发根农杆菌诱导广藿香毛状根的研究

广东药学院学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　而ｅ　Ａｐｒ．２０１５，３１（２）　发根农杆菌诱导广藿香毛状根的研究　黄伟剑，何梦玲，张宏意，严寒静　（广东药学院中药学院，广东广州５１０００６）　摘要：目的筛选诱导广藿香毛状根的最佳条件，建立广藿香毛状根诱导体系，并以此体系作为下一步研　究的基础。方法采用共培养法，用发根农杆菌ＡＴＣＣ１５８３４和Ｃ５８Ｃ１，经预培养、侵染、共培养和除菌操　作诱导广藿香外植体产生毛状根。结果预培养时间为２　ｄ，乙酰丁香酮质量浓度为１５　ｍ＃Ｌ，侵染时问　为２５　ｍｉｎ，共培养时间为２　ｄ，发根农杆菌ＡＴＣＣ１５８３４和Ｃ５８Ｃ１诱导率均达到最高，分别为８３．３％和　８０．５％；ＰＣＲ扩增结果证文，发根农杆菌Ｒｉ质粒的Ｔ—ＤＮＡ部分已在广藿香毛状根的基因组中整合及表　达，说明广藿香毛状根已经被成功诱导。结论成功诱导并建立了广藿香毛状根诱导体系。　关键词：广藿香；毛状根：诱导；发根农杆菌：ＡＴＣＣ１５８３４：Ｃ５８Ｃ１　中图分类号：Ｒ２８２．２文献标志码：Ａ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—８７８３．２０１５．０２．００４　文章编号：１００６—８７８３（２０１５）０２—０１５６—０５　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　Ａｉｔ．ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ＨＵＡＮＧ　Ｗｅｉｊｉａｎ，ＨＥ　Ｍｅｎｇｌｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇｙｉ，ＹＡＮ　Ｈａｎｊｉｎｇ　（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１０００６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｎｄｕｃｅ　ｈａｉｙ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｒｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ１５８３４　ａｎｄ　Ｃ５８Ｃ１　ａｆｔｅｒ　ｐｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｐｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｏｒ　２　ｄａｙｓ，１５　ｍｇ／Ｌ　ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　２５　ｍｉｎ　ａｎｄ　ＣＯ－　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｏｒ　２　ｄａｙｓ，ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ＡＴＣＣ１５８３４　ａｎｄ　Ｃ５８Ｃ１　ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｏｆ　８３．３％ａｎｄ　８０．５％．Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｉｃａｔｉｆｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐａｒｔ　ｏｆ　Ｔ—ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｒｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　ｗａｓ　ｉｎ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔ　ｇｅｎｏｍｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｈａｉｙ　ｒｏｏｔｓｒ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ；ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｓ；ｉｎｄｕｃｅ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ；ＡＴＣＣ　１　５８３４；Ｃ５８Ｃ　１　广藿香［Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ（Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ．