禽网状内皮组织增生病病毒囊膜蛋白基因的克隆及其原核表达

＾　ｔ　Ｔ　＾　ｌＢＯＲＥｄｕ－ｓｍｉｌ６ＲＩｅＵＬＴＵＲ＾Ｅ　曲　华北农学报・２００６，２ｌ（增刊）：ｌ５４．１５７　禽网状内皮组织增生病病毒囊膜蛋白基因　的克隆及其原核表达　瞿晓兰　２，王宏俊２，陈小玲２，章振华　（１．江西农业大学，江西南昌３３００４５；２．北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京１０００８９）　摘要：以本实验室保存的ＲＥＶ毒株为模板，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了ＲＥＶ　ｅｎｖ部分基因，长为９３９　ｂｐ，并进行亚克　隆到ｐＭＤ１８．Ｔ质粒载体上，连接、转化、鉴定后得到阳性重组质粒ｐＥＴ－ｅｎｖ，将目的片段进行序列分析，结果表明，该　ＲＥＶ的ｅ　基因与已发表的ＳＮＶ株、中国ＨＡ９９０１株以及Ａ株同源性均达９４％以上，推导的氨基酸同源性为９４％以　上。将该基因片段与原核表达载体ｐＥＴ－３２ａ重组，并将重组质粒转化至宿主菌ＢＩ２１中，用ＩＰＴＧ诱导表达，对表达的　蛋白用ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳，免疫印迹和薄层凝胶扫描分析，表达产物与理论推理一致；免疫印迹结果证明，表达的ｅｎｖ蛋　白可被ＲＥＶ阳性血清所识别。　关键词：禽网状内皮组织增殖病病毒；ｅ　基因；克隆；原核表达　中图分类号：￥４３２．４　１　文献标识码：Ａ　文章编号：１０００—７０９１（２００６）增刊一０１５４—０４　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｖｉａｎ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ　Ｑｕ　Ｘｉａｏ．１ａｎ　＇－，ＷＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｊｕｎ２，ＣＨＥＮ　Ｘｉａｏ．１ｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧ　Ｚｈｅｎ　ｈｕａ　（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｊｉａｎｇｘｉ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ，Ｊｉａｎｇｘｉ　３００４５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　ａｎｄ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａ　ｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｙｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８９，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｖｉｒａｌ　ｓｕｂ—ｇｅｎｏｍｅ　ｍＲＮＡ　ｏｆ　Ａｖｉａｎ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ＲＴ－ＰＣＲ．Ａ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｗｈｉｃｈ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａ　ｐａｒｔ　ｏｆ　ｅｎｖ　ｇｅｎｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｉｚｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ａｂｏｕｔ　９３９　ｂｐ．Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＭＤ１８一Ｔ，ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌｓａｍｉｄ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ　ｐＭＤ－ｅｎｖ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｅｎｄｏｎｅｃｌｅｏａｓｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｐｒｏｐｅｒ　ｉｎｓｅｒｔｓ．Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｓｅｒｔ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐＭＤ－ｅｌ＇Ｗ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｅ／ｔｖ　ｓｈａｒｅｄ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　９４％ｗｉｔｈ　ＳＮＶ　ｓｔｒａｉｎ，ＨＡ９９０１　ｓｔｒａｉｎ，ａｎｄ　Ａ　ｓｔｒａｉｎ．Ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅ－　ｑｕｅｎｃｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｗａｓ　ａｂｏｖｅ　９４％．Ｔｈｅ　ｅ／ｔｖ　ｇｅｎｅ　Ｗａｓ　ｓｕｂｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ａ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ。ｐＥＴ－３２ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｅ／ｗ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　ＲＥＶ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｉｅｓ　０ｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐＥＴ－ｅｎｖ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＲＥＶ；ｅ／ｚ／）ｇｅｎｅ；Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　禽网状内皮组织增生症病毒（Ａｖｉｎａ　Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎ．　征［－～引，引起易感动物免疫抑制，导致细胞免疫和　ｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ　Ｖｉｕｒｓ，ＲＥＶ）是禽网状内皮组织增生症的　体液免疫能力下降，并发感染其他疾病。目前已分　病原，属反转录病毒科禽网状内皮组织增生症病毒　离到的ＲＥＶ有３０多种毒株，不同毒株的致病力不　属。该病毒主要侵害火鸡，也能引起鸡、鸭等禽类以　同，但均具有相似的抗原特性。ＲＥＶ基因组由ｇａｇ，　淋巴一网状细胞增生为特征的肿瘤性的一种综合　ｐｏｌ，ｅｌＴ，ｖ基因以及ＬＴＲ组成，其中囊膜蛋白（ｅｎｖ）是　收稿日期；２００６—０３—２４　基金项目：北京市优秀人才项目　作者简介：瞿晓兰（１９７９一），女，在读硕士，主要从事动物分子病毒学与免疫学研究；王宏俊为通讯作者。　维普资讯 http://www.cqvip.com

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－０　Ｔ－一　ｌｌＳＲＩＯＵＬＴＵＲＡＥ　１５６　Ｂ仰ＥｄＵ－Ｓ婀Ｉ曲一　华北农学报　２１卷　在室温中以０．８　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导表达６　ｈ，同时设　置阴性对照。　定，双酶切后出现５．９　ｋｂ和９３９　ｂｐ两条带。鉴定表　明ｅｎｖ基因以正确的方向插入到原核表达载体ｐＥＴ－　３２ａ中（图３）。　１．１２．２　ＳＤＳ．ＰＡＴＧ电泳按常规方法制备１２％分　离胶和５％浓缩胶。取１　ｍＬ菌液离心，去上清，加　人１００　２×ＳＤＳ上样缓冲液，９０　灭菌水和１０　ＤＴｒ，悬浮沉淀，混匀，煮沸１０　ｍｉｎ，１２　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心　５　ｍｉｎ，取１６　进行蛋白电泳观察结果。　１．１２．３　Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测　表达产物经ＳＤＳ．　ＰＡＧＥ后，将凝胶转移到ＮＣ膜上进行免疫印迹鉴　定。一抗为ＲＥＶ阳性血清，二抗为ＨＲＰ标记的兔　抗鸡ＩｇＧ，用底物二氨基联苯氨（ＤＡＢ）和过氧化氢显　色。诱导前和后的空载体作为对照。　２　结果与分析　２．１　ＰＣＲ扩增结果　从ＲＥＶ　ＲＮＡ中，利用ＲＴ．ＰＣＲ方法扩增出一条　大小为９３９　ｂｐ左右的ＤＮＡ片段（图Ｉ），其大小与　目的片段理论值相符。　，　１　１　２　３　４　５　６　７　８　∞∞　ｍ　％　ｐ　ｐｐ％　ｐｐｐ　１．阴性对ｊＩｃｌ；２—７．