人参皂苷诱导大鼠C6脑胶质瘤细胞的分化

ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ（）Ｆ　ＡＮＡＴ（）ＭＹ　Ｖｏ【．３３　Ｎｏ．２　２０１０　解剖学杂志２０１０年第３３卷第２期　人参皂苷诱导大鼠Ｃ６脑胶质瘤细胞的分化　廖义林张建平孙新明　（井冈山大学医学院，吉安３４３０００）　摘要　目的：观察人参皂苷对胶质瘤细胞的诱导分化作用，探讨人参皂苷抗胶质瘤作用机制。方法：采用ＭＴＴ、软琼脂克　隆形成率、形态学与神经胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）免疫荧光等方法鉴定分化程度。结果：１０　ｇｇ／ｍ１人参皂苷即可明显诱　导大鼠Ｃ６胶质瘤细胞株的细胞分化，表现为增殖抑制，克隆形成能力丧失，细胞突起增长，ＧＦＡＰ表达量升高。结论：一定　剂量的人参皂苷可以诱导大鼠脑胶质瘤细胞分化达到抗肿瘤的效果。　关键词人参皂苷；胶质瘤；侵袭；细胞分化　Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ６　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｒａｔ　Ｌｉａｏ　Ｙｉｌｉｎ，Ｚｈａｎｇ　Ｊｉａｎｐｉｎｇ，Ｓｕｎ　Ｘｉｎｍｉｎｇ　（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｊｉｎｇｇａｎｇｓｈａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉ　３４３０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　Ｒｇ３　ｉｎ　ａｎｔｉｇｌｉｏｍａ　ｅｆｆｅｃｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃ６　ｇｌｉｏｍａ　ｗｅｒｅ　ｄｅｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ａ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ａ　ｐｌａ—　ｃｅｂｏ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｓｔｒａｉｎ　Ｃ６　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　ｗａｓ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　ＭＴＴ，ｓｏｆｔ　ａｇａｒ　ｃｌｏｎｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｔｅｓｔ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＧＦＡＰ　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ６　ｇｌｉｏｍａ　ｗｅｒｅ　ｏｂｖｉ—　ｏｕｓｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　１０／￣ｇ／ｍｌ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ，ｓｈｏｗｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｒｒｅｓｔ，ｃｌｏｎｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｌｏｓｓ，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ａｎｄ　ＧＦＡＰ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　ｃａｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｔｏ　ａｃｈｉｅｖｅ　ａｎ—　ｔｉｇｌｉｏｍａ　ｅｆｆｅｃｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ；ｇｌｉｏｍａ；ｉｎｖａｓｉｏｎ；ｃｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　胶质瘤是恶性肿瘤中最难以治疗的疾病之一。