correlation between AMFR and C-Met expressions in

NSCLC

AMFR表达

-+++

C-Met表达-3850

+132211

++0616

0.742

< 0.01

r

P

改变刺激下，通过自身结构的改变，如片状伪足的形成增强自身的运动能力，众多的运动因子或调节因子在肿瘤细胞运动过程中发挥了重要的作用[1]。近几年来，随着分子生物学与基因组学的迅猛发展，关于恶性肿瘤越来越多的未知区域被得以发现与证实。各种与细胞运动相关的细胞因子及其受体大致可分为3类：①刺激细胞运动与浸润的因子，包括迁徙刺激因子、自分泌运动因子（autocrinemotility factor，AMF）等；②刺激细胞生长与运动的因子，包括肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）等；③促进运动而抑制生长的因子，如转化生长因子(transforming growth factor，TGF)和干扰素等。自分泌运动因子受体（AMFR），又被称为gp78，其通过与其配体AMF结合，激活其藕联的G蛋白，随后由蛋白激酶C（Protein Kinases C PKC）、酪氨酸激酶、12-脂氧合酶等介导信息传递，刺激肌醇代谢，短时间内可见肿瘤细胞外形发生改变，胞膜凹凸不平，伸出伪足从而促进细胞的运动。与此同

讨 论

肺癌与其他恶性肿瘤一样，其发病与进展是一个多因素、多阶段的复杂的过程，无数的细胞因子及其受体参与到这个复杂过程中来。肿瘤细胞在多种促运动相关因子或调节因子作用下，在外界微环境

第5期张祖华等.AMFR和C-Met在非小细胞肺癌组织中的免疫组织化学表达及其与肿瘤增殖活性的关系 479

时，AMF/AMFR还可以通过刺激间叶细胞向上皮内皮细胞转变，促进肿瘤细胞的生长及维持肿瘤的恶性增殖[5]。C-Met于1991年被识别，是原癌基因C-Met的编码蛋白，属于受体酪氨酸蛋白激酶家族成员，为HGF的上皮特异性受体，可调控一种“侵袭性生长”的遗传程序，参与许多生理发育过程以及肿瘤的侵袭和转移[3]。因此，在肿瘤细胞迁移运动过程中，AMF与HGF被认为是极其重要的细胞因子成分，两者能分解包括丝氨酸酶、肝素酶及金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-9从而提高肿瘤细胞的运动能力以实现细胞的转移[6]。因此，对上述两细胞因子在细胞表面的细胞受体（AMFR、C-Met）展开相关研究，从而为寻找到更有效的抑制肿瘤运动与转移的作用靶点打下铺垫。

本研究检测到，低分化NSCLC组织的AMFR阳性表达率显著高于中-高分化组，有淋巴结转移的NSCLC组织AMFR阳性表达率明显高于无淋巴结转移者，表明分化程度越差的肿瘤组织，肿瘤细胞活动能力可能会更强，从而导致肿瘤发生早期淋巴结或远处转移。本研究还通过将AMFR蛋白的表达与肿瘤增殖活性相联系起来，结果表明AMFR阳性表达组中PI值显著高于阴性表达组，证实其与肿瘤细胞的增殖活性密切相关，由此进一步提示AMFR对细胞增殖可能具有正向调控作用，其机制可能为AMFR与其配体结合后，使MAPK信号通路里两个重要成分MEK1、MEK2发生磷酸化，从而激活整个MAPK信号通路，并且上调肿瘤细胞cyclin D1及细胞周期素依赖性激酶表达，同时抑制细胞周期素依赖性激酶的抑制物P27kip1活性，从而促进肿瘤细胞从G1进入S期[7]。另外，AMF/AMFR还可通过下调凋亡蛋白刺激因子（apoptotic protease activating factor-1，Apaf1）和Caspase-9来强化细胞凋亡抑制以达到促使细胞恶性增殖，且涉及到PKC/MAPK、PI3K等复杂的信号传导途径[8]。

我们的研究也发现，在分化程度不同的肺癌组织中，C-Met阳性表达存在差异，其中，低分化肿瘤组织中，C-Met阳性表达率也高于中-高分化组，TNM分期I-IIIA期阳性表达率低于IIIB-IV期。在111例NSCLC患者中，无淋巴结转移C-Met阳性表达率37.7%（20/53）较有淋巴结转移组中的表达率82.8%（48/58）低。与此同时，本实验中还通过

