GC法测定脂肪酸甘油酯型鱼油软胶囊中EPA、DHA的含量

2018年6月 Popular Science & Technology June 2018

GC法测定脂肪酸甘油酯型鱼油软胶囊中

EPA、DHA的含量

黄艳芳

（南宁富莱欣生物科技有限公司，广西 南宁 530007）

【摘 要】文章研究了气相色谱测定脂肪酸甘油酯型鱼油软胶囊中EPA、DHA含量的方法。以正己烷为溶剂制备对照品（鱼油标准物质）及供试样品溶液并进行甲酯化。用气相色谱法分别分析其中的甲酯分析的色谱柱为DB-FFAP毛细管柱（30m×0.250mm×0.25μm），进样口温度250℃，检测器温度270℃，载气为N2。EPA and DHA含量用外标法计算。EPA、DHA的相对标准偏差RSD分别为0.84%和0.73%，回收率分别为97.44%和100.34%。该法分析速度快捷、准确、重现性好。

【关键词】鱼油软胶囊；GC法；EPA；DHA

【中图分类号】TS207 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1151(2018)06-0031-04

Determination of EPA and DHA in fatty acid glycerides of fresh oil

capsule using GC method

Abstract: In this paper, the determination of EPA and DHA in fatty acid glycerides of fresh oil capsule using GC method was studied. The reference substance (fresh oil standard substance) and the sample were dissolved in n-hexane and methylated. The methyl esters of EPA and DHA in the two solutions were respectively determined using GC instrument with flame ionization detector and DB-FFAP capillary column (30m×0.250mm×0.25μm) on the condition of 250℃ injector temperature, 270℃ detector temperature and N2 as carrier gas. The content of EPA and DHA in the sample was calculated by the external standard method. The relative stander deviation (RSD) of EPA and DHA are 0.84% and 0.73% respectively, and the recoveries of them are respectively 97.44% and 100.344%. The analysis method is fast, accurate and reproducible.

Key words: Fish oil products; Gas chromatography; EPA; DHA

二十碳五烯酸（EPA）与二十二碳六烯酸（DHA）是哺乳动物自身不能合成的营养物质，是人体必需的高度不饱和脂肪酸，EPA和DHA都属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，具有特殊的药理性质。研究表明，EPA和DHA具有抑制血小板凝聚、舒张血管、调节血脂、健脑明目、促进婴儿视网膜发育等功能，对心脑血管疾病、炎症、肾病以及癌症也有较好的疗效[1-3]。天然EPA和DHA主要在硅藻等浮游生物及藻类中生物合成，并通过食物链传递，蓄积于鱼类、甲壳类和海产动物中，EPA和DHA主要来自于海洋鱼类[4]，以精制后含EPA、DHA较高的深海鱼油为原料或添加至乳制品、或制成保健食品已被广泛认同且销量大增。本文应用GC法对脂肪酸甘油酯型鱼油软胶囊中EPA和DHA的含量进行测定，建立适合批量检测、操作简便、色谱分离完全、专属性好的气相色谱检测方法。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

7890B气相色谱仪，带氢火焰离子化检测器（美国Agilent）；HMS-350型涡旋混合器（天津市恒奥科技发展有限公司）；80-1型离心机（金坛市医疗器械厂）；梅特勒-托利多B347023119电子天平。

1.2 试剂与材料

甲醇（德国merck色谱纯）、氢氧化钾（优级纯）、正己烷（色谱纯），氮气（99.999%）；二十碳五烯酸甲酯（顺-5,8,11,14,17）/EPA甲酯（C20:5）标准品（上海安谱，纯度≥99.0%，批号：D0050099）；二十二碳六烯酸甲酯（顺-4,7,10,13,16,19）/DHA甲酯（C22:6）标准品（上海安谱，纯度纯度≥99.0%，批号：92460080）；鱼油标准物质（英国（FAPAS）Fish Oil 鱼油标准品，批号：CDHA-T14165QC），样品为鱼油软胶囊；0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液配制：称取

