核酸扩增检测实验室环境污染的监测

・实验室检测・２０９性病核酸扩增检测实验室环境污染利蚴！ｆ中国疾病预防控制中心性病控制中心摘要施美琴戴秀芹孙秀峰尹跃平目的为保证聚合酶链反应（ＰｃＲ）实验结果的准确、可靠，对ＰｃＲ实验室各区域是否存在污染进行监潮。方法使用实验室常规检洲病原体淋球茵（ＮＧ）和沙眼衣原体（ＣＴ）ＤＮＡ检潮．对ＰＣＲ实验室四个区域使用的实验台、离心机、冰箱、移液器等仪器设备共计２２个部位每月一次进行检潮。结果共检测３６次，一区、二区ＣＴ、ＮＧ检测全部为阴性，表明未发生污染，三区拭子④、四区拭子⑤⑥的ＮＧ检测结果有４次为不确定。经复检后都为阴性。四区拭子⑤⑥ＣＴ、ＮＧ检测结果合计有１１次为抑削，其他均为阴性，对其中的７次进行复检，５次为阴性，２次复检后蛄果为抑制。结论每月一次检测可有效监测ＰＣＲ实验室是否存在污染。以便夏时采取措施消除污粢潭。关键词聚合酶链反应；沙眼衣原体；琳球茸；环境监测；污染聚合酶链反应（ＰＣＲ）具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点，目前已广泛应用于临床检测工作，由于存在假阳性和假阴性的问题所以该方法在实际使用中有一定的局限性…１。由于ＰＣＲ技术的高度敏感性，在体外具有很高的扩增效率，故在实验过程中从样本制备到结果产生的每个环节如处理不当将会造成实验室污染，导致假阳性结果【２】，所以预防和控制污染尤其重要。为了有效监测实验室是否发生污染，我们在日常工作中每月一次对ＰＣＲ实验室四个区域的环境、仪器、使用的物品等进行检测，以达到环境污染监测的目的，现将结果报告如下：１．材料和方法：１．１器表面、通风柜台面、冰箱门把手、洗板机表面，拭子⑥取四区实验台面、孵箱内壁、酶标仪检测面。１．４结果判断标准：ＣＴ判断标准：阳性：ＯＤ值≥０．８。阴性：ＯＤ值＜０．２。不确定（灰区）：０．８＞ＯＤ值≥０．２，需对样本重新进行双管检测。以３次结果中２次结果为最终判定结果；ＮＧ判断标准：阳性：ＯＤ值≥２．５。阴性：ＯＤ值＜０．２。不确定：２．５＞ＯＤ值３０．２，需对样本重新进行双管检测，以３次结果中２次结果为最终判定结果；抑制（假阴性）：内对照（ｉｃ）ＯＤ值＜０．２，ＣＴ、ＮＧ结果都是阴性，表明样本为假阴性，需对原样本进行１０倍稀释再进行检测，如再次出现假阴性视为无效结果，需重新采样；６个拭子中如有检测结果阳性，需对其采样的部位分别重新采样并进行检测，以确定哪个部位发生污染，如结果为阴性即该拭子所采样的部位均判阴性。１．５实验方法：实验室常规检测病原体ＣＴ、ＮＧＤＮＡ的检测方法，使用美国罗氏公司生产的Ａｍｐｌｉ．ｃａｔｉｏｎＣＴ／ＮＧＴｅｓｔ双检试剂盒，试剂盒具有内对照系统及含尿嘧啶糖苷酶的ＡｍｐＥｍｓｅ防污染系统，实验操作严格按照试剂盒的说明书要求进行。１．２采样方法：在２ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｆｆ管中加入ｌｍＬ无菌去离子水，使用无菌人造纤维采样拭子，蘸取去离子水，分别对需要取样的部位进行滚动式采样，将已采样的拭子放入拭管内，反复涮洗，沿管壁尽量将拭子挤干，弃拭子，将拭子洗脱液用于ＣＴ、ＮＧ的ＤＡＮ检测。１．３采样部位：分别用６个拭子对ＰＣＲ实验室四个区域内的仪器设备等２２个部位进行采样，其中拭子①取一区实验台面、超净工作台台面、冰箱门把手、加样器表面，拭子②取二区中不同量的加样器表面（共４把），拭子③取二区中实验台面、生物安全柜台面、冰箱门把手、孵箱内壁、离心机内孔，拭子④取三区实验台面、ＰＣＲ扩增仪内孔，拭子⑤取四区加样ＰＣＲ实验室清洁消毒方法：每次实验前将各区用紫外灯消毒０．５小时以上，实验结束后将使用物品和实验台面等用１０％（ｖ／ｖ）次氯酸钠擦拭清洁后再用７０％的乙醇擦拭清洁，实验室用紫外灯消毒４小时以上。２．结果：３６次检测，一区、二区ＣＴ、ＮＧ检测全部为阴性，三区拭子④、四区拭子⑤⑥的ＮＧ检测结果有４次为不确定，其他均为阴性。不确定样本经复检后均为阴性。四区拭子⑤ＣＴ、ＮＧ检测结果有８次为抑制，抑制率为２２．２％，其他均为阴性，抑制样本中有４次复检后为阴性，３次未进行复检，１次复检后为抑制，表明样本为无效结果，拭子⑥ＣＴ、ＮＧ检测结果３次为抑制，抑制率８．３３％，其中有１次复检后为阴性，１次未进行复检，１次复检后抑制，表明样本为２１０・实验室检测－无效结果，检测结果显示除４份样本未进行复检和２份样本为无效结果外，连续３６次检测未出现污染裹ｌ结果。（见表１）。ＰＣＲ实验窒各区域ＣＴ、ＮＧ环境污染检测结果备注：－有部分样本未进行复检或复检后结果为抑制３．讨论引起ＰＣＲ实验室污染的的主要污瓤源有：标本问的交叉污染（如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本）、ＰＣＲ试剂的污染（储存液或工作液）、ＰＣＲ扩增产物的污染和实验中克隆质粒的污染等。