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烫伤大鼠早期小肠内热休克蛋白70表达的研究

2024-04-15 来源:乌哈旅游
・18- 中华损伤与修复杂志(电子版)2010年第5卷第6期Grin J u旷y Repair andWound .论著. 烫伤大鼠早期小肠内热休克 蛋白7O表达的研究 吴勇 刘群赵永健 作者简介:吴勇,男,1982年生,天津医科大学在读硕士研究生,现在天津烧伤研究所参与天 津市卫生局科研攻关项目。研究方向:吸入性损伤。 【摘要】 目的法探索大鼠烫伤早期小肠内热休克蛋白70(HSP70)的表达规律及临床意义。方 大 将30只健康Wistar大鼠分为6组:烫伤后2 h.8 h、24 h、3 d.7 d和正常对照组。各组大鼠分别 取小肠标本,HE染色观察组织结构变化,免疫组化染色结合图像分析测定HSPT0的表达。结果鼠烫伤后各组小肠组织HSP70的表达均迅速增加,与正常对照组比较差异均有统计学意义(P< 0.05);烫伤大鼠早期HSP70在小肠表达强弱与其病理损伤评分成正相关关系(rs=0.943/1.000,P< 0.05)。结论指标。 大鼠烫伤后组织器官内HSPT0的表达情况在一定条件下可以作为判断其损伤程度的 【关键词】烧伤;热休克蛋白质类;免疫组化 Expression of heat shock protein 70 in intestines of the scalded rats during early postburn stage y0 ,HU Qua,ZHAO Yong-jian.Graduate School of Tianifn Medical Corresponding author:LIU QMn,Email:TJDSYY@yahoo.eom.cn e ,Tianjin 300070,China 【Abstract】 Objective To explore the rule of the expression of heat shock protein 70(HSPT0)in intestines of the scalded rats during early postburn stage and to estimate the clinical effects.Methods All the 30 Wistar rats were divided into 2 h,8 h,24 h,3 d,7 d and control groups at random.Rats were sacri— irced and intestines were taken out at each define time.The change of tissue structure was observed with HE staining method.The expression of HSP70 was examined with Envision two stage immunohistochemical meth— od and image analysis technique.Results The expression of HSPT0 in postburn groups in intestines was higher than control roup(P<0.05).Tghe expression of HSP70 was closely related to the level of damage in intestines(r :0.943/1.000,P<0.05).Conclusions The expression of HSPT0 may be an index to esti- mate the damage degree of tissues and organs to a certain condition. 【Key words】 Burns;Heat—shock proteins;Immunohistochemistry 热休克蛋白70(HSP70)作为一种非特异性保护 与HSP70的表达之间的关系。 蛋白,对组织器官的保护作用已被证实。严重烧伤 材料和方法 及伤后早期导致的组织细胞缺血、缺氧、炎性介质释 动物分组 放、细菌内毒素产生等多种因素作为严重的应激,诱 健康Wistar大鼠30只(军事医学科学院动物中 导机体产生强烈的应激反应。笔者通过对烫伤大鼠 一、体重(220±30)g,雌雄不拘,单笼饲养,适 早期小肠黏膜组织做HE染色观察组织结构的变 心提供),化,用免疫组化染色结合图像分析测定小肠黏膜组 应1周后随机分为烫伤后2 h、8 h、24 h、3 d、7 d组  织内HSP70的表达,进一步研究烫伤大鼠早期小肠 和正常对照组各5只。二、烫伤大鼠模型制作 J 黏膜HSP70的表达规律,研究组织器官受损伤程度 大鼠在实验前12 h禁食水,1O%水合氯醛溶液 DOI:10.3877/cma.j.issn.1673-9450.2010.06.007 腹腔注射麻醉(30 mg/kg),计算并测量背部30%预 作者单位:300070天津医科大学研究生院(吴勇);300222天 津市第四医院烧伤科(刘群、赵永健) 通讯作者:刘群,Email:TJDSYY@yahoo.corn.cn 烫伤区域,用8%硫化钠脱毛,脱毛后立刻把该处浸 入94℃热水中18 S,造成30%TBSA烧伤,伤后l0 min内腹腔注射无菌乳酸钠林氏溶液(40 mL/kg)复 华损伤与修复杂志(电子版)2010年第5卷第6期Olin JInim"y Rep出andWound 苏。