微小RNA—146a在大黄素对脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中的作用

微小RNA—146a在大黄素对脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中

的作用

目的 探讨微小RNA-146a（miR-146a）在大黄素对脂多糖（LPS）诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中的作用。方法 将体外去致热源培养的大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383分为空白对照组、LPS处理组和大黄素+LPS处理组，细胞培养6 h后收集细胞，采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞中miR-146a的表达，Western blot法检测细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的表达。结果 与空白对照组相比较，LPS作用后细胞中miR-146a、TNF-α和IL-6表达量明显升高；与LPS处理组相比较，大黄素+LPS处理组中miR-146a表达量显著上调，而TNF-α和IL-6表达量显著下调。结论 大黄素可上调肺泡巨噬细胞中miR-146a的表达，大黄素可抑制巨噬细胞中TNF-α和IL-6的表达，miR-146a可能参与调控大黄素抗肺泡巨噬细胞炎症反应过程。

标签：大黄素；miR-146a；肺泡巨噬细胞；炎症反应

微小RNA（microRNA， miRNAs）是一类长度约21～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，miRNA由基因组转录，在转录后水平调控基因表达。研究表明，miRNAs参与炎症反应、细胞增殖与凋亡、组织分化和肿瘤形成等生理过程的调节[1]。其中miRNA-146a是当前研究热点之一，miRNA-146a在Toll样受体/核转录因子（NF-κB）炎症通路中具有重要的负反馈调节作用，从而抑制炎症反应[2]，另外在LPS诱导肺泡巨噬细胞产生炎症反应中，miRNA-146a的表达与炎症因子表达呈负相关[3]，表明miRNA-146a可能作为抑制肺泡巨噬细胞炎症反应的新作用靶点。近年来研究表明大黄素对急性胰腺炎诱导的腹腔巨噬细胞炎症反应有一定抑制作用[4]，但在LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中，miRNA-146a是否在大黄素抑制炎症反应过程中发挥了一定作用尚未见报道，为此，本研究拟探讨miRNA-146a在大黄素对LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料 胎牛血清、Ham’s F-12K培养基和0.25%EDTA胰蛋白酶购自美国Gibco公司；细胞浆蛋白抽提试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；大黄素（纯度>98%）购自美国Sigma公司，大黄素用二甲基亚砜配制成0.2 mmol/L的贮存液，-20℃冰箱保存（二甲基亚砜的终浓度小于0.1%，该浓度对细胞无明显影响）；脂多糖（LPS）购自美国R&D公司；TNF-α、IL-6和β-actin抗体购自美国Epitomics公司；Trizol和逆转录实时定量聚合酶链反应（PCR）引物购自美国Invitrogen公司；Prime Script逆转录试剂盒购自美国ABI公司。

1.2方法 大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383购自中科院上海细胞库，培养在含l5%胎牛血清、质量浓度1×105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素、2 mmol/L谷氨

酰胺和1.5 g/L碳酸氢钠的Ham’ s F-12K培养液中，置于37℃、5%的CO2的培养箱内培养，2～3 d换液1次，细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。

1.3实验模型制备及分组 将处于对数生长期的NR8383细胞按1×106/孔接种于6孔板，实验分四组，每组5个复孔。①LPS处理组：在培养基中加入浓度为1 mg/L的LPS；②空白对照组：每孔加入等体积的PBS；③大黄素+LPS处理组：在培养基中加入浓度为5 mg/L的大黄素作用30 mins后，再加入浓度为1 mg/L的LPS。细胞放入培养箱6 h后离心收集细胞，置于-80℃冰箱。

1.4 Western blot检测NR8383细胞中TNF-α和IL-6的表达 裂解细胞并分离细胞蛋白质，用Bradford法测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品（20 μg/孔），常规8% SDS-PAGE电泳，半干转膜仪转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入特异性一抗（1∶1000）于4℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG为第二抗体（1∶2500）室温孵育1 h，ECL显色，条带暴光强度用Quantity One 4.6.2（BIO，RAD）软件分析，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。