由于ＰＣＲ方法的敏感性和特异性较高，在体外能扩增出大量的ＤＮＡ产物，ＰＣＲ扩增产物会污染实验视中的试剂、仪器设备、通风系统，从而造成实验室污染，出现假阳性结果Ｌ２Ｊ。为防止ＰＣＲ实验室发生污染应采取相应的预防措施：１、合理分隔实验室：按照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》和《临床基因扩增检验实验室工作规范）中的要求将ＰＣＲ实验室分成３—４区【３．４１；２、实验耗材的选择：选择质量好的带螺旋式盖子的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管以防标本溅出，使用带滤芯的吸嘴可以防止气溶胶污染加样器。３、含防污染系统的试剂盒：该方法是在合成引物时，将ｄ，Ｉ－ｒＰ替换成ｄＵＴＰ，在ＰＣＲ扩增之前，如果有含ｄＵＴＰ引物扩增出ＰＣＲ产物污染试剂，加入ＵＤＧ水解后，可破坏模板ＤＮＡ中引物结合位点，使污染的模板不能扩增，从而达到预防污染的目的【６Ｊ，但短于１００ｂｐ的ＰＣＲ产物不能完全去除污染，而且不防止天然产物的污染【５】。３、紫外线（ｕＶ）照射：紫外线照射可使残留在物体表面的ＤＮＡ失活以消除或减少扩增产物的污染，但照射距离应掌握在６０—９０ｅｒａ，时间控制在４小时以上才能达到理想的效果。４、实验室清洁处理；主要采用擦拭清洁的办法，即在每次实验结束后用１０％（ｖ／ｖ）次氯酸钠将需要清洁的物体表面反复擦拭，再用７０％的乙醇或清水擦拭以去除残留的次氯酸钠，次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作用，从而使可能留在物体表面的扩增产物被破坏掉【２Ｊ。５、高压消毒：实验产生的废弃物应先置于２％一１０％（ｖ／ｖ）次氯酸钠或稀盐酸中浸泡后再进行高压消毒，所有的实验耗材均高压消毒后才能使用，对移液器应定期进行高压消毒，避免由于操作不慎将样本或模板核酸吸入枪内而引起的交叉污染。・实验室检测・ＰＣＲ实验过程的监测：在每批试验中除试剂盒中的阳性和阴性对照外应随机插入外部阳性和阴性对照样本，阳性对照样本是监控整个扩增检测有效性的综合反映，在ＰＣＲ定性检测中应加入靶值为弱阳性的对照样本，在定量检测中加入靶值为强、中及弱阳性的对照样本，阴性对照样本是监测反应体系中是否发生污染的重要依据，外部阳性和阴性对照样本应随机插入，与待检样本等同处理进行检测。ＰＣＲ实验室环境污染监测：目前还没有对ＰＣＲ实验室环境污染进行监测的相关报道，我们对ＰＣＲ环境中各区域内的仪器设备等所有使用的物品表面进行检测，可以有效监测实验室各区域是否存在污染源的作用，以便及时发现污染消除污染源。目前ＰＣＲ检测试剂比较昂贵，每次实验进行环境污染检测因涉及到费用问题在实际操作中有一定的难度，将多个样本集中混合作为一份样本进行检测，在检测频度上每月进行一次检测，即节省费用又能达到监测污染的目的。ＰＣＲ实验假阴性结果的出现，通常是由于在临床标本核酸提取过程中靶核酸的丢失和提取试剂（如有机溶剂等）的残留、标本中抑制物的去除不彻底、扩增仪孔间温度差异等所致，为避免假阴性结果，最有效的方法是试剂盒中设内对照系统（内标），用于假阴性质控的内标一般为竞争性内标，即所用２ｌｌ引物序列、扩增片段长短、片段的Ｇ＋Ｃ％等均与待扩增的靶序列相似…，在每一份样本制备时将内标加入反应体系中，如内标没有出现扩增，样本检测亦为阴性，则样本很可能为假阴性，需对样本进行处理后重新进行检测。由于我们使用的试剂盒有内标系统，在监测过程中发现，四区拭子⑤⑥有１１次出现假阴性，对其中的７次假阴性样本进行重新检测，有５次结果为阴性，有２次结果还是出现抑制，查找原因发现是物品表面的次氯酸钠残留导致ＰＣＲ假阴性，经对物品表面用清水反复进行擦拭处理后，无假阴性结果出现。本实验结果显示四区中⑤⑥出现假阴性结果的频率分别为２２．２％、８．３３％，说明出现假阴性的频次较高，在临床检测中应引起高度的重视。参考文献［１］李金明。聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性，中华检验医学杂志２００５，２８：２２５—２２７［２］李金明编著，实时荧光ＰＣＲ技术，北京：人民军医出版社，２００７．１１［３］＜临床基因扩增检验实验室管理暂行办法＞卫医发（２００２）１０号【４］＜临床基因扩增检验实验室工作规范＞卫检字（２００２）８号［５］申子瑜、李金明编著，临床基因扩增检验技术，北京：人民卫生出版社，２００２［６］杜绍材，聚合酶链反应中污染的预防与排除，临床检验杂志，２０００，１８（５）：２９８—２９９性病核酸扩增检测实验室环境污染的监测

作者：作者单位：

施美琴， 戴秀芹， 孙秀峰， 尹跃平中国疾病预防控制中心性病控制中心

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