【收稿日期】2018-04-04

【作者简介】黄艳芳（1982－），女（壮族），广西南宁人，南宁富莱欣生物科技有限公司制药工程师，从事药品、保健食品的生产和质量管理工作。

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2.8g氢氧化钾，用甲醇溶解并定容至100mL，混匀。

2.3.3 甲酯化

准确吸取稀释液10.00mL至50mL比色管中，加入10mL浓度为0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液，立即移至涡旋混合器上振荡混合5min，静置5min，将溶液转移至分液漏斗，并用少量超纯水多次荡洗比色管，合并洗涤液转入分液漏斗中，沿分液漏斗壁加入30mL超纯水，轻微振摇0.5min，弃去下层液体，反复用超纯水洗涤至中性，将上层溶液转移至25mL容量瓶，并用正己烷定容至刻度，摇匀，（若呈乳化现象，将溶液以4000r/min离心10min），溶液过0.45μm微孔滤膜滤过，待测。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

DB-FFAP毛细管柱（30m×0.250mm×0.25μm）；程序升温：起始温度180℃，以10℃/min升温至220℃，再以8℃/min升温至240℃，保持13min；进样口温度：250℃；进样量1μL，分流比20∶1；FID检测器温度：270℃；载气：纯度大于99.999%，流量1.0mL/min，尾吹25mL/min；氢气：40mL/min；空气450mL/min。

2.2 标准混合工作液的配制

分别精密称取82.55mgEPA、78.65mgDHA于25 mL容量瓶，用正己烷溶解并定容至刻度，即得EPA、DHA混合标准储备液，浓度分别为3.26898mg/mL和3.11454mg/mL。充入适量氮气保存。

分别精密吸取上述混合储备液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 于5个50mL的容量瓶中，加正己烷稀释定容，标准混合工作溶液中EPA浓度分别为0.065380mg/mL、0.130759mg/mL、0.196139mg/mL、0.261518mg/mL、0.326898mg/ mL；DHA浓度分别为0.062291mg/mL、0.124582mg/mL、0.186872mg/mL、0.249163mg/mL、0.311454mg/mL。

2.4 计算公式

上式中：X为试样中二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸的含量，单位为克每百克（g/100g）；Ci为从标准曲线查得供试液中各脂肪酸甲酯的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；V1为样品甲酯化前定容体积，单位为毫升（mL）；f为试样稀释倍数；V2为试样用于甲酯化体积,单位为毫升（mL）； V3为供试液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m为试样的称样质量，单位为克（g）；F为各脂肪酸甲酯转化为脂肪酸的换算系数：DHA甲酯转化为DHA脂肪酸的换算系数为0.9590，EPA 甲酯转化为EPA 脂肪酸的转换系数为0.9557；100、1000为单位转换。

2.3 供试品溶液的配制

2.3.1 物理鉴别

称取1g样品，按照GB 28404-2012附录A脂肪酸乙酯型油类制品的物理鉴别[5]，判定产品为脂肪酸甘油酯型油类制品。 2.3.2 样品处理

取每批产品20粒胶囊内容物，混匀，称取混合均匀的内容物0.5g（精确到0.0001g）至50mL容量瓶中，加入5mL正己烷轻摇溶解，并用正己烷定容至刻度，摇匀。准确吸取5.00mL至25mL容量瓶，以正己烷定容至刻度，混匀得稀释液，按2.3.3步骤进行甲酯化处理。

2.5 系统性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液1mL,注入气相色谱仪，按确定的色谱条件测定，在此条件下EPA甲酯保留时间为9.31min，DHA甲酯保留时间为13.12min；样品中EPA理论塔板数为132057，分离度为2.54，符合《中国药典》2015年版四部通则0521气相色谱法的规定[6]。上述色谱条件下对照品溶液和供试品溶液色谱图如图1、图2所示。

图1 对照品溶液色谱图

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图2 供试品溶液色谱图

2.6 线性范围的考察

取EPA、DHA系列标准混合工作液进样，按上述色谱条件测定峰面积，以标准品浓度为横坐标X、峰面积为纵坐标Y，进行线性回归，得标准曲线。结果为：EPA工作曲线Y= 778.5267X-2.6477（R2=1.0000）；DHA工作曲线Y=778.2449X- 8.3780（R2=0.9996）；表明分别：在0.065380 mg/mL～0.326898mg/mL、0.062291 mg/mL～0.311454mg/mL浓度范围内，EPA和DHA线性关系良好。