1.5 RT-qPCR检测NR8383细胞中miRNA-146a的表达 用Trizol试剂提取总RNA，按说明书操作。总RNA经紫外分光光度计测定260 nm与280 nm处光密度比值（D260/D280）为1.9～2.1，琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA纯度。采用PrimeScript逆轉录试剂盒进行逆转录，采用SYBR实时荧光定量试剂盒进行实时定量PCR检测，反应在25 μl体系中进行，反应条件：50 ℃下30 min逆转录，94 ℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸7 min。以U6 snRNA作为内参，miR-146a的相对表达量采用2-△△Ct计算。

1.6统计学处理 采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，正态分布变量多组间比较用方差分析，两组间比较用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 TNF-α和IL-6在NR8383细胞中的表达变化 Western blot检测结果表明，与空白对照组相比较，LPS作用后NR8383细胞中TNF-α和IL-6的表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；TNF-α和IL-6在大黄素+LPS处理组中的表达较LPS处理组显著下降，有显著性差异（P＜0.05），见图1。

图1 Western blotting检测TNF-α和IL-6在NR8383细胞中的表达，以β-actin为内参

2.2 miR-146a在NR8383细胞中的表达变化 LPS作用6 h后NR8383细胞中miR-146a的相对表达量为（5.19±1.26），与对照组（1.04±0.28）相比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；大黄素+LPS处理组中miR-146a的表达量为（12.84±2.08），与LPS处理组相比较，有显著性差异（P＜0.05）。

3讨论

急性肺损伤是由多种炎性介质及效应细胞导致肺通透性增加的急性、进行性、缺氧性呼吸衰竭，是脓毒症中最常受累的器官之一。而肺损伤时肺泡巨噬细胞被激活，不但可吞噬侵入肺脏的炎症粒子，参与肺脏的防御和免疫，而且还能分泌大量的生物活性物质参与中性粒细胞在肺内的迁徙过程，因此在急性肺损伤过程中发挥了关键作用[5]。LPS是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要致病成分，也是脓毒症主要致病因素，在脓毒血症过程中，LPS可活化肺泡巨噬细胞Toll样受体/核转录因子（NF-κB）炎症通路，导致大量炎症因子如TNF-α、TGF-β、IL-6和IL-1释放，最终引起急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发生[6-7]。TNF-α作为是炎症反应过程中出现最早和最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放，而IL-6能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂[8]。在本研究采用LPS刺激肺泡巨噬细胞株NR8383来建立炎症反应模型，并检测TNF-α和IL-6在巨噬细胞中的表达来判断模型是否建立成功和炎症反应程度。本研究结果表明，LPS作用NR8383细胞后，TNF-α和IL-6蛋白表达显著上调，从而成功建立起炎症反应模型，与刘[9]的研究结果相似。

大黄素（Emodin，6-甲基-1，3，8-三羟基蒽醌）是一种蒽醌类物质，是从大黄属、蓼属、鼠李属和番泻叶中分离出来的主要有效单体，千百年来被广泛应用于传统中医药。近年来研究表明大黄素拥有多种生物学功能，如抗菌、抗炎和免疫抑制[10]等。同时有研究表明大黄素对急性胰腺炎诱导的肺损伤有一定保护作用[3]。在本研究观察到，大黄素预处理肺泡巨噬细胞株NR8383后可显著下调LPS诱导的TNF-α和IL-6的产生，从而首次表明大黄素对肺泡巨噬细胞诱导的炎症反应有一定抑制作用。

微小RNA（microRNAs， miRNAs）是一类非编码小分子RNA，miRNAs可通过特异性识别靶基因mRNA的3’端非编码区位点而抑制蛋白翻译或诱导mRNA的降解，从而在转录后水平调控基因表达[11]。近年来研究表明miRNAs在机体炎症反应过程中发挥了一定作用，而miR-146a是当前研究的热点之一，miRNA-146a可作用于Toll样受体/NF-κB炎症通路中的编码基因IRAK-1和TRAF-6，对Toll样受体/NF-κB通路具有重要的负反馈调节作用，从而抑制炎症反应[2，12]。刘芬[13]等观察到肺泡巨噬细胞转染miR-146a后可下调肺泡巨噬细胞中TNF-α的表达，从而表明miR-146a与肺泡巨噬细胞介导的炎症反应关系密切。在本研究中，笔者观察到LPS刺激肺泡巨噬细胞株NR8383后，miR-146a的表达增加，与文献报道相符；另外大黄素预处理NR8383细胞后可进一步上调miR-146a在细胞中的表达，同时大黄素可抑制肺泡巨噬细胞中炎症因子的表达，可以推测miR-146a在大黄素抑制肺泡巨噬细胞炎症反应中发挥了一定作用。

