标准储备菌株纯度确认标准操作规程

1.⽬的：建⽴标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和⽣长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。2.范围：微⽣物限度实验室所⽤标准储备菌株。。3.职责：QC主管⽣测员对本规程的实施负责。4.依据：中国药典2015年版四部通则。5.内容：5.1.实验菌株5.1.1 标准菌株

5.1.1.1 标准菌株应来⾃认可的国内或国外菌种收藏机构。

5.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中⽣长后，即为标准储备菌株。5.1.1.3 标准储备菌株应进⾏纯度和特性确认。5.1.2 ⼯作菌株

5.1.2.1 标准储备菌株可⽤于定期转种（每3个⽉）或制备⼯作菌株。

5.1.2.2 ⼯作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防⽌过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对⼯作菌株的纯度和特性进⾏确认。5.2 菌种确认试验的主要内容5.2.1 菌种的纯度确认

5.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的⽅法检测菌种是否为纯培养物。5.2.1.2 实验内容

⑴菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，⽤⼀平板上的单菌落的⼤⼩、形状、颜⾊、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

⑵镜检特征：对数⽣长期的培养物⾰兰⽒染⾊反应应呈现⼀致性；细胞形状、⼤⼩、荚膜、芽孢等特征应相似。5.2.2 菌种的特性确认5.2.2.1 ⽣化试验

各种微⽣物具有各⾃的独特的酶系统，因⽽在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物⼜具有不同的⽣化特征。根据此特征，利⽤⽣物化学⽅法来鉴定不同的微⽣物的试验即为微⽣物的⽣化试验。5.3 菌种的确定⽅法

⽤⽆菌的接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单⼀纯菌落，进⾏⾰兰染⾊、镜检，观察其染⾊特性及菌形。再做⽣化试验或使⽤菌种鉴定系统进⼀步鉴定菌种。

5.3.1 ⼤肠埃希菌的确认5.3.1.1 菌落形态

⑴取⼤肠埃希菌新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨液体培养基中，经35℃培养18～24⼩时后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。

⑵取上述培养物接种于麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24⼩时后，观察结果。

⑶麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红⾊或微红⾊，菌落中⼼呈深桃红⾊，圆形，扁平，边缘整齐，表⾯光滑，湿润。

5.3.1.2 ⾰兰染⾊、镜检⑴⾰兰染⾊

以接种环沾取⽆菌⽔于洁净的载玻⽚上，取麦康凯琼脂平板上的菌落，制成均匀涂⽚，⾃然或微温晾⼲，再通过⽕焰2～3次⼲燥固定。

滴加结晶紫染液，染⾊1分钟，⽔洗。

滴加碘液，媒染1分钟，⽔洗，⽤滤纸吸⼲余⽔。滴加95%⼄醇，脱⾊20～30秒，⾄流出液⽆⾊，⽔洗。滴加沙黄染液，复染1分钟，待⼲后，镜检。

⑵染⾊结果：⾰兰阳性菌呈蓝紫⾊；⾰兰阴性菌呈红⾊。

⑶镜检结果：两端钝圆的短⼩直杆菌，单个或成对，⾰兰阴性，⽆芽孢，多有鞭⽑。以周⾝鞭⽑运动或不运动，许多菌株有荚膜和微荚膜。5.3.1.3 ⽣化试验

⑴靛基质试验 (I) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于蛋⽩胨⽔培养基，培养24～48⼩时，沿管壁加⼊靛基质试液数滴，轻轻摇动试管。液⾯成玫瑰红⾊为阳性，呈试剂本⾊为阴性。98%的⼤肠埃希菌靛基质试验为阳性。⼀般24h即可出现阳性结果，以⽆菌操作先从管中取出1或2ml培养液进⾏检查，如靛基质是阴性，余下的蛋⽩胨⽔培养基再培养24h，作靛基质试验。⑵甲基红试验(M) 取麦康凯琼脂平板上的菌落,接种于缓冲葡萄糖胨⽔培养基,培养48±2⼩时,于培养液中加⼊甲基红指⽰液2～3滴（约每1ml培养液加指⽰液1滴），轻微摇动，⽴即观察。液⾯成红⾊或橘红⾊为阳性，呈黄⾊为阴性。

⑶⼄酰甲基甲醇⽣成试验(V-P) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于缓冲葡萄糖胨⽔培养基,培养48±2⼩时，于2ml培养液中加⼊α-萘酚⼄醇试液1ml,混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml,

充分振摇，在30分钟内出现红⾊为阳性，⽆红⾊反应⾊为阴性。

⑷枸橼酸盐利⽤试验(C) 取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于西蒙⽒柠檬酸盐琼脂培养基斜⾯上，培养2～4天。培养基斜⾯上有菌苔⽣长，培养基由绿⾊变为蓝⾊时为阳性，培养基颜⾊⽆改变，⽆菌苔⽣长为阴性。