］为　唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分人药，性辛、　微温，具有芳香化浊、和中止呕、发表解暑等功效，原　产菲律宾，东南亚各地栽培较多，中国南方地区也有　大量栽培，是广东“十大广药”之一…。　收稿日期：２０１４．１２．１７　发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）是根瘤菌　科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａ）农杆菌属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）的一种革　兰阴性细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数　单子叶植物以及个别裸子植物　。］。发根农杆菌含　有致根Ｒｉ质粒，当发根农杆菌侵染植物时，　质粒　基金项目：广东省科技厅项目（粤科规划字［２０１２］１４５号）；广东省中医药管理局项目（２０１１１２５２）；中山市科技计划项目　（２０１０１Ｈ０１９）　作者简介：黄伟剑（１９８９一），男，２０１２级硕士研究生；Ｅｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｗｅ￣ｉａｎ２３＠１６３．ｃｏｒｎ；通信作者：严寒静（１９７２一），女，副教授，　从事药用植物种质资源多样性评价，电话：０２０．３９３５２１７６，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎｈａｎｊｉｎｇｌ２１１＠１６３．ｃｏｎ。　网络出版时间：２０１５．０３．３０　１６：２３网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／４４．１４１３．Ｒ．２０１５０３３０．１６２３．００４．ｈｔｍｌ　第２期　黄伟剑．等．发根农杆菌诱导广藿香毛状根的研究　１５７　上的Ｔ．ＤＮＡ在　基因的协助下整合进入植物的核　基因组，表达后会产生许多生长迅速、多分支成毛状　的不定根，称为毛状根。毛状根具有生长速度快、激　素自主性和遗传稳定等特点．已成为得到植物次生　代谢产物的重要途径［４－６１。除此以外，还可以利用毛　状根转基因的特性培育新品种；利用毛状根高度的　繁殖潜能制作人工种子：利用毛状根的稳定性进行　与根相关的理论研究等＿２］。　本研究利用发根农杆菌ＡＴＣＣ１５８３４和Ｃ５８Ｃ１　侵染广藿香外植体，研究预培养时间、乙酰丁香酮质　量浓度、侵染时间和共培养时间对广藿香毛状根诱　导率的影响，得到诱导广藿香毛状根的最佳条件，为　下一步研究提供理论支持。　１材料与方法　１．１　广藿香无菌苗的制备　广藿香采于广东药学院药用植物园，经广东药　学院中药学院刘基柱副教授鉴定为广藿香　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ（Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ．。　广藿香叶片外植体先用体积分数７５％乙醇浸　泡４　Ｓ，无菌水冲洗３次；再加入质量分数０．１％升汞　溶液，浸泡１５　ｒａｉｎ，无菌水冲洗．重复４次。灭菌后　的广藿香外植体用剪刀割为１　ｅｍ　小块并培养在　ＭＳ（ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　ｓｋｏｏｇ　ｍｅｄｉｕｍ）＋０．１　ｍ＃Ｌ　ＮＡＡ　（萘乙酸）＋０．２　ｍｇ／Ｌ　６．ＢＡ（６一苄氨基腺嘌呤）培养　基中。在光照１４　ｈ／ｄ、２５　ｃ【＝条件下培养２０　ｄ，广藿　香外植体形成愈伤组织并产生丛芽。把丛芽移栽到　１／２　ＭＳ培养基中进行生根培养，在光照１４　ｈ／ｄ、２５　℃条件下培养得到广藿香无菌苗。　１．２发根农杆菌菌株及其培养　发根农杆菌ＡＴＣＣ　１５８３４菌株，由广东省林业科　学研究院王洪峰研究员惠赠；发根农杆菌Ｃ５８Ｃ１菌　株，由西南大学廖志华教授惠赠　１．