(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107034236 A(43)申请公布日 2017.08.11
(21)申请号 201710356084.6(22)申请日 2017.05.19
(71)申请人 浙江农林大学
地址 311300 浙江省杭州市临安市锦城镇
环城北路88号(72)发明人 王晓杜 宋厚辉 邵春艳 何海建
王鲁彦 孙静 李群景 姜胜 周莹珊 吴媛 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公
司 33212
代理人 周世骏(51)Int.Cl.
C12N 15/866(2006.01)C12N 15/50(2006.01)C07K 14/165(2006.01)
(54)发明名称
利用杆状病毒表达系统制备猪流行腹泻病毒S1蛋白的方法(57)摘要
本发明属于微生物技术领域，旨在提供一种利用杆状病毒表达系统制备猪流行腹泻病毒S1蛋白的方法。包括以下步骤：PEDV的S1基因克隆和密码子的优化；构建PEDV-S1基因重组杆状病毒表达载体；表达重组PEDV-S1蛋白的杆状病毒包装和传代；优化表达重组PEDV-S1蛋白的病毒在sf9细胞表达条件；纯化重组PEDV-S1蛋白。本发明安全性较高，不存在PEDV弱毒返强的风险；具有天然构象，具有较好的模拟PEDV病毒的免疫原作用；高滴度的免疫原，方便注射或者口服给药。CN 107034236 A
权利要求书1页 说明书5页序列表2页 附图3页
CN 107034236 A
权 利 要 求 书
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1.一种利用杆状病毒表达系统制备猪流行腹泻病毒S1蛋白的方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)PEDV的S1基因克隆和密码子的优化；
从流行性腹泻致死仔猪的小肠内容物中克隆特异的S1基因片段，进行测序后，依据sf9细胞中密码子偏好性，用同义密码子替换稀有密码子，优化合成新的PEDV-S1基因，并在该基因两侧携带EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点；
(2)构建PEDV-S1基因重组杆状病毒表达载体；以优化后的PEDV-S1基因为模板，利用PEDV-S-FL-F和PEDV-S-FL-R引物进行扩增；借助EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶，37℃酶切PEDV-S1基因和pFastBac HT A载体；酶切产物经纯化回收后，利用T4连接酶连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，在amp+的培养基上选择培养，利用菌落PCR和质粒PCR鉴定阳性克隆，构建重组质粒pSL598；
(3)表达重组PEDV-S1蛋白的杆状病毒包装和传代；将构建成功的pSL598质粒转化进DH10感受态细胞，利用蓝白斑筛选技术获得重组的阳性克隆；挑取单克隆，37℃过夜扩大培养后，提取重组的带有优化S1基因的杆状病毒基因组；利用pUC/M13 Forward和pUC/M13 Reverse引物，PCR扩增验证GFP和优化S1基因的杆状病毒基因组成功与否；
将携带有优化S1基因的杆状病毒基因组转染进sf9细胞，27℃培养箱中培养3-5天，观察细胞病变情况；当细胞病变达到70％时收集细胞裂解液，离心去沉淀，作为种毒保存；以MOI＝5的接毒量进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒扩大培养；
(4)优化表达重组PEDV-S1蛋白的病毒在sf9细胞表达条件；测定种毒的TCID50，摸索最佳接毒剂量和收获培养物的时间，SDS-PAGE检测PEDV-S1的表达情况；优化的表达条件：MOI＝2接毒，接毒后三天收样为最佳表达条件；
(5)纯化重组PEDV-S1蛋白；收集产物经浓缩后，过his-band Ni+柱进行纯化，纯化效果借助SDS-PAGE检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述PEDV-S-FL-F引物的序列如SEQ ID NO:3所示，PEDV-S-FL-R引物的序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述pUC/M13 Forward引物的序列如SEQ ID NO:1所示，pUC/M13 Reverse引物的序列如SEQ ID NO:2所示。