人　们一直在探索各种新的治疗方法来提高疗效。诱导分　１材料和方法　化疗法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｔｈｅｒａｐｙ）在治疗血液病方面已　１．１细胞株　取得了成功，近几年有人提出了将此方法应用到胶质　大鼠Ｃ６胶质瘤细胞株购自中国科学院上海细胞　瘤治疗中的新思路，倍受关注。近年来虽然筛选出了　生物学研究所。　对脑胶质瘤细胞有效的诱导分化剂环己亚甲基二乙酰　１．２主要试剂　胺（ｈｅｘ　ａｍｅｔｈｅｌｅｎｅｂｉｓａｃｉｄａｍｉｄｅ，ＨＭＢＡ）Ｅｌｉ和二甲基　人参皂苷，纯度＞９０　，白求恩医科大学化学教研　甲酰胺（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ，ＤＭＦ）　］，但因其毒性作　室，碘化丙啶（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｎｅ，ＰＩ），鼠抗神经胶质纤　用大，影响了治疗和进一步研究。人参皂苷（ｇｉｎｓｅｎ—　维酸性蛋白（ｇｌｉａｌ　ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ａｃｉｄｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ），羊　ｏｓｉｄｅ）是人参中的主要药物成分。研究表明，人参皂苷　抗鼠一ＦＩＴＣ抗体，溴化乙啶（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＥＢ）均　在预防和治疗癌症方面显示出较强的活性［３ｊ，随着研　购自博士德公司；四唑盐（ＭＴＴ），Ａｍｒｅｓｃｏ公司。　究的深入，人们发现人参皂苷抗肿瘤作用和机制更为　１．３细胞培养［　］　广泛。　应用含１Ｏ　小牛血清的ＰＲＭＩ１６４０培养基，　本研究从不同方面研究了人参皂苷对大鼠脑胶质　３７℃，湿度１００　９／６，５　ＣＯ　条件下培养。用１６４０培养　瘤细胞的诱导分化作用，旨在寻找和开发能抑制胶质　瘤细胞增殖并诱导其分化和凋亡的毒副作用小或无的　基配成药物储存液，０．２２　ＩＴＩ微孔滤膜过滤，再用完全　中药诱导剂。　培养基稀释成实验组所需浓度。接种培养６　ｈ，细胞已　完全贴壁后，弃培养基加入含药培养基继续培养。倒　置显微镜下观察细胞生长状况。　１．４　ＭＴＴ法检测　第１作者Ｅ－ｍａｉｌ：￣ｐｚｚｑ＠１６３．ｃｏｍ　将细胞以５×１Ｏ。个／孔接种于９６孔细胞培养板，　收稿日期：２００８—０７—２０；修回日期：２００９～１２—２２　每孔加培养基１００　Ｆ１。分别于培养第１、２、３、４、５、６　２Ｏ７一　天加入噻唑蓝２０肚ｌ（５　ｍｇ／ｍ１），再培养４　ｈ，可见细胞　内出现紫蓝色结晶，弃培养基，加入二甲基亚砜　（ＤＭＳＯ）１００　ｌ溶解结晶，微量震荡器震荡１０　ｒａｉｎ，测　５７０　Ｄｉｎ的ｏＤ值，以６５０　Ｄｉｌｌ为参考波长，用标准曲线　２．４　ＧＦＡＰ的表达　本实验中，ＧＦＡＰ呈红色荧光。对照组ＧＦＡＰ免　疫荧光表现为胞体短圆，突起基本少见或短，胞质内弱　阳性，经复染后难以分辨；经２５＃ｇ／ｍ１人参皂苷诱导　３　ｄ后，胞体细长，突起明显，胞质内红色荧光明显增强　（图２）。　３讨论　法将０Ｄ值换算成细胞数，再绘成细胞数一时间关系　曲线。　１．５双层软琼脂克隆形成率　在２４孔板上完成，下层为０．５　琼脂；上层为　０．３　琼脂，后者含肿瘤细胞１　０００个。实验组的琼脂　中含不同浓度诱导分化剂。待琼脂凝固后常规培养　１０　ｄ，在倒置显微镜下计算克隆形成率。　白血病细胞的分化指标较多，如颗粒出现，四氮唑　蓝还原反应等＿＿５］，胶质瘤细胞分化程度的检测指标目　前报道较少，迄今尚未见更好方法报道。究其原因，首　１．６　ＧＦＡＰ免疫荧光　２　绵羊血清／ＰＢＳ　３７℃封闭１　ｈ，加鼠抗ＧＦＡＰ，　４℃过夜。ＰＢＳ彻底清洗，羊抗鼠一ＦＩＴＣ二抗３７℃１　ｈ，　洗涤，ＥＢ（１００＃ｇ／ｍ１）３７℃复染１　ｒａｉｎ，洗涤，荧光显微　镜观察。设ＰＢＳ空白对照，以培养的正常大鼠胶质细　胞作为阳性对照。　１．７统计学处理　所以数据均用　±５表示，应用ＳＰＳＳ１１．５软件统　计，组间比较采用单因素方差分析。　２结果　２．１形态学观察　诱导前细胞多数呈两极短梭形，胞质少，胞突短，　核质比大。