２．１发根农杆菌的保存　发根农杆菌保存于发　根农杆菌培养基（ＹＥＢ。ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉＩＺｍ　ｒｈｉｚｏｇｅ凡ｅ　ｍｅｄｉｕｍ）液体培养基中，菌液与灭菌甘油以７．５：２．５　（体积比）混合均匀后于一８０℃下长期保存　１．２．２　发根农杆菌的活化　发根农杆菌　ＡＴＣＣ１５８３４在ＹＥＢ固体培养基（ｐＨ　７．４）上划线培　养，发根农杆菌Ｃ５８Ｃ１在含利福平４０　ｍｇ／Ｌ的ＹＥＢ　固体培养基（ｐＨ　７．４）上划线培养，２８℃黑暗条件下　培养４８　ｈ，直到长出单菌落。挑取１个单菌落接种　于ＹＥＢ液体培养基中，１４０　ｒ／ｍｉｎ、２８℃、黑暗条件　下振荡培养１６　ｈ，此时的ＹＥＢ液体培养基由接种前　透明的黄棕色变成浑浊的淡黄色，证明发根农杆菌　已正常长出。取１０　ｍＬ已活化的菌液加人２０　ｍＬ已　灭菌的ＹＥＢ液体培养基中（ＯＤ　∞＝０．６）用于侵染广　藿香外植体。　１．３广藿香毛状根的诱导　１．３．１预培养将广藿香无菌苗叶片外植体于主　脉处垂直切割成１　ｅｍ　小块，接种在无激素的ＭＳ固　体培养基上，２５℃、黑暗条件下分别预培养１、２、３　ｄ。　１．３．２侵染　将预培养后的外植体移至已经活化　好的发根农杆菌悬液中，分别加入１０、１５、２０　ｍ＃Ｌ　的乙酰丁香酮溶液，侵染时间分别为ｌ０、１５、２０、２５、　３０　ｍｉｎ，期间不断振荡，用无菌滤纸吸取外植体表面　多余的菌液。　１．３．３共培养将侵染后的外植体，接种在无激素　的ＭＳ培养基中，在２５℃、黑暗条件下分别共培养　１、２、３　ｄ。　１．３．４除菌共培养长出菌斑后，用无菌水清洗菌　斑并用灭菌后的滤纸把多余的水吸干，将外植体移　至ＭＳ＋５００　ｍｇ／Ｌ的头孢噻肟钠培养基中，２５℃、１４　ｈ／ｄ散射光下进行培养，每７　ｄ转接１次，反复继代　除菌，直到培养基没有菌斑出现。　１．４广藿香毛状根的鉴别　采用改良ＣＴＡＢ　］法提取广藿香毛状根总　ＤＮＡ用作ＰＣＲ扩增的模板，并用相同的方法提取　广藿香无菌苗正常不定根的总ＤＮＡ．以ｒ０Ｚ　基因　作为ＰＣＲ扩增的引物。　ｚ　Ｂ引物：Ｐ１，５　一ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＣＡＧＴ　Ｇ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＴＴ一３　；Ｐ２，５　．ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＡＧＣ　ＴＡＣ　ＣＴＣＴＣ一３　。ＰＣＲ扩增条件为：９４℃预变　性５　ｍｉｎ，９４℃变性３０　ｓ，５８℃退火３０　Ｓ，７２　延伸　１　ｒａｉｎ，进行３５个循环；最后７２℃延伸１０　ｍｉｎ，１２℃　保存＿１　。ＰＣＲ产物用质量分数０．８％琼脂糖凝胶电　泳和核酸染色进行分析。　２结果与分析　２．１　乙酰丁香酮质量浓度对广藿香毛状根诱导率　的影响　乙酰丁香酮是一种酚类化合物，可诱发发根农　杆菌内Ｒｉ质粒ＤＮＡ上　基因的活化和高效表达．　促进农杆菌Ｔ．ＤＮＡ向宿主细胞核转移，从而提高遗　传转化效率ｌｌ　。乙酰丁香酮广泛应用于双子叶植　物和单子叶植物的发根农杆菌介导的遗传转化中。　适当浓度的乙酰丁香酮可以提高转化率，但浓度过　高，会产生毒害作用ｌ】引。　由表１可知，添加不同质量浓度的乙酰丁香酮　ｌ５８　广东药学院学报　第３１卷　对广藿香毛状根的诱导率有显著的影响。乙酰丁香　酮质量浓度为１５　ｍｇ／Ｌ时，发根农杆菌ＡＴＣＣ１５８３４　和Ｃ５８Ｃ１的诱导率均达到最高，分别为６８．１％和　５０．０％。此时，发根农杆菌能够充分识别宿主细胞。　诱导率达到最高。乙酰丁香酮质量浓度为１０　ｍｇ／Ｌ　时，由于质量浓度较低，发根农杆菌不能充分识别宿　主细胞，诱导率仅为５８．３％和２５．０％　当乙酰丁香　酮质量浓度达到２０　ｍｇ／Ｌ时，由于质量浓度较高。产　生毒害作用阻碍了发根农杆菌与宿主细胞的结合，　诱导率分别降为１３．９％和４４．４％　表１　乙酰丁香酮质量浓度对广藿香毛状根诱导率的影响　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＡＳ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｓ　２．