脂蛋白相关磷脂酶A2免疫荧光层析法的建立及临床应用

谢海涛;汤永平;解巧丽;张晓丽;潘秀华

【摘 要】目的 建立脂蛋白相关磷脂酶A2免疫荧光层析定量测定方法,并对其进行临床应用评价. 方法利用双抗体夹心法,研制脂蛋白相关磷脂酶A2时间分辨免疫荧光层析试纸条,通过检测其线性范围、最低检测限、精密度等指标进行实验室性能评估;选取230例临床血清样本,同时使用本方法和美国Diadexus公司的脂蛋白相关磷脂酶A2试剂进行比对试验,进行临床应用评估. 结果 脂蛋白相关磷脂酶A2免疫荧光层析定量测定试剂线性范围为20 μg/L~1000 μg/L,最低检测限为10 μg/L,重复检测不同浓度的脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白,批次内及批次间变异系数均小于10%;本试剂与美国的Diadexus公司的试剂检测临床样本的总符合率为

90.87%,Kappa值为0.804,相关系数r=0.968,相关性具有统计学意义(P<0.01). 结论 免疫荧光层析法测定脂蛋白相关磷脂酶A2,各项分析指标均能达到临床要求,且便捷准确,可用于临床血清样本的快速检测. 【期刊名称】《中南医学科学杂志》 【年(卷),期】2017(045)005 【总页数】5页(P523-527)

【关键词】脂蛋白相关磷脂酶A2;免疫荧光层析;动脉粥样硬化 【作 者】谢海涛;汤永平;解巧丽;张晓丽;潘秀华

【作者单位】南华大学附属第一医院检验科,湖南 衡阳421001;广州市微米生物科技有限公司;广州市微米生物科技有限公司;广州市微米生物科技有限公司;广州市微米生物科技有限公司

【正文语种】中 文 【中图分类】R446.11

利用双抗体夹心法，研制脂蛋白相关磷脂酶A2时间分辨免疫荧光层析试纸条，通过检测其线性范围、最低检测限、精密度等指标进行实验室性能评估；选取230例临床血清样本，同时使用本方法和美国Diadexus公司的脂蛋白相关磷脂酶A2试剂进行比对试验，进行临床应用评估。 结果 脂蛋白相关磷脂酶A2免疫荧光层析定量测定试剂线性范围为20 μg/L～1 000 μg/L，最低检测限为10 μg/L，重复检测不同浓度的脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白，批次内及批次间变异系数均小于10%；本试剂与美国的Diadexus公司的试剂检测临床样本的总符合率为90.87%，Kappa值为0.804，相关系数r=0.968，相关性具有统计学意义(P<0.01)。 结论 免疫荧光层析法测定脂蛋白相关磷脂酶A2，各项分析指标均能达到临床要求，且便捷准确，可用于临床血清样本的快速检测。

脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)是心血管疾病中一种新的炎症酶，能水解氧化低密度脂蛋白(low density

lipoprotein， LDL)，产生溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，Lyso-PC)和氧化型游离脂肪酸(oxidized free fatty acids，ox-FA)，促进动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的形成和发展，其与临床疾病的关系日益受到关注。近年来研究认为对Lp-PLA2水平的检测可以识别心脑血管病高危个体[1]。 Lp-PLA2由PLA2G7基因编码，又被称为血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor-AH，PAF-AH)，属于磷脂酶家族中PLA2的一种，是丝氨酸依赖的磷脂酶，其催化活性不需要Ca2+。迄今为止，已知Lp-PLA2有两种类型：血浆型Lp-PLA2与细胞型Lp-PLA2。血浆型Lp-PLA2分子量为45 kDa；细胞型Lp-PLA2包括：Lp-PLA2II、Lp-PLA2 Ib [2]。人血浆Lp-PLA2主要由成熟的巨

噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、肝细胞等分泌生成，并受炎性介质的调节，如γ干扰素和脂多糖抑制其分泌，血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)促进其分泌。Lp-PLA2的主要作用包括：产生二十烷酸类炎性介质、参与磷脂重建及生物膜的稳定平衡、脂蛋白的代谢、细胞信号传递、宿主反应、促进机体坏死组织自体消失等[3]。

目前实验研究及流行病学研究结果揭示了Lp-PLA2能生成的多种促炎产物，并参与从动脉粥样斑块形成到斑块不稳定的各个阶段，具有促进炎症反应作用，成为新的心脑事件独立预测因子。所以，建立灵敏便捷的Lp-PLA2检测方法对冠心病的早期诊断预后有重要意义[4]。目前国内各大医院多使用进口试剂盒如美国Diadexus公司的Lp-PLA2产品进行Lp-PLA2检测，操作繁琐、测定时间长，本文拟采用时间分辨免疫荧光层析技术建立快速检测Lp-PLA2试剂盒。 1.1 标本来源 230例临床血清由南华大学附属第一医院检验科提供。