烫伤创面外涂碘伏1次/d,苏醒后6 h自由 饮食。 三、取材 各组大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉 达阳性细胞计数之间的关系 对大鼠烫伤后各组肺、小肠损伤情况做病理评 分,用Spearman等级相关分析病理评分与其HSP70 表达阳性细胞计数之间关系。结果显示小肠损伤病 后(40 mg/kg),开胸剪破右心耳放血,用4%中性甲 理评分与其HSP70表达阳性细胞计数之间存在正 醛由左心室原位灌注至大鼠四肢僵直,角弓反张时 相关关系, =0.943/1.000,P<0.05(表1)。 取小肠标本,修成0.3 em×0.3 em×0.5 em组织 块,置于4%中性甲醛固定24 h,组织块修整后石蜡 包埋切片(厚约4 m),HE染色观察组织器官结构 表1大鼠烫伤早期小肠HSP70表达的阳性细胞计数 及小肠病理评分( ±s) 变化,免疫组化染色并图像分析检测HSP70的表 达。兔抗多克隆抗HSP70浓缩型抗体为DOCA公 司生产,即用型Envision+TM试剂盒和DAB即用型 显色剂均为成都基因公司生产。 四、结果判定 HSP70阳性表达产物定位在细胞质和(或)细 胞核,此处出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。每张有 阳性结果的切片用四川大学Biomias99图像分析系 统分别取5个高倍视野(×400),采用鼠标点击法对 HSP70表达阳性的细胞进行计数;贵州医学院附属 医院病理科参照Chiu小肠损伤评价标准制定小肠 损伤评分方法。 五、统计学处理 计量结果以均数±标准差( -4-s)表示,用 SPSS10.0统计软件。不同组比较方差齐用方差分 析,方差不齐用秩和检验;P<0.05为差异有统计学 意义。 结 果 一、大鼠烫伤早期不同时问小肠病理光镜观察 小肠组织结构改变:正常对照组小肠结构完整 清晰,肠绒毛排列整齐。烫伤后2 h见肠黏膜出血、 糜烂及炎细胞浸润,随时间延长,至伤后8 h黏膜损 伤加重并有肠壁水肿;伤后3 d肠黏膜炎性介质反 应、出血、糜烂更加明显同时可见脱落上皮细胞及肠 黏膜毛细血管扩张淤血;伤后7 d各种损伤表现较3 d组稍减轻(图l~2)。 二、大鼠烫伤早期小肠组织内HSP70阳性细胞 计数的变化 实验显示,烫伤后2 h小肠内HSP70表达即刻 升高,至烫伤后3 d稍下降后又迅速上升至最大值, 随后在第7天开始下降,烫伤后各组与正常对照组 比较差异均有统计学意义(P<0.05),而烫伤后8 h 至7 d各组两两比较差异均无统计学意义(P> 0.05)。这说明烫伤后前3 d内小肠组织中HSP70 阳性细胞计数也是逐渐增加的(表1,图3~4)。 三、大鼠烫伤早期小肠病理评分与其HSP70表 注:各组比较均采用秩和检验 讨 论 热休克蛋白(HSPs)是热应激或其他有害应激 时细胞新合成或合成增加的一组蛋白质,HSP70诱 导型是其重要成员,它主要定位于细胞质和(或)细 胞核,热应激可诱导几乎所有细胞合成HSP70 ,其 主要的生物学功能是帮助蛋白质完成正确的折叠和 细胞保护作用,另有研究证实HSP70还具有明确的 抗细胞凋亡、抗炎性介质损伤、免疫保护作用及颅脑 损伤后的自我保护作用 。因此,通过观察应激时 HSP70在不同组织器官的表达情况,研究组织器官 受损伤程度与HSP70的表达之间的关系,对临床工 作有重要指导作用。 一、大鼠烫伤早期不同器官病理损伤变化与 HSP70的表达之间的关系 通过本实验笔者发现烫伤大鼠早期各器官 HSP70的阳性表达要早于光镜下可见病理损伤改 变,即有HSP70表达增加时不一定观察到病理损伤 改变,而当有病理损伤改变时很可能伴有HSP70表 达增加。在研究中笔者还发现烫伤后各器官HSP70 的表达比正常对照组均有明显增加;小肠在烫伤后 的3 d内与正常对照组比较组织结构均有明显改 变,其病理评分与正常对照组比较均有显著性差异。 同时,笔者还分别对大鼠烫伤后各组小肠的病理评 分和HSP70阳性细胞计数做相关分析,结果显示各 器官HSP70被诱导的数量与其病理损伤程度均呈 正相关关系;这与Hutter等 研究的HSP70被诱导 的数量与其保护作用的强弱呈正相关结果相符。提 ・20・ 中华损伤与修复杂志(电子版)2010年第5卷第6期0】iIl J hIil皿Y脚 andWound}b ( 咖 c Editi(1l 示HSP70的表达为损伤所诱导,HSP70的表达在一 HSPs中被诱导产生增多的也主要是HSP70。由于 定条件下可作为组织细胞受损伤的标志。临床工作 毛细血管网处在血液循环末端,叉多受交感神经支 中我们可以通过检测血液中HSP70的变化,较早判 配,烫伤应激时受血流重分布影响较大,缺血、缺氧 断组织器官损伤轻重程度,指导临床有针对性地进 变化明显,该区域也正是HSPT0被诱导高表达的部 行治疗。 位。HSP70表达定位的特点表明,烫伤早期小肠等 二、大鼠烫伤早期小肠内HSP70表达的规律 器官易发生缺血、缺氧损伤,这提示我们在临床工作 本实验结果表明,大鼠烫伤早期小肠内HSP70 中应重视这些器官的保护。