２预培养时间对广藿香毛状根诱导率的影响　外植体在侵染前要经过一定时间的预培养，因　为外植体产生伤口后在愈合的过程中会形成并释放　乙酰丁香酮等物质作为诱导发根农杆菌识别的信号　分子。经过预培养后，外植体能形成并释放这种信　号分子，提高转化率。同时，由于过敏反应的影响，　经发根农杆菌感染的外植体伤口处细胞可能导致褐　化．严重影响根的形成以及转化率，预培养也能较好　的解决褐化问题ｌ】ｏｌ　］。　由表２可知。预培养时间为１　ｄ时．发根农杆菌　ＡＴＣＣ１５８３４和Ｃ５８Ｃ１诱导广藿香毛状根诱导率分　别为７５．０％和６６．７％：预培养时间增加到２　ｄ时，诱　导率达到最高，分别为８３．３％和８０．５％；预培养时间　增加到３　ｄ时，诱导率有明显的下降。分别为６６．７％　和５８．３％。　２．３侵染时间对广藿香毛状根诱导率的影响　侵染的主要作用是让发根农杆菌与外植体充分　接触，并在乙酰丁香酮的作用下，对外植体进行有效　的感染。侵染时间过短，发根农杆菌与外植体没能　充分接触，不能对外植体进行有效的感染，会导致诱　导率较低。但侵染时间过长，外植体与发根农杆菌　过分接触，在共培养过程中会导致外植体伤口处长　满农杆菌，外植体由于农杆菌的毒害作用，最终会导　致外植体褐化、软腐和死亡，最终导致诱导率降低；另　外，侵染时间过长，导致附着在外植体表面和伤口处　的发根农杆菌数量较多，会增加除菌的次数和难度。　由表３可知．侵染时间为２５　ｒａｉｎ时，发根农杆　菌ＡＴＣＣ１５８３４和Ｃ５８Ｃ１诱导广藿香毛状根诱导率　达到最高，均为８０．５％；侵染时间少于２５　ｒａｉｎ时，由　于发根农杆菌与外植体不能充分接触。不能进行有　效的感染，诱导率低于８０．５％；侵染时间为３０　ｒａｉｎ　时，由于侵染时间过长导致的毒害作用，诱导率有所　下降。　表２预培养时间对广藿香毛状根诱导率的影响　Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｈａｉｙｒ　ｒｏｏｔｓ　表３侵染时间对广藿香毛状根诱导率的影响　Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｉｎｆｅｅｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ　ｃａｂｌｉｎ　ｈａｉｒｙ　ｒｏｏｔｓ　２．４共培养时间对广藿香毛状根诱导率的影响　外植体侵染过后要进行一段时间的共培养。共　培养的主要作用是在培养基的作用下，外植体继续　与发根农杆菌接触，使Ｔ．ＤＮＡ整合进入植物的核基　因组。随着共培养时间的增加，外植体与发根农杆　ｌ６０　广东药学院学报　第３１卷　上去，所以诱导率达到最高。但预培养时间为３　ｄ　时，诱导率有所下降，原因可能是预培养时间过长使　外植体开始向愈伤组织分化，感受态降低所致。　毛状根的培养已经广泛应用于植物次生代谢产　物的生产，并已成为获取植物次生代谢产物的重要　途径。王莉等＿】　］利用发根农杆菌ＬＢＡ９４０２诱导何　首乌毛状根并对其产生的活性成分进行检测，结果　表明毛状根培养物中大黄酸的质量分数是原植物的　２．８５倍。孙敏等ｌｌ　８］建立长春花毛状根培养体系并　对其生物碱质量分数进行测定，结果表明不同组织　中生物碱的质量分数不同，其中以毛状根的质量分　数最高（３３．１５７　ｍｇ／ｇ），分别是原植株根、茎、叶、愈　ＣＴＡＢ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔｓ　ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅａｅｅａｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐ，１９９４，１２（２）：　１０６—１０９．　［８］王颖芳，贾真，韩彬，等．改进ＣＴＡＢ法提取红豆杉毛状　根ＤＮＡ［Ｊ］．亚太传统医药，２０１２，８（４）：１９—２０．　［９］ＹＡＮ　Ｍｉａｏｍｉａｏ，ＷＥＩ　Ｇｕａｎｇｃｈｅｎ，ＰＡＮ　Ｘｉａｏｈｏｎｇ，ｅｔ　ａ１．Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ａｎｉｍａｌ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ——ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ａｇｒ　Ｓｃｉ　Ｔｅｃｈ，　２００８，９（２）：３８—４１．　［１Ｏ］孙敏．药用植物毛状根培养与应用［Ｍ］．