1.2 材料与试剂 Lp-PLA2单克隆抗体1#和2#，Lp-PLA2蛋白均购于上海领潮生物科技有限公司；羊抗鼠IgG、吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、PVC板、聚酯纤维素膜等购于上海杰一生物有限公司；荧光微球购自德国默克公司；比对试剂购自美国Diadexus公司(酶联免疫法)。

1.3 仪器与设备 HM3030三维平面点膜喷金仪购于上海金标生物科技有限公司；C6M切条机购于上海韩感电子科技有限公司；免疫荧光检测仪购于广州蓝勃生物科技有限公司。

1.4 Lp-PLA2免疫荧光层析试剂的制备 试纸条由卡壳、PVC底板、吸收垫、硝酸纤维素膜(CN95)、结合垫、样品垫构成。用划膜仪将羊抗鼠IgG(0.5 g/L)和Lp-PLA2的单克隆抗体2#(1g/L)分别包被在硝酸纤维素膜上，作为质控线和检测线，于35 ℃恒温箱中干燥8 h，即为反应膜；将Lp-PLA2单克隆抗体1#按碳化二亚胺法偶联到纳米荧光微球上，抗体与微球的比例为1∶3，用点膜喷金仪喷于聚酯

纤维素膜上，于35 ℃恒温箱中干燥8 h，即为结合垫；将聚酯纤维素膜浸泡在含有20 g/L海藻糖、5 g/L BSA的0.2 mol/L硼酸—硼砂缓冲液(pH=8.0)中，待液体扩散均匀后，取出放置于架子上室温晾干，即为样品垫。组装与检测原理如图1所示。

1.5 试剂性能分析

1.5.1 标准曲线的建立 用0.01 mol/L PBS (pH7.4)配制0、20、100、200、500、1 000 μg/L的Lp-PLA2蛋白溶液，取样75 μL滴至测试卡孔中，10 min后放置于荧光检测仪测试，每个浓度点重复测试3次。采用双对数拟合模型，以Lp-PLA2蛋白浓度对数值为横坐标，相应浓度的检测线与质控线荧光信号比值(T/C)的对数值为纵坐标，绘制剂量—反应曲线。

1.5.2 最低检测限 最低检测限是指分析方法的最小检出量，以10组标准曲线零值测试，求得T/C平均值和标准差(s)，计算在标准曲线上对应浓度，即为最低检测限。

1.5.3 精密度 取三个批次的Lp-PLA2试剂，分别检测40、200、600 μg/L的Lp-PLA2蛋白，每批次重复检测10次，计算测试浓度的变异系数(coefficient variation，CV)，并将三批次的检测结果分析，计算批次间的变异系数。 1.5.4 准确度 用20、100、200、500、1 000 μg/L的Lp-PLA2蛋白重复测定3次，按拟合的方程计算出相应的浓度，计算与标示浓度的相对偏差。

1.5.5 干扰实验 为考察血液中常见干扰物对试剂的影响，在不同浓度的血红蛋白、甘油三酯、胆红素中分别加入Lp-PLA2蛋白，使Lp-PLA2终浓度为40 μg/L、200 μg/L、600 μg/L，重复测试3次，并计算其相对偏差的平均值，观察检测结果相对偏差的变异系数是否在10%以内，而判定干扰物对样本测试是否有干扰。 1.5.6 临床应用对比 本方法与美国Diadexus公司Lp-PLA2试剂同步测试230例临床样本，绘制四格表，以Diadexus试剂测试结果为参照，分析本方法的符合率，

并进行卡方试验及相关性评价。

1.6 统计学处理 运用SPSS13.0软件，计量数据用表示，变异系数用百分数表示(%)，并采用t或χ2检验， P<0.05为差异有显著性。

2.1 建立Lp-PLA2标准曲线 配制20、100、200、500、1 000μg/L的Lp-PLA2蛋白进行检测，每个浓度重复3次测试，将荧光检测仪检测的信号值T/C与测试样品的浓度进行双对数拟合，T/C值对数值为纵坐标，样品浓度对数值为横坐标，双对数拟合方程为Y= 0.9908X- 1.4772，R2= 0.9993。结果表明二者线性关系良好，标准曲线可以很好的反映荧光信号值与样品浓度的关系，即荧光信号值越高，样品浓度越高。本试剂最低检测限为10 μg/L，方法学的线性范围为20～1 000 μg/L。见图2。