经２５￣ｕｇ／ｍ１人参皂苷诱导３　ｄ后细胞体积　增大，有明显长而粗大的胞突，突起数目增多，呈多角　形或星状，形态细而长（图１）。　２．２细胞增殖　加人人参皂苷２４　ｈ后，镜下观察可见细胞内颗粒　增多，细胞皱缩，有的变圆或悬浮。ＭＴＴ结果表明，在　浓度为１０～５０￣ｇ／ｍｌ时，人参皂苷明显抑制大鼠Ｃ６　胶质瘤细胞的增殖，随着人参皂苷浓度的增加，Ｃ６胶质　瘤细胞细胞生长抑制率也增加（表１）。说明在一定剂　量下，人参皂苷能明显抑制细胞的增殖。　表１人参皂苷对大鼠Ｃ６胶质瘤细胞增殖的影响（ｎ＝２０，　士ｓ）　Ｔａｂ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ　Ｏｉｌ　Ｃ６　ｇｌｉｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔ（ｎ＝２０，　士　）　Ｐ％０．０５，”Ｐ＜Ｏ．０１　ｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　２．３克隆形成率　对照组克隆出现早，数量多，直径大；而２５／，ｇ／ｍ１　人参皂苷组绝大多数细胞都不能形成有效克隆。　－—・——２０８・－－——　先是脑胶质细胞的分化途径尚存在争议，一些分化祖　细胞的存在仍然只是推测；其次，胶质细胞分化各阶段　缺乏明确的标志物，难以确定分化阶段。有鉴于此，本　实验在确定人参皂苷诱导分化作用时，以早先报道过　的ＨＭＢＡ或ＤＭＦ作为阳性对照，继续沿用其部分观　察指标，取得了很好的实验结果。　正常成熟星形胶质细胞具有明显区别于肿瘤细胞　的形态学特征，所以形态学变化可以作为一个易于观　察而且敏感的分化指标，胶质瘤细胞经诱导分化后出　现了胞质增多，突起增多变长等现象。人参皂苷分化　以长梭形为主，推测与在分化谱系中的分化方向有关。　正常胶质细胞必须贴壁后才能增殖，在软琼脂上不能　形成克隆，而肿瘤细胞则失去了接触抑制和锚着依赖　性，在软琼脂上可以形成克隆，本实验中肿瘤细胞经药　物诱导后克隆形成率明显降低直至丧失。已有研究报　道人参皂苷Ｒｇ３可抑制脑胶质瘤血管内皮细胞生长因　子（ＶＥＧＦ）表达具备抗血管生成作用Ｌ６］。本课题组实　验结果表明人参皂苷Ｒｇ３可能通过抑制脑胶质瘤Ｖｉ－　ｍｅｎｔｉｎ表达同时增强ＧＦＡＰ的表达达到抗肿瘤的效　果。Ｖｉｍｅｎｔｉｎ的表达与星形胶质细胞本身释放多种生　长因子如神经生长因子、表皮生长因子、ＶＥＧＦ和睫状　神经营养因子密切相关。ＧＦＡＰ的表达与Ｖｉｍｅｎｔｉｎ　的表达代表了胶质瘤细胞的状态，因此分析人参皂苷　可能通过抑制了胶质瘤细胞自身多种生长因子的分　泌而达到使细胞处于成熟状态［７］。ＧＦＡＰ是胶质细胞　特有的一种蛋白，与胶质瘤的分化呈正相关［８］。本实　验采用常规细胞培养方法和细胞免疫技术检测也表　明人参皂明显促进ＧＦＡＰ表达，进一步证实了肿瘤细　胞的分化。因此通过调控胶质细胞分化机制将有可　能利于抗脑胶质瘤。６ＨＲＥ－ＧＦＡＰ＿Ｂａｘａ是脑胶质瘤　特异性基因治疗系统，可以有效诱导胶质瘤细胞的凋　亡，人参皂苷是否通过促进６ＨＲＥ－ＧＦＡｐ－Ｂａｘａ系统　的作用而抑制胶质瘤细胞克隆形成还有待于进一步　的研究。　现代研究认为，肿瘤的发生和发展是肿瘤细胞增　殖失控的结果，过度的细胞增殖增加了细胞恶变的潜　能，导致肿瘤的发生。许多药物引起肿瘤退缩的机制　殖的影响［Ｊ］．辽宁中医杂志，２００６，３３（１０）：１３］９　１３２０．　［１Ｏ］王煜，牛洪泉，董芳永，等．大鼠树突状细胞疫苗治疗脑胶质瘤的　＿Ｊ］．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ，１９９８，３６（１）：９１—９４．　［１２］陈小红，高瑞兰，钱煦岱，等．人参皂苷诱导人Ｔ淋巴细胞白血病　细胞株凋亡的研究＿Ｊ］．白血病・淋巴瘤，２００５，１４（４）：２１７～２１９．　实验研究［Ｊ］．中国ｌ　床神经外科杂志，２００５，１０（２）：１１５　１１７．　［１１］Ｂａｒｔｈ　Ｒ　Ｒａｔ　ｂｒａｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｍｏｄｅｌｓ　ｉｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｎｅｕｒｏ　ｏｎｃｏｌｏ　ｇＹ：ｔｈｅ　９Ｌ，Ｃ６，Ｔ９，Ｆ９８，ＲＧ２（Ｄ７４），ＲＴ　２　ａｎｄ　ＣＮＳ￣Ｉ　ｇｌｉｏｍａｓ　（编辑：冀凯宏）　解剖学杂志２０１０年第３３卷第２期　网络交流方式在解剖学教学中的应用　陈四清韩云志　游言文　田新红　王玎玎程秀娟郝　莉　（河南中医学院解剖学与组织学胚胎学学科，郑州４５０００８）　“十五”以来，伴随着我国高等教育大众化的进程，很多高校　以扩大办学规模，完善基础设施，增强办学实力，提高办学水平　为目标，纷纷建设新校区。