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说 明 书
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利用杆状病毒表达系统制备猪流行腹泻病毒S1蛋白的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种利用杆状病毒表达系统制备猪流行腹泻病毒S蛋白的技术，属于微生物技术领域。
背景技术
[0002]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起，以3-10日龄仔猪腹泻为主要特征，是能感染各年龄阶段猪的一种病毒性传染病。PEDV囊膜上有S1和S2两种纤突蛋白(Spike，S)，其中S1蛋白可识别靶细胞上的膜受体(氨基肽酶)，从而介导病毒入侵并诱导产生中和抗体。病毒吸附宿主细胞后，S2蛋白构象发生变化，加速病毒囊膜与宿主细胞膜融合，促进病毒基因组的释放。
[0003]现有技术中，预防和控制该病的疫苗是PEDV弱毒活疫苗或者灭活苗，该类型疫苗只能免疫母猪让母猪活动抗体，从而在乳汁中获得大量分泌型IgA，起到保护仔猪的作用。这种免疫策略存在以下几个问题：PEDV弱毒活疫苗存在毒力返强的风险；灭活苗则存在免疫效果不佳；两种疫苗都需要在母猪的后海穴注射，操作比较费劲。因此开发一种安全、免疫效果好的、免疫方便的新型疫苗方法，将有利于临床针对该的有效防治。有部分研究团队是利用原核表达系统，表达纯化PEDV-S1蛋白，但是该方法获得的重组蛋白不具有天然构象，不能模拟病毒表面的PEDV-S1蛋白分子。发明内容
[0004]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种利用杆状病毒表达系统制备猪流行腹泻病毒S1蛋白的方法。[0005]为解决技术问题，本发明的解决方案是：[0006](1)PEDV的S1基因克隆和密码子的优化；
[0007]从流行性腹泻感染致死仔猪的小肠内容物中克隆特异的S1基因片段，进行测序后，依据sf9细胞中密码子偏好性，用同义密码子替换稀有密码子，优化合成新的PEDV-S1基因，并在该基因两侧携带EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点；[0008](2)构建PEDV-S1基因重组杆状病毒表达载体；[0009]以优化后的PEDV-S1基因为模板，利用PEDV-S-FL-F和PEDV-S-FL-R引物进行扩增；借助EcoRⅠ和SalⅠ酶，37℃酶切PEDV-S1基因和pFastBac HT A载体；酶切产物经纯化回收后，利用T4连接酶连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，在amp+的培养基上选择培养，利用菌落PCR和质粒PCR鉴定阳性克隆，构建重组质粒pSL598；[0010](3)表达重组PEDV-S1蛋白的杆状病毒包装和传代；[0011]将构建成功的pSL598质粒转化进DH10感受态细胞，利用蓝白斑筛选技术获得重组的阳性克隆；挑取单克隆，37℃过夜扩大培养后，提取重组的带有优化S1基因的杆状病毒基因组；利用pUC/M13Forward和pUC/M13Reverse引物，PCR扩增验证GFP和优化S1基因的杆状
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病毒基因组成功与否；
[0012]将携带有优化S1基因的杆状病毒基因组转染进sf9细胞，27℃培养箱中培养3-5天，观察细胞病变情况；当细胞病变达到70％时收集细胞裂解液，离心去沉淀，作为种毒保存；以MOI＝5的接毒量进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒扩大培养；[0013](4)优化表达重组PEDV-S1蛋白的病毒在sf9细胞表达条件；[0014]测定种毒的TCID50，摸索最佳接毒剂量和收获培养物的时间，SDS-PAGE检测PEDV-S1的表达情况；优化的表达条件：MOI＝2接毒，接毒后三天收样为最佳表达条件；[0015](5)纯化重组PEDV-S1蛋白；[0016]收集产物经浓缩后，过his-band Ni+柱进行纯化，纯化效果借助SDS-PAGE检测。[0017]本发明中，所述步骤(2)中所述PEDV-S-FL-F引物的序列如SEQ ID NO:3所示，PEDV-S-FL-R引物的序列如SEQ ID NO:4所示。[0018]本发明中，所述步骤(3)中所述pUC/M13Forward引物的序列如SEQ ID NO:1所示，pUC/M13Reverse引物的序列如SEQ ID NO:2所示。[0019]发明原理描述：
