叶绿体的分离及荧光染色观察

叶绿体的分离及荧光染⾊观察

泮⼒菁 2011级⽣物基地 201100140091 同组者：商倩倩【实验⽬的】1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离与纯化的原理和⽅法；2、熟悉荧光显微镜的使⽤⽅法，观察叶绿体的⾃发荧光和间接荧光；3、复习巩固制⽚及染⾊的基本技术。【实验原理】

1、真核细胞由细胞膜、细胞核和细胞质组成。细胞质中含有若⼲细胞器和细胞⾻架，这些结构被称为亚细胞组分。分离亚细胞组分的⽅法主要有差速离⼼和密度梯度离⼼两种。2、差速离⼼和密度梯度离⼼：

差速离⼼法是在密度均⼀的介质中由低速到⾼速的逐级离⼼⽤于分离不同⼤⼩的物体。离⼼速度逐渐提⾼，样品会按先⼤后⼩的顺序沉淀。在差速离⼼中细胞器沉降的顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体和过氧化物酶体、内质⽹和⾼尔基体。最后为核糖核蛋⽩复合体。由于各种细胞器在⼤⼩和密度上可能相互重叠。⼀般差速离⼼2-3次，分离效果会好⼀些。差速离⼼只⽤于分离密度和⼤⼩悬殊的细胞或细胞器，并且得到的产物纯度较低。若对产物纯度的要求较⾼，则需要密度梯度离⼼来分离纯化。密度梯度离⼼法是利⽤⼀定的介质在离⼼管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离⼼⼒的作⽤使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与⾃⾝密度相同的沉降区带中。这种离⼼技术⼜可分为速度沉降和等密度沉降两种。速度沉降主要⽤于分离密度相近⽽⼤⼩不同的物体，⽽等密度沉降⽤于分离密度不同的物体。

叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器。它是⼀种⽐较⼤的细胞器，利⽤差速离⼼即可分离收集，然后⽤密度梯度离⼼纯化，便可⽤于各种研究。3、荧光：

光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进⼊激发态，当从激发态进⼊基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称之为“光致发光”。紫外辐射，可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。

荧光：在光致发光中，如果⼀定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进⼊激发态，并⽴即激发在极短的时间内能发射出⽐照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。⼀旦停⽌⼊射光，发光现象也随之⽴即消失。荧光的性质：A、吸收光，必须有激发光源；B、荧光波长⼤于激发波长（损失热能）；C、荧光强度⼩于激发光的强度；D、有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光。猝灭剂等，因此可以先拍照，后观察）；E、荧光强度取决于激发光强度，被检物浓度、荧光效率（在制作荧光显微标本时最好使⽤⽆荧光载玻⽚、盖玻⽚和⾹柏油）。荧光显微镜的光源有汞灯光源（提供激发光：U,V,B,G），疝灯光源：⾼峰值更宽，更稳定）。4、荧光显微镜及其操作的注意事项：

激发光源启动后，15min之内不得关闭电源，⼀旦关闭电源，3min内不得重新启动；光路对中；选择相对应的激发滤⽚，阻断滤⽚和双⾊滤⽚；需照⽚时，应该及时拍照，否则效果可能会降低。激发滤⽚：得到想要的激发光；双⾊镜：三⾓棱镜。起分离激发光和荧光的作⽤；阻断滤⽚：阻挡未转化成荧光的激发光，三者组合成为激发滤块；荧光显微镜的物镜与标本离得较近，⽤于多收集荧光；5、染⾊剂吖啶橙：

A、探针特性：AO是三环杂芳⾹类荧光探针，既可以标记DNA，⼜可以标记RNA，⽤蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光；AO与核酸的结合分为强结合⽅式和弱结合⽅式两种：⼀种是嵌⼊核酸双链的碱基对之间，另⼀种是与单链核苷酸的磷酸发⽣静电间相互作⽤。强结合作⽤⼜称插⼊性⽅式。AO分⼦插⼊在双链核酸的碱基对之间，它们的结合能量为6-10kcal/mol探针，插⼊后的探针分⼦与核酸结合更加稳定，每插⼊⼀个AO分⼦，双链结构就发⽣26度旋转，这样在⼀个位点上就限制了AO分⼦插⼊的数⽬，每隔三个碱基插⼊⼀个AO分⼦，这种⽅式的结合，主要是AO分⼦与DNA结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿⾊荧光。弱结合⽅式：即静电吸引结合⽅式，带正电荷的AO分⼦与带负电荷的磷酸和结合，每个磷酸根的位点上均可结合⼀个AO分⼦，最⼤结合率为1:1，这种结合⽅式主要是AO分⼦与RNA结合，其发射波长为640nm呈红⾊荧光。AO愈合素昂的结合在低浓度下最佳，此时插⼊性强结合作⽤⽅式占优势。