教师上下班都是班车来班车走，造成　教师与学生只能在课堂上见面，课后辅导这个重要教学环节无　法实现。针对这种情况，如何提高教学质量，是摆在每一位教师　面前的问题。本科室通过利用博客、ＱＱ、短信、ＢＢＳ等网络交流　方式进行辅导，取得了一定的效果。　断献言献策，特别是在解决问题的方法上不断探索：我用了哪些　方法和资源？还可以用哪些？那一种最好并且对教学帮助最　大？通过仔细推敲和集体筛选，将每位教师的教学设计、课堂实　录、论文及教育教学中的困惑等发布到校园局域网的ＢＢＳ上，然　后全体教师和学生通过观看课堂实录和教学设计，在网络上通　过发帖子展开评课及其他教研活动。　３网络交流方式的条件　１网络交流方式简介　本学科每位教师都建立了自己的博客，建立了有关解剖学　网络环境正在以不可抗拒的优势进入到我们的工作、生活　的各个领域，我校信息课教师对我校学生接触和利用网络的情　况进行了一次抽样调查，学生每周上网３　ｈ以上的占５４．８　；每　超级链接，上传了解剖学学习音像、同时开通了自己的ＱＱ空　间，建立了ＱＱ解剖学习群、将手机号告诉学生、并在学校局域　周上网２．５　ｈ以上的占２５．７　；每周上网１　ｈ以上的占１９．５　；　未上网的０　。通过学校机房上网的占７２　；通过手机上网的　占１７．１　；通过其他途径上网的占１０．９　。　网ＢＩ　论坛上定期与学生交心互动，随时关　的学习动态，　根据学生反馈的信息，了解课堂教学效果。　２网络交流方式的特点　互联网上的大部分解剖学资源是共享的，免费的，学生可以　不受时间、空间的限制，可以根据自己的实际情况来学习，到网　站上获取与教学有关的学习资源，学习时间和空间是无限的。　综上所述，网络交流方式为教与学提供了强有力的资源环　境，是教师和学生在教与学的过程中取之不尽的资源宝库，真正　意义上做到了为教与学服务，最大限度地提高解剖学教学效率　和效果。　４效果评价　网络学习的氛围轻松、活泼，学生能够在良好状态下自主、积极　地学习，大大提高了学习兴趣。教学内容可以采用超级链接的　形式，控制性好，交互性强，符合人类的联想记忆方式。学生可　以通过鼠标点击自由地在不同知识点之间进行转换，在较短的　时间内接受了大量的信息，使教学容量大为增加，拓宽了学生的　知识面。在此基础上，针对教师所提出的问题进行思考交流，对　本学科从２００６级开始，利用博客等网络交流方式进行辅　导，现已满３届。根据这３届学生期末成绩与新校区的２００４　级、２００５级学生期末成绩的比较分析，结果显示，在相同背景下　（同一个老师、相同专业等），利用博客等网络交流方式进行辅导　的这３届学生相同题型正确率提高ｌＯ．３４　；平均成绩提高　８．９７％；对利用博客等网络交流方式进行辅导的调查结果：赞成　的占８６．３％；否定的占９．８　；弃权的占３．９　。这说明利用博　客、ＱＱ、短信、ＢＢＳ等网络交流方式进行辅导有利于促进教学相　长、提高解剖学教学质量。　参考文献　其思考问题的广度和深度均有帮助。　ＱＱ群的建立有利于与学生之间的交往，便于组织讨论，也　可随时给老师留言。与学生进行ＱＱ式的交谈可以减轻课堂上　的压力。教师在ＱＱ空间可以精选内容，针对不同专业选，注意　学生动向，收集反馈信息，引导学生进行自主学习、教育学生明　确学习目的、教会学生学习方法。还可及时发布教学教务信息，　师生有问题都可随时提出，在网上讨论，交流，既便于联系又沟　通感情，还可聊天，从很大程度上弥补了时空分离造成的师生交　流的缺陷，师生间的联系更加密切。　［１］徐飞，李岩，张艳丽，等．提高护理解剖学教学质量的探讨［Ｊ］．解　剖学杂志，２００６，２９（４）：５２７　５２８．　［２］赵大勇．医学解剖学教学改革的探讨［Ｊ］．齐齐哈尔医学院学报，　２００６，２７（６）：７２０—７２１．　学科通过沙龙的形式进行集体备课，围绕教学重、难点，不　［３］黄晓洁，廖毅，夏凯愉，等．高等医学院校课堂教学质量评估的实　施与探讨［Ｃ］．浙江省医学教育学术年会论文汇编，２００６：　第１作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｎ８９０３２０＠］６３．ｃｏｎ］　收稿日期：２００９一Ｏ４—０２；修回日期：２００９　０７　２０　～３２７－３２８．　（编辑：黄会龙）　２１Ｏ一