[0020]杆状病毒表达系统是利用体外重组技术，重新包装的携带外源基因的杆状病毒，感染Sf9细胞，使得外源基因在Sf9细胞内表达，并且分泌到细胞外面，表达于上清中，借助标签蛋白，纯化外源蛋白。该系统表达的外源蛋白具有天然的构象，纯化后能获得高纯度和高浓度蛋白，这个产物将有利于肌肉或者口服免疫，同时具有较高的安全性，不存在弱毒返强的风险。
[0021]所以本发明选择S1作为表达对象，以期获得天然构象的S1蛋白，作为预防PEDV感染的候选疫苗和检测PEDV的抗体的抗原物质。[0022]与现有技术相比，本发明的技术效果是：[0023](1)安全性较高，不存在PEDV弱毒返强的风险；[0024](2)具有天然构象，具有较好的模拟PEDV病毒的免疫原作用；[0025](3)高滴度的免疫原，方便注射或者口服给药。附图说明
[0026]图1为真核表达PEDV的S1基因的重组载体pSL598的构建示意图。[0027]图2为pSL-598质粒的酶切鉴定；图中1：Marker，2-3:质粒酶切鉴定。[0028]图3为pSL-598质粒的重组成功鉴定；图中1:Marker，2-5:pSL598与Bacmid重组6:空白。
[0029]图4为荧光倒置显微镜观察细胞病变和对照表达情况；[0030]图5为PCR检测目的基因在杆状病毒中的重组；图中，1:Marker，2:空白，3:P2PEDV-S1Virus，4:P3PEDV-S1Virus，5:P2GFP Virus，6:P2Bacmid。[0031]图6为SDS-PAGE检测GFP和GFP-PEDV-S1的表达；
[0032]图7为Western-blotting检测GFP和GFP-PEDV-S1的表达(anti-GFP抗体)。具体实施方式[0033]1材料
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说 明 书
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1.1试验材料
[0035]仔猪小肠内容物的来源：取因流行性腹泻死亡12小时内的的仔猪尸体，解剖后提取小肠内容物。大肠杆菌DH5α，DH10Bac均由Thermo Scientific提供，Sf9细胞购自赛默飞世尔科技公司。质粒pFastBac HT A由Thermo Scientific提供。限制性核酸内切酶EcoR I、Sal I、T4连接酶购自TaKaRa公司，盐酸四环素、卡那霉素、庆大霉素购自上海生工有限公司，质粒小提试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自上海百赛生物技术有限公司，KOD plus Neo购自TOYOBO(上海东洋纺)，DNA ladder mix和prestained protein ladder购自Fermantas，sf-900TMⅡSFM和CellfectinⅡReagent购自Invitrogen公司，His Antibody购自碧云天生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯。[0036]1.2引物的设计与合成[0037]利用Vector NTI软件设计，S1基因在杆状病毒中重组表达，设计适合的引物，同时合成检测重组杆状病毒的通用引物pUC/M13Forward和pUC/M13Reverse。(如表1)。[0038]表1本发明所用到的引物
[0039]
2方法
[0041]2.1PEDV的S1基因的优化
[0042]取猪流行性腹泻致死12小时内的仔猪的尸体，经临床解剖提取小肠内容物样本，分离得到PEDV(PEDV/LA/2014/02)的RNA，反转录后合成cDNA并将其作为模板，利用PEDV的S1基因用表1所示的引物PCR扩增，PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果与NCBI数据库中公布的PEDV序列进行比对。结果证明成功克隆PEDV的S1基因。将获得的S1基因的序列在网站(http://www.genscript.com)进行Sf9细胞稀有密码子分析，结果显示S1基因在Sf9具有较多的稀有密码子。因此，为提高S1基因表达的可能性和表达丰度，将S1基因的序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行Sf9细胞密码子优化，用同义密码子替换稀有密码子，合成优化后的PEDV-S1基因，并在该基因两侧携带EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点。