比较C-Met阴性及阳性表达组中PI值发现，C-Met阳性表达组中肿瘤细胞PCNA的阳性表达程度更强烈，说明染色体处于分裂期的肿瘤细胞肿瘤数目更多，其恶性程度亦越高，可说明C-Met可能与肺癌细胞的增殖及分化密切相关。有报道称HGF通过激活核转录因子κΒ（NF-κΒ）来调控细胞增殖，通过MAPK级联反应使转录细胞因子（如ETS1、ATF2）磷酸化，上调细胞周期素CyclinD1,启动相应核基因的表达,调控细胞周期,引起细胞增殖[9]。

实验结果还表明，一方面，AMFR、C-Met在NSCLC组织中的阳性表达率呈显著正相关，另一方面，通过计算肿瘤增殖指数发现AMFR、C-Met的表达均与肿瘤细胞的增殖活性密切相关，可推测出两者在促进肿瘤细胞增殖方面存在某种其他联系，这种联系需要更深入的实验加以证实。此前，通过在舌癌组织中[1]进行免疫组织化学及生存分析证实，舌癌患者中AMFR、C-Met同时阳性表达的无病生存时间比两者其中之一阳性表达的生存时间更短，反映出两者间可能存在协同作用而促进肿瘤细胞的侵袭与转移，显示两者作为肿瘤分子标记物对评估恶性肿瘤患者的预后存在相当大的价值。Jia[10]等的实验证明，HGF/C-Met及AMF/AMFR途径有着共同的下游信号，即Rho信号系统，并通过刺激Rho系统激活MAPK、AKT/PKB等复杂的信号途径，促使肿瘤细胞伪足的形成，增强肿瘤细胞的运动能力。在国内，王伟等[11]采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）在半定量水平检测25例原发性肝细胞癌及对应的癌旁组织中的AMFR和RhoC mRNA的表达，结果发现AMFR与RhoC蛋白的过表达可促进肝癌细胞的浸润与发展，推测AMFR与Rho信号系统在恶性肿瘤的发生、发展过程中存在某种协作的关系，这与前面文献中的表述是一致的。

参 考 文 献

[1] 彭亦良，梁后杰. 癌细胞运动与迁移的分子机制. 中国生

物化学与分子生物学报，2006，22（10）：794-798.[2] Endo K, Shirai A, Furukawa M, et al. Prognostic value

of cell motility activation factors in patients with tongue squamous cell carcinoma. Hum Pathol, 2006, 37(8): 1111-1116.

[3] 高霞，刁路明，李恒，等.非小细胞肺癌中肝细胞生长

因子受体蛋白表达及其与肿瘤细胞增殖、血管生成的关

480中国组织化学与细胞化学杂志

第26卷

系.武汉大学学报（医学版），2005，26（3）：273-276.[4] 黄志伟，蔡雪彦. P53、PCNA、ki67在大肠癌中的表达

与临床意义. 中国组织化学与细胞化学杂志，2013，22（6）：508-512.

[5] Iiizumi M1, Liu W, Pai SK, et al. Drug development against

metastasis-related genes and their pathways:a rationale for cancer therapy. Biochem Biophys Acta, 2008, 1786(2):87-104.

[6] Liu XD, Yao WQ, Newton RC, et al. Targeting the c-MET

signaling pathway for cancer therapy. Expert Opin Investig Drugs, 2008, 17(7): 997–1011.

[7] Haga A, Funasaka T, Deyashiki Y, et al. Autocrine motility

factor stimulates the invasiveness of malignant cells as well as up-regulation of matrix metallo proteinase-3 expression via a MAPK pathway. FEBS Letters, 2008, 582(13): 1877-1882.

[8] Fairbank M, St-Pierre Nabi IR. The complex biology

pfautocrine motility factor/phosphoglucoseisomerase(AMF/PGI) and its receptor, the gp78/AMFR E3 ubiquitin ligase. Mol Biosyst, 2009, 5(8): 793-801.

[9] Sierra JR. C-MET as a potential therapeutic target and

biomarker in cancer.TherAdv Med Oncol, 2011, 3(1suppl): S21–S35.

[10] Jia Z, Vadnais J, Lu ML, et al. Rho/ROCK-dependentpseudopodial protrusion and cellular blebbing are regulated by p38 MAPK in tumour cells exhibiting autocrine c-Met activation. Biol Cell, 2006, 98(6): 337-351.[11] 王伟，杨连粤，杨治力，等.自分泌运动因子受体和

RhoC基因在肝细胞癌侵袭转移中的作用. 中华肝胆外科杂志，2004，10（06）：408-410.