通过该研究我们认为组 的表达随时问变化有一定规律:小肠在烫伤后2 h 织器官内HSP70的表达情况在一定条件下可以作 就有HSP70的高表达,在随后的3 d一直持续在高 为判断其损伤程度的指标。 (本文图1~4见光盘) 水平。这表明,热休克时各组织器官缺血、缺氧激发 HSP70编码基因的转录活性,诱导组织器官产生大 量HSP70 ,提高了组织细胞抵御外来损害的能力, 其本质正说明了HSP70对机体的保护性机制。 三、HSPTO阳性表达定位及HSP70表达与组织 参考文献 1李晓鲁,彭毅志,袁志强,等.热休克蛋白70基因重组腺病毒载 体微胶囊化及口服转染的研究[J].中华烧伤杂志,2003,19 (3):145—147. 2 Srivastava P.Roles of heat—shock proteins in innate and adaptive im- 缺血、缺氧的关系 实验发现正常对照组小肠内仅有少许HSP70 表达且主要分布在细胞质,烫伤后2 h小肠内 HSP70表达都迅速增加,并且细胞核和细胞质均有 HSP70表达增加且以细胞核增加更为明显,阳性颗 粒多数包围着核仁。人们从基因表达调控的水平对 HSP70的细胞保护作用研究后发现正常情况下 HSP70是以可溶性的形式存在于细胞质中,在应激 munity[J].Nat Rev Immunol,2002,2(3):185—194. 3 Ohkawara T,Takeda H,Nishiwaki M,et a1.Protective effects of heat shock protein 70 induced by geranylgeranylaeetone on oxidative injury in rat intestinal epithelial cells[J].Scand J Gastroemerol, 2006,41(3):312-317. 4李峰,孙晓川,唐文渊,等.热应激对大鼠轴索损伤的保护作用 [J].中华创伤杂志,2005,21(4):254-259. 诱导时HSP70迅速移到核内,作为瞬间的细胞基质 和核基质固定细胞,起稳定细胞的作用,细胞恢复时 则移人细胞质,再次热休克时重又转回细胞核内 j。 这种变化正说明烫伤后HSP70被诱导表达以发挥 其生物学功能对细胞进行保护。烫伤后第7天, HSP70的表达总量仍有少许升高,但细胞核和细胞 质内阳性颗粒数逐渐趋于一致,这与陈威巍等 的 5袁志强,李晓鲁,彭毅志.热休克预处理对肠上皮细胞缺氧一再给 氧损伤的保护作用及其机制[J].中国危重病急救医学,2002, l4(5):265-268. 6 Hurter MM,Sievers RE,Barbosa V,et a1.Heat.shock protein in— duction in rat hearts.A direct correlafion between the amount of heat—shock protein induced and the degree of myocardil praotection [J].Circulation,1994,89(1):355-360. 7 Fiorenza MT,Bevilacqua A,Canterini S,et a1.Early transcriptional activation of he hs07o.1 gene by osmotitc stress in one—cell embryos 研究结果相符,提示细胞功能已经开始恢复。 另有研究表明在组织缺血、缺氧及再灌注损伤 中都有保护作用 。实验中还发现烫伤后大鼠小 肠内HSP70的表达主要分布在小肠黏膜的上皮细 胞和固有层的腺体细胞。小肠黏膜下动脉分别形成 of the mouse[J].Biol Reprod,2004,70(6):1606 1613. 8袁志强,彭毅志,李晓鲁,等.严重烧伤早期肠黏膜组织热休克 蛋白70的表达规律[J].中国危重病急救医学,2005,17(5): 264 67. 9陈威巍,朱国标,王天然,等.热适应与热应激对大鼠肝细胞 HSP70表达的影响[J].西北国防医学杂志,2002,23(4):275— 277. 1O Li G,Bae S.Zhang L.Effect of prenatal hypoxia on heat stess—me— r肠腺间毛细血管网和绒毛内毛细血管网营养肠黏 膜。烫伤应激时毛细血管收缩致黏膜缺血、缺氧损 伤,细胞充血水肿,甚至出现黏膜糜烂和应激性溃 疡。以上损伤导致细胞质内变性蛋白增多。这些蛋 白发生异常折叠后暴露疏水区并与HSP结合,经一 系列的生物反馈作用激活HSPs基因的转录,使 HSPs产生增多。HSP70是HSPs家族的重要成员, diated cardioprotection in adult rat heart f J].Am J Physiol Heart Circ Physil,2004,286(5):H1712・aH1719. (收稿13期:2010-09-28) (本文编辑:谷俊朝) 吴勇,刘群,赵永健.烫伤大鼠早期小肠内热休克蛋白70表达的研究[J/CD].中华损伤与修复杂志:电子版,2010,5(6): 733-738. 

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