成年小鼠心脏灌流

成年小鼠心脏灌流

实验材料：需要观察脑切片的小鼠

试剂/试剂盒：乙醚;生理盐水(37℃水浴）;4％PFA；30%蔗糖

仪器：蠕动泵;剪刀；镊子;针头;导管

实验步骤:

1、准备实验器材：两个锥形瓶（1个装生理盐水，一个装4％多聚甲醛，记得要用封口膜封口）

2、用生理盐水冲洗导管,并排除管内气体。（灌流时选用雄性动物比选用雌性动物要好,原因是雌性动物受其激素周期影响，雄性的结果更为可靠）

3、在密闭容器内加适量乙醚，麻醉小鼠.（需要注意的是，小鼠清醒一点比死掉要好，防止血液凝固给灌流带来阻力)

4、待小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。

5、一只手用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨,暴露出心脏和肝脏.

6、将注射针头插入小鼠左心室（如针头不稳可用镊子将其固定在泡沫板上），同时将

小鼠肝脏减掉，以使血液流出。灌流速度5.8rpm。（灌注生理盐水的时间维持在10min左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白）

7、对小鼠进行剪尾取样,以备测定其基因型。同时，将小鼠信息卡片上记录灌流信息,并将灌流小鼠的信息记录在自己的实验记录本上,以方便后续的重新基因型鉴定操作。

8、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后,将导管始端从生理盐水中拿出,将其放入冰浴的4％PFA溶液(4℃）中，用4％PFA灌流固定时，当PFA流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有),此时可将灌流速度由5。8rpm调至4。8rpm，以使固定更加充分。整个PFA灌流时间约为20min。（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联）

9、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下,如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色.将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作.

10、拿出一条纸巾,将小鼠尸体放在上面，沿颈部剪下头颅.

11、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨.将延髓上包被的软骨剪开,除去多余的结缔组织。需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来,因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。

12、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部,在剥嗅球部位时要格外小心,必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除.

13、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来.

14,将剥离出来的脑浸泡在4％PFA中，过夜固定。

15、将PFA液换为30％蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。此时可将脑取出进行冷冻切片.