综上所述，本研究成功建立起LPS诱导产生的肺泡巨噬细胞炎症反应模型，大黄素作用巨噬细胞后可抑制炎症因子TNF-α和IL-6的表达，并诱导miR-146a在细胞中的表达，表明大黄素发挥抗炎作用的机制之一可能是通过抑制巨噬细胞中miR-146a的表达来实现。

参考文献：

[1]Yang M， Eyers F， Xiang Y2， et al. Expression Profiling of Differentiating Eosinophils in Bone Marrow Cultures Predicts Functional Links betweenMicroRNAs and Their Target mRNAs[J]. PLoS One， 2014， 13；9（5）：97537.

[2]Kumar S， Keerthana R， Pazhanimuthu A，et al.Overexpression of circulating miRNA-21 and miRNA-146a in plasma samples of breast cancer patients[J]. Indian J Biochem Biophys， 2013，50（3）：210-214.

[3]曾振国，邵强，李勇等.白藜芦醇对脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞微小RNA-146a表达的影响[J].中華急诊医学杂志，2014，23（01）：30-33.

[4]刘守信，张玮.大黄素对重症急性胰腺炎致全身炎症反应综合征大鼠腹腔巨噬细胞ICAM-3的体外作用[J].中国药物与临床，2012，12（08）：1014-1016.

[5]Wu BQ， Luo JM， Wang YH， et al. Inhibitory effects of simvastatin on staphylococcus aureus lipoteichoic acid-induced inflammation in humanalveolar macrophages[J].Clin Exp Med， 2014， 14（2）：151-160.

[6]Zeng Z， Gong H， Li Y， et al. Upregulation of miR-146a contributes to the suppression of inflammatory responses in LPS-induced acute lung injury[J]. Exp Lung Res， 2013， 39（7）：275-282.[7]Oliveira MC Jr， Greiffo FR， Rigonato-Oliveira NC， et al. Low level laser therapy reduces acute lung inflammation in a model of pulmonary and extrapulmonary LPS-induced ARDS[J]. J Photochem Photobiol B， 2014， 5（134）：57-63.

[8]Ramakrishna K， Pugazhendhi S， Kabeerdoss J， et al. Association between heat shock protein 70 gene polymorphisms and clinical outcomes in intensive care unit patients with sepsis[J]. Indian J Crit Care Med，2014，18（4）：205-211.

[9]劉芬，江榕，李勇，等.微小RNA-132在脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞炎症反应中的表达变化[J].中华危重病急救医学，2014，26（02）：80-83.

[10]Shrimali D， Shanmugam MK， Kumar AP， et al. Targeted abrogation of diverse signal transduction cascades by emodin for the treatment of inflammatory disorders and cancer[J]. Cancer Lett， 2013， 1；341（2）：139-149.

[11]Xu X， Wu J， Li S， et al. Downregulation of microRNA-182-5p contributes to renal cell carcinoma proliferation via activating the AKT/FOXO3a signaling pathway[J]. Mol Cancer， 2014， 13（1）：109.

[12]Dong S， Xiong W， Yuan J，et al.MiRNA-146a regulates the maturation

and differentiation of vascular smooth muscle cells by targeting NF-κB expression[J]. Mol Med Rep， 2013， 8（2）：407-412.

[13]刘芬，曾振国，聂成，等.转染微小RNA-146a对肺泡巨噬细胞肿瘤坏死因子-α表达的影响[J].中华危重病急救医学，2013，25（06）：335-338.