B、AO的主要应⽤：对细胞内单链或双链DNA/RNA定性或定量测定；分析核酸内部结构及核酸的细胞成分构象；观察DNA凝胶电泳情况；作为细胞内PH梯度的显⽰剂，⽤来检测离⼦交换，钙离⼦诱导的质⼦浓度梯度变化等。

【实验器材】1、材料：新鲜菠菜；

2、试剂：吖啶橙染⾊剂；0.35mol/L 的NaCl溶液；

3、实验器材：普通或⾼速离⼼机；电⼦天平；荧光显微镜；剪⼑；滴管；离⼼管；盖玻⽚，载玻⽚；镊⼦；普通显微镜等；【实验步骤】

1、选取新鲜嫩滤菠菜叶,去叶梗及粗脉,洗净擦⼲，称30克放于150ml 0.35M.Nacl 溶液中；2、将叶、液同装⼊组织捣碎机中，匀浆3–5分钟，转速5000r/min；3、将匀浆⽤纱布(6层)过滤于500ml 烧杯中；4、取滤液4ml在1000r /min 下离⼼2min；

5、取上层清液在3000r /min下离⼼5min(沉淀为叶绿体和细胞核混合物)；6、将沉淀⽤2-3ml 0.35MNaCl 溶液悬浮；7、取⼀滴悬液滴⽚，加盖⽚后显微镜下观察；

8、另取⼀滴悬液滴⽚，再滴加⼀滴0.01%的吖啶橙染料，混匀，盖上盖⽚，在荧光显微镜下观察。

9、另取新鲜叶⽚，从叶⽚的下表⾯撕取表⽪制成装⽚，在普通显微镜及荧光显微镜下分别观察⽓孔及⽓孔周围的叶绿体。【实验结果】1、实验图⽚：

图1：普通光学显微镜下的菠菜叶⽚表⾯⽓孔

图2：荧光显微镜下的⽓孔周围的叶绿体（红⾊）（右为放⼤后的涂⽚）

图3：普通光学显微镜下的叶绿体

图4：荧光显微镜下的叶绿体 图5：吖啶橙染⾊后荧光显微镜下的叶绿体 ⽓孔 叶绿体叶绿体2、实验结果：

A、⽓孔为成对存在的肾形保卫细胞构成，保卫细胞中含有叶绿体，保卫细胞中的叶绿体发出红⾊荧光并围绕⽓孔排列⼀圈（如图1图2）；

B、普通光学显微镜下，叶绿体为绿⾊，橄榄形，若在⾼倍镜下观察，可以看到叶绿体内部含有颜⾊较深的绿⾊⼩颗粒，即基粒；

C、使⽤荧光显微镜，在选⽤B激发滤⽚，B双⾊镜和O530阻断滤⽚的条件下，叶绿体发出⽕红⾊荧光；

D、加⼊吖啶橙后，叶绿体可发出橘红⾊荧光，视野中亮绿⾊的为细胞核碎⽚等杂质。3、实验结果分析：

A、在普通显微镜下，观察到⽓孔由两个保卫细胞组成，然⽽因为镜头有污染，可以看到照⽚的正中央位置有些模糊；B、在荧光显微镜下观察到保卫细胞内部的叶绿体，放⼤后更加明显，却也有⼀些模糊；背景为⿊⾊，说明其他的结构没有⾃发荧光；