重庆：西南师范　大学出版社，２０１０：２９．３３．　［１１］邓艺，曾炳山，赵思东，等．乙酰丁香酮在农杆菌介导的　遗传转化中的作用机制及应用［Ｊ］．安徽农业科学，　２０１０，３８（５）：２２２９—２２３２．　伤组织的３２．７５、４９．０１、２４．５０、３５．３４倍。　本研究已经成功利用发根农杆菌ＡＴＣＣ１５８３４　和Ｃ５８Ｃ１诱导广藿香毛状根，下一步将进行毛状根　的离体培养、质量分数测定等研究。　参考文献：　１２］施和平．李玲，潘瑞炽．乙酰丁香酮对发根农杆菌遗传　转化黄瓜的影响　Ｊ］．云南植物研究，１９９７，１９（４）：４４５—　４４８．　『１３］杨慧洁，杨世海．发根农杆菌介导的药用植物遗传转化　研究　Ｊ＿．生物技术通报，２００９（１）：ｌ６—２１．　『１］国家药典委员会．中华人民共和国药典：２０１０年版一部　『Ｍ１．北京：中国医药科技出版社，２０１０：４２—４３．　［２］赵爽，潘少丽．毛状根培养技术在中草药中的应用［Ｊ］．　时珍国医国药，２０１ｌ，２２（６）：１４８３—１４８４．　［３］张来，罗正伟，张显强，等．发根农杆菌Ｒｉ质粒的特征及　［１４］ＢＯＬＴＯＮ　Ｇ　Ｗ，ＮＥＳＴＥＲ　Ｅ　Ｗ，ＧＯＲＤＯＮ　Ｍ　Ｐ．Ｐｌａｎｔ　ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｉｎｄｕｃｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｌｏｃｉｎｅｅｄｅｄ　ｆｏｒ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ［Ｊ］．　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３２（４７５３）：９８３—９８５．　［１５］ＳＴＡＣＨＥＬ　Ｓ　Ｅ，ＮＥＲＳＴＥＲ　Ｅ　Ｗ，ＺＡＭＢＲＹＳＫＩ　Ｐ　Ｃ．Ａ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎｄｕｃｅｓ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｖｉｒ　其应用『Ｊ］．安徽农业科学，２０１０，３８（１５）：８１８３—８１８５．　『４］陈伟莉，牟旭鹏，刘冬影．毛状根在植物次生代谢产物生　产方面应用的研究进展［Ｊ］．黑河学院学报，２０１０，１１　（４）：１２２—１２６．　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ，１９８６，８３（２）：　３７９—３８３．　［１６］王关林，方宏筠．植物基因工程原理与技术［Ｍ］．北京：　科学技术出版社，１９９８：６．　ｆ　５１冯珂．丹参毛状根培养体系建立及诱导子的作用研究　［Ｄ］．陕西：西北农林科技大学，２０１０．　１７］王莉，于荣敏，张辉，等．何首乌毛状根培养及其活性成　分的产生［Ｊ］．生物工程学报，２００２，１８（１）：６９—７３．　１８］孙敏。曾建军．长春花毛状根培养及抗癌生物碱产生的　研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００５，３０（１０）：７４１—７４３．　『６］王学勇．丹参毛状根基因诱导表达分析及其有效成分生　物合成基因的克隆研究『Ｄ］．北京：中国中医科学院，　２００７．　『７］ＭＡＧＵＩＲＥ　Ｔ　Ｌ，ＣＯＬＬＩＮＥ　Ｇ　Ｇ，ＳＥＤＧＬＥＹ　Ｍ．Ａ　ｍｏｄｉｉｆｅｄ　（责任编辑：陈翔）　本刊荣获“中国科技论文在线优秀期刊”一等奖　近日，据教育部科技发展中心下发的《关于公布２０１３年度“中国科技论文在线优秀期刊”暨“中国科技论文在　线科技期刊优秀组织单位”评选结果的通知》，《广东药学院学报》荣获优秀期刊一等奖。这是我院学报在２００９～　２０１　１年连续３年获得该评比二等奖之后，首次荣获一等奖。　“中国科技论文在线”经教育部批准、由教育部科技发展中心主办，是优化科研环境、保护创新思想、方便快捷　开展学术交流、治理不正学风的重要平台。网站的《科技期刊》栏目成立９年来，收录了９００余种科技期刊，上网　论文１２０余万篇，论文下载量５　３１３万次，具有极大的影响力。　“中国科技论文在线优秀期刊”的评选，是根据已收录期刊的复合影响因子、下载量、期刊完整度、提供数据的　及时程度、开放存取、编委国际化程度等６项指标进行综合评审。本次共评出一等奖７９项（医药卫生类９项）、二　等奖１４２项（医药卫生类１３项）、优秀组织单位６１个。　（本刊编辑部）