⑸乳糖发酵试验取麦康凯琼脂平板上的菌落，接种于乳糖发酵管，培养⼩时，观察产酸（指⽰剂为酸性品红者为红⾊；指⽰剂为溴麝⾹草酚蓝者为黄⾊），产⽓（⼩倒管内有⽓泡，⽓泡⽆论⼤⼩都是产⽓）。为避免迟缓发酵乳糖产⽣假阴性，亦可接种5%乳糖发酵管。绝⼤多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24⼩时出现阳性，或适当延长培养时间。5.3.2 ⾦黄⾊葡萄球菌的确认5.3.2.1 菌落形态

⑴取⾦黄⾊葡萄球菌新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨液体培养基中，经35℃培养18～24⼩时后，呈均匀浑浊⽣长，繁殖较多时易产⽣沉淀，沉淀易被摇散。

⑵取上述培养物划线接种于⽢露醇氯化钠琼脂平板上，培养24～72⼩时观察结果。

⑶菌落形态⾦黄⾊，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1～2mm。5.3.2.2 ⾰兰染⾊、镜检⑴⾰兰染⾊

以接种环沾取⽆菌⽔于洁净的载玻⽚上，取⽢露醇氯化钠琼脂平板上的菌落，制成均匀涂⽚，⾃然或微温晾⼲，再通过⽕焰2～3次⼲燥固定。

滴加结晶紫染液，染⾊1分钟，⽔洗。

滴加碘液，媒染1分钟，⽔洗，⽤滤纸吸⼲余⽔。滴加95%⼄醇，脱⾊20～30秒，⾄流出液⽆⾊，⽔洗。

滴加沙黄染液，复染1分钟，待⼲后，镜检。

⑵染⾊结果：⾰兰阳性菌呈蓝紫⾊；⾰兰阴性菌呈红⾊。

⑶镜检结果：为⾰兰阳性球菌，菌体呈球形或略椭球形，菌体短⼩，菌体⼤⼩不⼀。⽆芽孢，⼀般不产⽣荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。5.3.2.3 ⽣化试验⑴触酶试验

取⽢露醇氯化钠琼脂平板上的菌落，接种⾄TSA斜⾯上，培养24⼩时。取TSA上的菌落置于洁净的载玻⽚上，然后滴加3%的过氧化氢数滴，长⽓泡为阳性，否则为阴性。（原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢⽣成⽔和氧，出现⽓泡）5.3.3.1 枯草芽孢杆菌的确认5.3.3.1 菌落形态

⑴取枯草芽孢杆菌新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨液体培养基中，经35℃培养18～24⼩时后，液体培养基表⾯呈⽚状⽣长。

⑵取上述培养物划线接种于胰酪⼤⾖胨琼脂平板上，培养24～72⼩时观察结果。⑶菌落为灰⾊，⼲燥、皱缩、⽆典型卷发状。1.3.3.2 ⾰兰染⾊、镜检⑴⾰兰染⾊

以接种环沾取⽆菌⽔于洁净的载玻⽚上，取胰酪⼤⾖胨琼脂平板上的菌落，制成均匀涂⽚，⾃然或微温晾⼲，再通过⽕焰2～3次⼲燥固定。

滴加结晶紫染液，染⾊1分钟，⽔洗。

滴加碘液，媒染1分钟，⽔洗，⽤滤纸吸⼲余⽔。

滴加95%⼄醇，脱⾊20～30秒，⾄流出液⽆⾊，⽔洗。滴加沙黄染液，复染1分钟，待⼲后，镜检。

⑵镜检结果：⾰兰阳性芽孢杆菌芽孢为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨⼤。5.3.4 ⽩⾊念珠菌的确认5.3.4.1 菌落形态

⑴取⽩⾊念珠菌新鲜培养物⾄沙⽒葡萄糖液体培养基中，经35℃培养24～48⼩时后，液体呈浑浊⽣长。

⑵取上述培养物划线接种于沙⽒葡萄糖琼脂平板上，经35℃培养24～48⼩时（必要时延长⾄72⼩时）观察结果。⑶菌落呈乳⽩⾊偶见淡黄⾊，表⾯光滑有浓酵母⽓味，培养时间稍久则菌落增⼤，颜⾊变深、质地变硬或有皱褶。

⑷取沙⽒葡萄糖琼脂平板上的培养物接种⾄念珠菌显⾊培养基平板上，经35℃培养24～48⼩时（必要时延长⾄72⼩时）观察结果。

⑸平板上为绿⾊或翠绿⾊的菌落。5.3.4.2 ⾰兰染⾊、镜检

取念珠菌显⾊培养基平板上的培养物进⾏⾰兰染⾊，镜检。⑴⾰兰染⾊

以接种环沾取⽆菌⽔于洁净的载玻⽚上，取念珠菌显⾊培养基平板上的菌落，制成均匀涂⽚，⾃然或微温晾⼲，再通过⽕焰2～3次⼲燥固定。

滴加结晶紫染液，染⾊1分钟，⽔洗。

滴加碘液，媒染1分钟，⽔洗，⽤滤纸吸⼲余⽔。滴加95%⼄醇，脱⾊20～30秒，⾄流出液⽆⾊，⽔洗。滴加沙黄染液，复染1分钟，待⼲后，镜检。

⑵镜检结果：⾰兰阳性芽孢杆菌芽孢为厚膜孢⼦、菌丝、芽管。5.3.5 ⿊曲霉菌的确认

5.3.5.1 镜检：可见孢⼦，菌丝。5.3.6 铜绿假单胞菌的确认5.3.6.1 菌落形态

⑴取铜绿假单胞菌新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨液体培养基中，经35℃培养18～24⼩时后，液⾯可形成菌膜，细菌在深层发育不良，呈微浑浊或透明状，菌液上层为蓝绿⾊。