2.2 最低检测限 测试10次零浓度点的在标准曲线上所得到的相应浓度值为检测的灵敏度，可知本试剂的最低检测限为10 μg/L。

2.3 精密度 从表1可知，用40、200、600 μg/L的Lp-PLA2蛋白，每批次重复检测10次，本试剂的批次内CV<10%，批次间CV<10%，结果表明试剂精密度较好。

2.4 准确度 用20、100、200、500、1 000 μg/L的Lp-PLA2蛋白，每批次重复测定3次，从表2可知，本试剂在检测20～1 000 μg/L范围内的Lp-PLA2的相对偏差均小于±15%，结果表明试剂的准确度较好。

2.5 干扰实验 从图3、图4、图5可知当血红蛋白浓度低于5 g/L，甘油三酯浓度低于10 g/L时，胆红素浓度低于0.2 g/L，对低(40 μg/L)、中(200 μg/L)、高(600 μg/L)浓度的Lp-PLA2蛋白重复测试3次，检测结果CV在10%以内，具有良好的精密度，此时干扰物对样本测试无干扰。

2.6 本试剂与比对试剂的临床符合率 用SPSS统计软件对考核数据进行统计学分析，从本试剂与比对试剂的对比结果(表3)可知两者总符合率为90.87%，阳性符合率

为79.34%，阴性符合率为98.55%，调整一致性90.74%。本试剂与比对试剂阴阳性一致性检验结果Kappa值为0.804(表4)，两者一致性较好。

2.7 本试剂与比对试剂检测结果相关性分析 将两种试剂检测结果进行相关性分析，结果显示研制的Lp-PLA2免疫荧光定量测定试剂与美国Diadexus公司的Lp-PLA2定量试剂盒(酶联免疫法)测值之间有良好的线性回归关系，回归方程为Y= 1.205X-15.550(n=230)，相关系数r=0.968；P值小于0.01，相关性具有统计学意义(表5，图6)，两者结果一致性较好。

动脉粥样硬化是一种严重危害人类健康的常见病，是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病的主要病理基础。斑块形成，斑块由稳定变成不稳定，不稳定斑块容易破裂，引起凝血反应，致使血小板凝聚，血栓形成，这是造成冠心病的主要原因[5-6]。Lp-PLA2水平与心脑血管疾病呈显著正相关，是血管炎症的独立预测因子，因此对心脑血管栓塞性疾病的预测、治疗和预后的判断具有重要意义[7-9]。

本试剂采用时间分辨免疫荧光层析技术(time-resolved fluorescent immune-chromatographic assay，TRFICA) ，以三价镧系元素及其螯合物标记抗体分子，层析待反应体系发生后，用时间分辨法检测信号。Eu3+螯合物的发光特点：stokes位移大，激发光谱与发射光谱不重叠，可减少由激发光引起的特异杂散光对检测的干扰，提高检测的灵敏度与准确度；荧光寿命长，检测中在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命背景荧光物质消失后，再检测长寿命Eu3+鳌合物发射的特异性荧光，可以避免本底荧光对待测物的干扰，提高检测精密度；时间分辨荧光激发波长较宽，发射光谱范围较窄，极大地降低了本底荧光，实现了高信噪比[10-14]。

与比对试剂相比，本方法具有以下优势：(1)最低检出限和精密度与进口试剂相当；(2)操作过程简单，测定时间短，10 min即可得实验结果，不需要昂贵的仪器设备，

测试结果基本不受环境因素干扰，适合临床应用；(3)既可以用于大规模临床样本测试，又可单人份检测，减少患者等待时间。

本方法试剂灵敏度为10 μg/L，线性范围为20 μg/L～1 000 μg/L，精密度良好(批次内与批次间CV均小于10%)，测试浓度与Lp-PLA2校准品相对偏差小于±15%，当血红蛋白浓度低于5 g/L、甘油三酯浓度低于10 g/L时、胆红素浓度低于0.2 g/L，检测结果CV在10%以内，精密度较好，此时干扰物对样本测试无干扰；与酶联免疫法相比，两种方法相关性良好(r=0.968)。

综上所述，本法建立的Lp-PLA2免疫荧光层析试剂性能达到了相关检测标准，具有灵敏度高、特异性好、定量检测准确、操作简单、快速诊断、配套仪器小巧智能、成本较低等优点，既能满足大型医院门诊科室随来随检的诊疗需求，又适合在社区农村基层医院中进行推广使用。

【相关文献】

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