序号 组分名称 EPA DHA

表2 重复性实验考察结果（以g/100g计）

1 2 3 4 5 17.19 11.7

6 17.04 11.69

平均值 17.12 11.76

RSD 0.44% 0.69%

17.13 17.11 17.05 17.23 11.79 11.76 11.73 11.91

2.9 加标回收实验

精密称取约0.2g已知准确含量（EPA：17.12g/100g；DHA：11.76g/100g）的鱼油软胶囊样品5份，置于25mL容量瓶中，于每一份样品中分别精密加入2.50mL混合储备液。按供试品溶液的制备步骤操作，供试液分别注入气相色谱仪，测定EPA、DHA峰面积，计算回收率，回收率实验考察结果如表3所示，表明本法回收率较好，准确性能满足该类产品的分析要求。

表3 回收率实验考察结果

组分名称 EPA DHA

称样量 （g） 0.2011 0.2045 0.2038 0.1997 0.2098 0.2011 0.2045 0.2038 0.1997 0.2098

样品量（mg） 34.4283 35.0104 34.8906 34.1886 35.9178 23.6494 24.0492 23.9669 23.4847 24.6725

对照品加入量（mg） 8.1724 8.1724 8.1724 8.1724 8.1724 7.7864 7.7864 7.7864 7.7864 7.7864

测得量 （mg） 42.3811 43.0071 43.0011 42.0491 43.8112 31.5791 31.6982 31.8611 31.3211 32.4283

回收率 （%） 97.31 97.85 99.24 96.18 96.59 101.84 98.24 101.38 100.64 99.61

平均 回收率（%） 97.44 100.34

RSD （%） 1.23 1.44

2.7 仪器精密度实验

精密吸取含EPA甲酯（0.196139mg/mL）和DHA甲酯（0.186872mg/mL）标准混合液工作液第三点，按上述色谱条件，进样量1uL，重复6次，测定EPA、DHA峰面积。EPA平均峰面积146.6，RSD为0.84%；DHA平均峰面积130.1，RSD为0.73%；表明仪器精密度良好。精密度实验结果如表1所示。

表1 精密度实验结果

序号 组分名称 1 2 3 147.8 131.2

4 5 6 平均值 RSD 146.6 0.84% 130.1 0.73%

EPA峰面积 146.5 145.4 DHA峰面积 130.5 129.6 147.9 144.9 146.9 128.6 130.9 129.9

2.8 重复性实验

取同一批号鱼油软胶囊6份，按2.3制备样品溶液，测定含量进行分析，EPA、DHA平均含量分别为17.12g/100g、11.76g/100g，RSD分别为0.44%、0.69%，表明测定方法重复性良好。重复性实验考察结果如表2所示。

2.10 样品含量的测定

取8批不同批次鱼油软胶囊产品，按供试品制备方法测定。鱼油软胶囊EPA、DHA含量标准范围要求：EPA≥12g/100g、DHA≥9.4g/100g。实验得EPA、DHA平均含量分别为17.54g/100g、11.86g/100g。样品含量测定实验考察结果如表4所示。

表4 样品含量测定实验考察结果（n=8，以g/100g计）

批号 组分 EPA含量 DHA含量

170401 17.92 11.59

170402 17.66 12.04

170403 17.43 11.78

170404 18.05 12.29

170405 17.34 12.03

170406 17.15 11.79

170407 16.98 11.68

170408 17.83 11.64

平均值 17.54 11.86

3 讨论

3.1 标准储备液贮存

EPA和DHA分别含有四个和五个活泼的亚甲基，此类亚

甲基的存在使二者极易受到光、氧、高温、自由基及金属元素的影响，产生氧化、酸败、聚合、双键共轭等化学反应，实验室过程中发现按GB28404-2012进行标准品储备液贮存后含量降低较明显，为确保定量结果的准确性，标准品储备

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液充氮除氧保护贮存于-18℃冰箱，可有效防止含量衰减。

标准储备液贮存、甲酯化过程等优化建立的，操作简单快捷，分离度好，重现稳定，结果准确可靠，适用于生产企业或质量控制部门对保健食品中脂肪酸甘油酯型鱼油软胶囊中EPA和DHA的含量测定。