⑵取上述培养物划线接种于溴化⼗六烷基三甲铵琼脂平板上，培养18～24⼩时观察结果。⑶菌落形态呈扁平、⽆定形、周边扩散、表⾯湿润，灰⽩⾊，周围时有蓝绿⾊素扩散。5.3.

6.2⾰兰染⾊、镜检⑴⾰兰染⾊

以玻璃棒沾取⽆菌⽔于洁净的载玻⽚上，取溴化⼗六烷基三甲铵琼脂平板上的菌落，制成均匀涂⽚，⾃然或微温晾⼲，再通过⽕焰2～3次⼲燥固定。

滴加结晶紫染液，染⾊1分钟，⽔洗。

滴加碘液，媒染1分钟，⽔洗，⽤滤纸吸⼲余⽔。滴加95%⼄醇，脱⾊20～30秒，⾄流出液⽆⾊，⽔洗。滴加沙黄染液，复染1分钟，待⼲后，镜检。

染⾊结果：⾰兰阳性菌呈蓝紫⾊；⾰兰阴性菌呈红⾊。

⑵镜检结果：为⾰兰阴性、⽆芽孢杆菌。单个、成对或短链状排列。5.3.6.3 ⽣化试验

⽤⽆菌玻璃棒轻轻接触单个典型菌落表⾯中⼼，沾取培养物，接种⾄胰酪⼤⾖胨琼脂斜⾯上，培养18～24⼩时，

⑴氧化酶试验将洁净滤纸⽚置于平⽫内，⽤⽆菌玻璃棒沾取上述斜⾯上⽣长的菌落涂于滤纸⽚上，滴加新配置的1%⼆盐酸⼆甲基对苯⼆胺试液。（在30秒内若培养物呈粉红⾊并逐渐变为紫红⾊为阳性，否则为阴性。）注：

1. 验菌落（苔）必须新鲜，陈旧培养物反应结果不可靠

2. 实验宜采⽤玻璃棒或⽊棒挑取菌（苔），避免与铁、镍等⾦属接触，不可⽤普通接种针（环），否则易出现假阳性。可以

⽤⽩⾦材料。

3. 试剂宜新鲜配制放置过久⼆盐酸⼆甲基对苯⼆胺氧化变⾊不可⽤。

4. 反应需在有氧条件下就⾏，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空⽓隔绝，呈假阴性反应。⑵绿脓菌素试验

取TSA斜⾯培养物接种于绿脓菌素测定琼脂⽤培养基，培养24⼩时，观察斜⾯有⽆⾊素。

有⾊素，在试管内加三氯甲烷3～5ml，以⽆菌玻璃棒搅碎培养基并充分振摇，。使培养物中的⾊素完全萃取在三氯甲烷内。静⽌⽚刻，待三氯甲烷分层，⽤⽆菌吸管将三氯甲烷移⾄另⼀试管中，加⼊盐酸试液（1mol⁄L）约1ml，振摇后静置⽚刻。（若在盐酸层出现粉红⾊为阳性，⽆粉红⾊为阴性。）

试验可⽤未接种的绿脓菌素测定⽤琼脂培养基斜⾯作为阴性对照。

若培养基斜⾯⽆⾊素产⽣，于室温培养1～2天，再按上法试验，凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性应继续做⼀下试验。⑶硝酸盐还原产⽓试验

取TSA上的培养物，接种于硝酸盐胨⽔培养基中，置35℃培养24⼩时。指⽰液：

甲液：称取ɑ-萘胺5g，溶解于5mol⁄L醋酸1000ml中。

⼄液：称取磺胺酸（对氨基苯磺酸）8g，溶解于5mol⁄L醋酸1000ml中。

甲液⼄液⽤前等量混合，每只⼩试管加0.1ml，产⽣红⾊为阳性反应，不产⽣红⾊为阴性反应。⑷ 42℃⽣长试验

取疑似菌落接种⾄TSA斜⾯上，于42℃培养4⼩时，能⽣长为阳性，否则为阴性。⑸明胶液化试验

⽤接种针沾取TSA斜⾯培养物少许，穿刺（应接近培养基底部）接种于明胶培养基中，培养24⼩时。取出放⼊0～4℃冰箱内10～30分钟。

若培养基呈溶液状，则为阳性，若为凝固状，则为阴性。（铜绿假单胞菌应为阳性）注：

1.实验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之凝固后，在穿刺接种。2.试验应同时设未接种细菌的阴性对照管，与试验管同时培养并观察结果。