扩增片段；８．ＤＩ２００Ｍａｒｋｅｒ　１．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ；２～７．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＴ－ＰＣＲ；８．ＤＮＡ　ｉｎ￣ｅｒ　图１　ｅ／ｉｔ，基因ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果　Ｆｉｇ．１　ＲＴ－ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｅ／ｉｔ，ｇｅｎｅ　２一重组质粒的克隆和鉴定　通过对阳性质粒ｐＴ－ｅｎｖ的ＰＣＲ和双酶切鉴定，　ＰＣＲ扩增出一条约为９３９　ｂｐ的ＤＮＡ条带，用ＥｃｏＲＩ　和ｓⅡｆＩ进行双酶切鉴定，结果切出的两条带大小分　别为２　６９０　ｂｐ和９３９　ｂｐ（图２），结果表明，目的基因　已克隆到质粒载体上。　２．３序列分析结果　克隆出的ｅｎｙ基因从ＡＴＧ开始共９３９　ｂｐ，利用　ＤＮＡｓｔａｒ软件分析表明，ｐＥＴ．ｅｎｙ与美国ＳＮＶ株、中　国ＨＡ９９０１株以及Ａ株的氨基酸同源性分别达　９９．７１％，９６．１％和９４．５％，是所要克隆表达的目的　基因片段。　２．４原核表达质粒ｐＥＴ．ｅｎｖ的酶切鉴定　对阳性重组质粒ｐＥＴ－ｅｎｖ进行ＰＣＲ和双酶切鉴　０　０　７５２１　ｂ　ｐ　∞　∞如∞　ｂ　ｂｂｂｂ　ｐ　ｐｐｐｐ　１．ＤＮＡ分子量标准；２．重组质粒ＰＣＲ产物；　３．ＥｃｏＲｈ　Ｓａｉｌ双酶切；４．加ＮＡ／／／／ｎｄ　ｎｌ　ｍａｒｋｅｒ　１．ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；２．Ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ＰＣＲ：３．Ｆｒｒ－ｅｒｉｖ　ｄｉｇｈｔｅｄ　ｂｙ　ＥｃｏＲＩ　ａｎｄ　Ｓｏｌ　Ｉ：４．￣ＤＮＡ／Ｈ／ｈＡＩｌｌ　ｍｓｌｆ＇ｋｅｒ　图２重组质粒ＰＣＲ和酶切鉴定结果　Ｆｉｇ．２　Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ＃ａｓｍＪｄ　ｐＴ－ｅｎｖ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｒｅｓｔＨｃｆｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　３２２ｂｐ　２　０００ｂｐ　０２７ｂｐ１．ＤＮＡ分子量标准；２，３．ＰＣＲ产物；　４．表达载体阴性对照；５．　ＲＩ和Ｓａ／Ｉ双酶切结果；　６．　ＤＮＡ／Ｈ／ｎｄ１１Ｉ　ｍａｒｋｅｒ　１．ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；２。３．Ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ＰＣＲ；４．Ｎｅｇａｔｉｖｅ　ＰＥＴ－３２ａ　ｃｏｎｔｒｏｌ；　５．ＰＥＴ－ｅｎｖ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ＥｃｏＲＩ　ａｎｄ　Ｓｏｌ　Ｉ：６．ｋＤＮＡ／胁ｎｄ１１Ｉ　Ｍａｒｋｅｒ　图３重组质粒ｐＥＲ－ｅｎｖ　ＰＣＲ和酶切鉴定结果　Ｆ－２．３　Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＰＥＲ－ｅｎｖ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｎｄ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏ．Ｃｕｌｅａｓｅ　２．５重组表达质粒ｐＥＴ．ｅｎｖ的表达　经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳后，可见空载体ｐＥＴ－３２ａ诱导　表达出现一条分子量为２２　ｋＤａ的载体自身编码的　蛋白条带，重组转化菌诱导表达后却在５６　ｋＤａ处明　显增加了一条蛋白带，表明重组菌在诱导后表达了　外源蛋白，且外源片段大小约为３４　ｋＤａ，与理论推导　的大小相符（图４）。　２．６免疫印迹鉴定分析　重组融合蛋白ｐＥＴ－ｅｎｖ经ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳，用兔　抗鸡ＩｇＧ进行免疫印迹检测，出现一条特异性的抗　原抗体结合带，分子量大小与目的蛋白相同，从而证　维普资讯 http://www.cqvip.com