3.2 甲酯化过程优化

油脂中的脂肪酸以脂肪酸甘油酯的形式存在，其沸点较高，不利于气相色谱分析，而脂肪酸甲酯的挥发性较好，符合GC法测定要求，因此鱼油软胶囊的甲脂化过程至关重要。

GB28404-2012及文献方法应用甲基酯化法将甘油酯转化为甲酯，酯化后直接取正己烷层注入离子化器进行色谱分析，此操作易导致检测结果偏高，偏离真值。因正己烷易挥发，酯化过程又需多次洗涤才能洗至中性，操作过程容易带来误差，正确方法是将甲脂溶液洗涤至中性后准确定容再上机检测，确保测定结果的准确性。同时，GB28404-2012洗涤操作采用吸管移出下层液体的办法，该步骤反复操作后极易造成正己烷层损失，正确方法是选用分液漏斗进行洗涤操作，水层从下端管口放出，洗涤呈中性后再定容正己烷层，此操作可减少洗涤过程含量的损失。

实验过程以有证书的鱼油标准物质作为监控样，与样品同步实验，监控实验操作过程及色谱分析的准确性。

本法甲酯化后中和氢氧化钾步骤也很关键，上机溶液PH值呈中性避免甲酯皂化，也可延长色谱柱的寿命。

[7]

【参考文献】

[1] 石雨,田媛,李磊,等.DHA和EPA的生理功能及提取方法

研究进展[J].黑龙江科学,2014(10):23-25.

[2] 刘汝萃,王彩华,肖晶,等.鱼油的提取、富集与应用研究进

展[J].粮食与食品工业,2017(5):5-8.

[3] 李左宏,胡文娟,吴斌.DHA和EPA在水产上的应用现状与

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[4] 李妍,王静,李麟龙,等.DHA和EPA最新研究进展[J].农产

品加工(学刊),2013(2):3-13.

[5] GB28404-2012.食品安全国家标准 保健食品中α-亚麻

酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的测定[S].北京:中国标准出版社,2012.

[6] 国家药典委员会.中国药典[M].北京:中国医药科技出版

社,2015.

[7] 蔡伟江,张喜金,苏昭仑.气相色谱法测定鱼油中的二十碳

五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸[J].食品安全质量检测学报,2015,6(5):1924-1928.

3.3 测定方法可行

本法是在食品安全国家标准GB28404-2012基础上进行

（上接第164页）

门也要建立相应的考核机制，发挥媒体监督、专家评议、第三方评估等作用，确保工作顺利推进。最后加强监督检查，积极运用大数据、云计算等信息化手段，探索实行“互联网＋”监管模式；建立“最多跑一次”改革工作绩效考核制度，定期组织开展专项督查活动，及时总结经验，督促改进工作，建立相应考核制度。强化事中事后监管，完善事中事后监管细则，健全事中事后监管制度。

据服务门户，实现对学院具备数据服务属性的系统统一管理、调度和登录访问。面向师生员工提供一站式数据录入服务。面向师生员工提供PC端和移动端的集中式数据报表展现服务。使数据录入一站化、数据展现集中化、数据服务统一化。及时将归集到的数据向各部门提供共享服务，让静止的数据“活”起来，每调用一次接口，师生就少跑一次腿、少提供一次证明材料，更好服务师生的最终目标。然而也存在一些问题，如部门与部门之间的衔接上却还没能形成真正合力，最主要的不是技术问题，更多的是管理问题，如对师生的态度问题、作风问题、认识问题。

2.6 确保数据安全

按照国家关于涉密信息系统分级保护和非涉密信息系统信息安全等级保护的有关规定，健全网上办理安全保障体系，将网上办理系统建设与安全措施有机结合，提高各平台、各系统的安全防护能力。要查补安全漏洞，做好容灾备份，建立健全保密审查制度，加强对应用数据特别是涉及国家秘密、商业秘密、个人隐私等重要数据的保护力度。

【参考文献】

[1] West DM.Big Data for Education:Data Mining,Data Analytics,

and Web Dashboards.Governance Studies at Brookings[R]. Washington: Brookings Institution,2015.

[2] 宋爱青.基于Hadoop的日志分析系统的设计与实现[D].

北京:中国地质大学,2012.

3 结束语

通过集成技术手段，初步构建浙江建设职业技术学院数

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