C、普通光学显微镜下可以看到绿⾊橄榄形的叶绿体，还有其他的⼀些杂质，如细胞核碎⽚等，但是杂质不是绿⾊，可以区分；

D、荧光显微镜下的游离叶绿体发出⽕红⾊的荧光，可以看到，叶绿体较多，背景为⿊⾊；

E、吖啶橙染⾊后在荧光显微镜下观察，可以看到橘红⾊的叶绿体以及亮绿⾊的细胞核碎⽚等杂质，背景为较亮的黄绿⾊，说明悬液中其他的杂质存在；

F、总体来说，此次实验的结果较为理想，找到了应该找到的结构，并进⾏了拍照记录，学习了使⽤荧光显微镜；【实验反思与总结】1、注意事项：

A、要得到完整的，有活性的叶绿体，需在低温下迅速提取，图⽚后⽴即观察；

B、利⽤荧光显微镜对可发荧光的物质进⾏观察时，会受到许多因素的影响，如温度、光、猝灭剂等。因此在进⾏荧光观察时应抓紧时间，必要时应⽴即拍照。

C、在制作荧光标本时，最好使⽤⽆荧光载玻⽚，⽆荧光盖玻⽚和⽆荧光⾹柏油；

D、⽤菠菜叶提取叶绿体时，尽量使⽤鲜嫩的菠菜，去掉梗，打碎叶⽚时转速不可以过⾼，否则叶绿体也会遭到⼀定的破坏；E、在撕取菠菜叶表⽪时，应该选⽤下表⽪并且厚度适中，在1.35M的氯化钠溶液中铺平，盖盖玻⽚时尽量保证⽆⽓泡；F、由于荧光会慢慢变得不明显，最好吖啶橙染⾊后⽴即拍照观察，在照⽚上分析，这就要求拍照要迅速清晰；2、思考题：

A、在荧光显微镜下观察叶绿体的⾃发荧光时，更换滤⽚系统，叶绿体的颜⾊是否有变化？

答：有变化,因为叶绿体的颜⾊取决于发出荧光能量的⾼低，更换不同的滤⽚，激发光会不同，叶绿体得到和辐射的能量就会不同，颜⾊也就会不⼀样。B、游离叶绿体和完整细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，颜⾊和荧光强度有⽆差异？为什么？答：有区别，因为完整细胞内的叶绿体还要进⾏光合作⽤，这会消耗掉⼀部分所吸收的光，所以最后释放的荧光能量就会⽐游离核糖体所释放的⼩，颜⾊和荧光强度就会有差别。C、根据观察的实验现象，描述⾃发荧光和次⽣荧光的区别？

答：某些物质受激发光照射后课直接发出荧光，如叶绿素、⾎红素的⽕红⾊荧光或⽊质素的黄⾊荧光，称⾃发荧光（直接荧光）。

某些物质本⾝不发荧光，但他经荧光染料染⾊后，再通过紫外线照射也能够发出荧光，这种荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染⾊后可发出橘红⾊荧光。

D、叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？

答：匀浆破碎细胞，利⽤差速离⼼⽅法分离等渗介质中的悬浮颗粒，⼿机类叶绿体⼤⼩的颗粒，得到叶绿体（差速离⼼：颗粒在离⼼场中的沉降速率取决于颗粒的⼤⼩、形状和密度。也可同离⼼⼒以及悬浮介质的粘度有关，在⼀定的离⼼场中，同⼀时间内，密度和颗粒⼤⼩不同的颗粒其沉降速率不同；依次增加离⼼⼒和离⼼时间，就能使⾮均⼀悬浮液中的颗粒按其⼤⼩、密度先后分批沉降在离⼼管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分）叶绿体的分离应该在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进⾏，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤；分离过程最好在0-5摄⽒度的条件下进⾏，如果在室温下，要迅速分离和观察。3、实验⼩结：

此次实验的主要内容是叶绿体的分离与荧光染⾊观察，并没有涉及⽤密度梯度离⼼进⾏纯化的过程，因此可以看到，在⽤吖啶橙染⾊后，仍然有除去橘红⾊的染⾊之外的亮绿⾊以及绿⾊的背景，说明含有细胞核碎⽚及其他的杂质，但是叶绿体仍然能够很明显的区分出来；此次实验学会了⽤荧光显微镜，并且在荧光显微镜下进⾏拍照。荧光显微镜下的保卫细胞中的叶绿体以及

游离的叶绿体都是会⾃发产⽣⽕红⾊的荧光，说明叶绿体可以⾃发荧光。

此次实验，锻炼了我的实验技能以及合作能⼒，巩固了制⽚与染⾊的实验技能，我学到了荧光显微镜的结构及光路原理以及使⽤的注意事项，并且学会了分离细胞器的⽅法。【参考⽂献】

《细胞⽣物学实验》第三版，⾼等教育出版社，王崇英，⾼清祥。