增刊　瞿晓兰等：禽网状内皮组织增生病病毒囊膜蛋白基因的克隆及其原核表达　ＡＢＲＩＣＵＬＩ＇ＵＲＡＥ　１５７　矗　口　Ｔ　●　明所表达的蛋白具有抗体结合活性（图５）。　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１０　９９．４ｋＤ　６６．２ｋＤ　４５．０ｋＤ　５６ｋＤ　２８．５ｋＤ　１４．４ｋＤ　１．蛋白分子量标准；２—９．分别不同ＩＰＴＧ　浓度诱导ｐＥＴｅｎｖ；１０．诱导后的ｐＥＴ－３２Ａ　１．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｒｋｅｒ；２—９．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｉｔｈ　ＰＥＴ．ｅｎｖ　ｂｙ　ＩＰＴＧ：　１０．Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｉｈｔ　ＰＥＴ——３２ａｂｙＩＰＴＧ　图４　ｅｎｖ表达重组质粒在ＢＬ２１中　诱导表达后的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析　Ｆｉｇ．４　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｏｆ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ＢＬ２１　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｉｔｈ　ＰＥＴ－ｅｎｖ　ｋＤ　】　２　３　９９．４　６６＿２　４５．０　３５．０　２８．５　２０．０　１４．４　１．蛋白分子量标准；２．ｐＥＴ－ｅｎｖ；３．ｐＥＴ空载体　１．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ；２．Ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ＰＥＴ－ｅｎｖ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＩＰ＇ＩＧ；　３．Ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ＰＥＴ－３２ａ　ｉｎｄｕｃｔｄｅ　ｂｙ　ＩＰＴＧ　图５　Ｗｅｓｔｅｒ　ｂｏｌｔｉｎｇ免疫原性检测　３　讨论　囊膜糖蛋白ｅｎｖ）基因是ＲＥＶ的主要功能基　＿Ｄ脏ＩＩＬＩ－ＳＩＨＩ∞　因，与宿主产生中和抗体相关。在本研究中，利用表　达性载体ｐＥＴ．３２ａ成功地对ＲＥＶ　ｅｎｖ进行了原核表　达系统的构建，为进一步ＲＥＶ的生物学活性及防治　提供了重要依据。　通过对本实验室保存的ＲＥＶ毒株ｅｎｖ基因克　隆片段序列分析、氨基酸序列分析及与ＧｅｎＢａｎｋ中　已发表的ＳＮＶ株、ＨＡ９９０１株、Ａ株同源性比较可见，　本试验的ＲＥＶ株与ＳＮＶ株同源性最高，核苷酸序列　和氨基酸序列分别为９９．７％和９８．７％。在和其他　毒株序列分析比较中，同源性都在９４％以上，这种　高度保守性及其在致病性和病毒复制转录过程中的　作用，为其在体外大量表达，作为诊断抗原和制备多　抗血清及单抗进行疾病诊断提供了基础。　参考文献：　［１］Ｃａｌｎｅｋ　Ｂ　Ｗ，Ｗｉｔｔｅｒ　Ｒ　Ｌ．Ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆ　Ｐｏｕｌｔｒｙ［Ｍ］，１０ｔｈ　ｅｄｉ—　ｉｆｏｎ，Ａｍｅｓ，ＵＳＡ：Ｉｏｗａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕ　ｎｉｖ　Ｐｒｅｓｓ，１９９７：４６７—４８４．　［２］吉荣，赵文明，钱　莉，等．ＲＥＶ分离株囊膜糖蛋白　基因的克隆及序列分析［Ｊ］．扬州大学学报（农业与生　命科学版），２００３，２４（１）：２３—２５．　［３］赵文明，吉荣，丁家波，等．ＲＥＶ囊膜糖蛋白基因真核　表达载体的构建［Ｊ］．扬州大学学报（农业与生命科学　版），２００４，２５（１）：２２—２４．　【４］Ｄｅｌｗａｒｔ　Ｅ　Ｌ，Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ　Ａ　Ｔ．Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｒｅｔｉｅｄｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｓｕｐｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ，１９８９，６３（１）：２７３—２８０．　［５］殷震，景华．动物病毒学（第２版）［Ｍ］．北京：科学　出版社，１９９７：２０４—２４６．　［６］萨姆布鲁克Ｊ，拉塞尔Ｄ　Ｗ．黄培唐，等译．分子克隆　实验指南（第３版）［Ｍ］．北京：科学出版社，２００２．