光合速率测定方法

光合作用是绿色植物特有的生理功能，是绿色植物吸收光能将CO2和H20合成为有机物质并释放O2的过程。光合作用及其有关过程的测定是植物生理学实验的重要组成部分。

光合作用是由原初反应、同化力形成和二氧化碳同化3个主要阶段组成。原初反应包括光合色素对光能的吸收、光能的传递和光化学反应，主要与叶绿素和其它光合色素有关；而同化力(ATP和NADPH2)的形成主要与膜的特性有关，二氧化碳同化除受同化力供应影响外，还受与暗反应有关酶活性的影响。光合作用强弱与环境条件变化密切相关。

光合速率是植物生理性状的一个重要指标，也是估测植株光合生产能力的主要依据之一。光合速率可根据植物对CO2的吸收量，O2的释放量或干物质(有机物质)的积累量来进行测定。随着光合作用研究的深入，光合作用测定技术的水平也在不断提高，方法和手段也越来越多。本次实验学习光合速率测定最经典的方法之一-----改良半叶法。

[原理]

植物叶片的主脉两侧对称部分叶面积基本相等，其形态和生理功能也基本一致。用物理或化学方法处理叶柄或茎的韧皮部，保留木质部，以阻断叶片光合产物的外运，同时保证正常水分供应。然后，将对称叶片的一侧取下置于暗中，另一侧留在植株上保持光照，继续光合作用。一定时间后，测定光下和暗中叶片的干重差，即为光合作用的积累的干物质量。通过公式计算出光合速率。乘以系数后还可计算出C02的同化量。 [材料、仪器、药品]

1．材料：任选户外一种植物。

2．仪器及用品：(1) 剪刀；(2) 4块湿纱布；（3）带盖磁盘；(4) 30个小纸牌，去户外之前用铅笔编号（1~15；1~15）；(5) 镊子；(6) 打孔器；（7）铅笔；（8）记号笔；(9) 12个称量瓶；(10) 烘箱；(11) 分析天平；（12）干燥器。

3．药品：5％三氯乙酸。 [方法]

1．取样：在户外选择较绿和较黄的同种植物叶片各15片，要注意叶龄、叶色、着生节位、叶脉两侧和受光条件的一致性。绿叶和黄叶分别用纸牌编号（例如绿叶为1、2、3~15，黄叶为1`、2`、3`~15`）。增加叶片的数目可提高测定的精确度。

2．处理叶柄：为阻止叶片光合作用产物的外运，可选用以下方法破坏韧皮部。

(1) 环割法：用刀片将叶柄的外层(韧皮部)环割0.5cm左右。为防止叶片折断或改变方向，可用锡纸或塑料套管包起来保持叶柄原来的状态。

(2) 烫伤法：用棉花球或纱布条在90℃以上的开水中浸一浸，然后在叶柄基部烫半分钟左右，出现明显的水浸状就表示烫伤完全。若无水浸状出现可重复做一次。对于韧皮部较厚的果树叶柄，可用融熔的热蜡烫伤一圈。

（3）抑制法：用棉花球蘸取5％三氯乙酸或0.3mol/L的丙二酸涂抹叶柄一周。本实验统一使用三氯乙酸。注意勿使抑制液流到植株上。 选用何种方法处理叶柄，视植物材料而定。一般双子叶植物韧皮部和木质部容易分开宜采用环割法；单子叶植物如小麦和水稻韧皮部和木质部难以分开，宜使用烫伤法；而叶柄木质化程度低，易被折断叶片采用抑制法可得到较好的效果。 3．剪取样品：叶柄处理完毕后即可剪取样品，并开始记录时间，进行光合作用的测定。首先按编号次序（绿叶和黄叶交替进行）剪下叶片对称的一半(主脉留下)，并按顺序夹在湿润的纱布中（绿叶与黄叶分开保存），放入磁盘中，带回室内存于暗处。2~3h后，再按原来的顺序依次剪下叶片的另一半。按顺序夹在湿润的纱布中（绿叶与黄叶分开保存）。注意两次剪叶速度应尽量保持一致，使各叶片经历相同的光照时间。

4．称干重：取12个称量瓶分别标上绿叶光照1、2、3，绿叶黑暗1、2、3，黄叶光照1、2、3，黄叶黑暗1、2、3，将各同号叶片照光与暗中的两半叶叠在一起，用打孔器打取叶圆片，分别放入相应编号的称量瓶中（即光下和暗中的叶圆片分开）。每5 个叶片打下的叶圆片放入一个称量瓶中，做为一个重复。记录每个称量瓶中的小圆片数量。打孔器直径根据叶片面积大小进行选择，尽可能多的打取叶圆片。注意不要忘记用卡尺量打孔器的直径。将称量瓶中叠在一起的叶圆片分散，开盖置于105℃烘箱中烘10min以快速杀死细胞，然后将温度降到70~80℃，烘干至恒重(2~4h左右)。取后取出加盖于干燥器中冷却至室温，用分析天平称重。

5．结果计算：

W2-W1

光合速率(mgDW·m-2 s-1)=-------

A×t

式中 W2：照光半叶的叶圆片干重(mg)；W1：暗中半叶的叶圆片干重(mg)；A：叶圆片面积(m2)；t：照光时间(S)。

若将干物质重乘以系数1.5，便可得CO2的同化量，以mgC02·m -2S-1表示。

[实验记录] 1．实验材料： 植物名称： 种植地点： 发育时期： 试验处理：

植物的生长状况： 取样部位及数量： 2．实验时间： 年 月 日 时 分至 时 分 3．实验条件记录 项目 实验开始时 实验结束时 平均值 时间 温度 光强 风速 二氧化碳浓度

4．测定数据记录 重复 叶圆片数叶圆片总面量 积m2 暗中半叶干重mg W1 照光半叶干重mg W2 光合速率 mgDW·m-2 S-1 1 绿 2 3 叶 平均值 标准差 1 黄 2 3 叶 平均值 标准差 5．其它问题记载：

[实验前思考题]

（1）通过光合作用测定你能够解决什么理论和实践问题？ （2）说明光合作用的生理意义及其测定光合作用的重要性。

（3）根据光合作用的反应方程式，光合作用涉及到二氧化碳、水、氧气、有机物质和光能的吸收，哪些因子可作为光合作用测定的指标？为什么？请简述各种光合作用测定方法的基本原理？比较各种方法的优缺点？ （4）为什么选择叶龄、叶色、着生部位和受光一致，以及主脉两侧对称的叶片？ （5） 为什么将待测叶片编号？

（6）在改良半叶法中为什么要杀死韧皮部？ （7）三氯乙酸在本实验中起什么作用？为什么？ （8）有三种杀死韧皮部的方法，各适用何种试材？

（9）在取样称重时，为什么将同号叶片的两个半叶叠在一起用打孔器打取叶圆片？

（10）烘干时为什么样品放入称量瓶，在烘箱中不加盖，而从烘箱取出时需要加盖，并放入干燥器中？ （11）如果将先取回的半片立即打孔取样烘干，对最后的测定数据将会产生什么样的影响？为什么？

（12）在烘干过程中，为什么需要用105℃的高温10min杀死细胞？如若不然，将对实验数据产生什么样的影响？ （13）测定时间过短对所测定的光合作用速率会产生什么样的影响？为什么？测定时间过长又会产生什么样的影响？为什么？ （14）为使不同时间测定的数据具有可比性，你认为需要控制什么环境条件？为什么？

（15）写出实验时间安排和操作流程图。