[0043]2.2pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598)重组质粒的构建[0044]以优化合成的PEDV-S1基因为模板，PEDV-S-FL-F和PEDV-S-FL-R引物扩增获得优化的S1基因；分别用EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，纯化回收酶切产物；利用T4连接酶进行连接，连接后产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，在Amp+的培养基上选择培养，利用菌落PCR和质粒PCR鉴定阳性克隆，构建重组质粒pSL598(见图1)。[0045]2.3pSL598重组质粒与bacmid的重组及验证[0046]依据bac-to-bac杆状病毒表达系统操作说明，将重组质粒pSL598转化进入DH10感受态细胞，利用蓝白斑筛选技术，获得重组的阳性克隆，挑取单克隆，37℃过夜扩大培养后，利用大提试剂盒提取重组的带有优化S1基因的杆状病毒基因组。利用pUC/M13 Forward和pUC/M13 Reverse引物，PCR扩增验证GFP和优化S1基因的杆状病毒基因组成功与否。
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2.4携带S1基因的重组杆状病毒的包装和传代
[0048]依据bac-to-bac杆状病毒表达系统操作说明，将携带有优化S1基因的杆状病毒基因组转染进sf9细胞，27℃培养箱培养3-5天，然后观察细胞病变和表达情况。细胞病变达70％时收集细胞裂解液，离心去沉淀后为种毒，以MOI＝5的接毒量进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒扩大培养。
[0049]2.5目的基因(S1)的表达优化和鉴定[0050]测定种毒的TCID50，摸索最佳接毒剂量和收获培养物的时间；[0051]杆状病毒培养的上清在真空浓缩仪中浓缩10倍，取样(20μL)与适量的5×loading buffer混合均匀。重组杆状病毒的细胞沉淀，加入适量体积细胞裂解液，超声波破碎仪(工作0.8s，暂停3min)，裂解细胞沉淀，适量的5×loading buffer混合均匀，SDS-PAGE电泳。[0052]2.6PEDV-S1的纯化[0053]利用his band Ni+柱，将样品与Binding buffer混合，使样品的总体积是镍柱体积的二倍。柱平衡，加入2倍镍柱体积的Binding buffer，使加入的Binding buffer以0.5-1mL/min的流速流出，确保Binding buffer流干尽。加入裂解液，收集流出的裂解液，重复一次，确保最大的结合效率。用二倍镍柱体积的Binding buffer洗镍柱，收集洗涤液，重复几次，直到洗涤液的OD280值与Binding buffer的OD280值相等。洗脱，用二倍镍柱体积的Elution buffer洗镍柱，重复两次，每次的洗涤液分别收集。可通过测定OD280的值，判断是否洗脱干净。用Nanodrop测定蛋白浓度，将纯化后的蛋白进行分装。后续使用方便避免反复冻融。分装好的蛋白加入终浓度50％的甘油，保存于-80℃备用。SDS-PAGE电泳。[0054]3结果
[0055]3.1质粒阳性克隆的鉴定
[0056]将优化合成的S1基因和GFP基因的PCR产物和pFastBac HT A载体用限制性内切酶EcoR I和Sal I进行双酶切，经DNA纯化试剂盒纯化回收，纯化产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。回收产物用T4连接酶连接，转化到DH5α中，构建供体质粒。经过菌落PCR、质粒PCR、酶切验证及测序。结果表明pSL598均已构建成功，可以进行下一步实验。[0057]3.2重组杆状病毒DNA的鉴定[0058]将供体质粒转化到DH10中，在辅助质粒的作用下，转座子原件发挥作用，使目的基因与Bacmid重组。用引物pUC/M13Forward和pUC/M13Reverse分别以菌落和PureLink HiPure Plasmid DNA Purification Kies提取杆状病毒DNA作为模板，PCR验证。由于我们应用pFastBac HT A载体，在目的基因发生转座的过程中，pFastBac HT A载体上的一些基因也同目的基因一起发生转做，这些基因转座后也在pUC/M13Forward和pUC/M13Reverse引物的结合位点以内，因此PCR检测后的结果应该是2430bp与目的基因的，未进行重组的Bacmid用pUC/M13Forward和pUC/M13Reverse引物，鉴定结果为300bp。结果表明S1基因已经成功整合到杆状病毒基因组上。
[0059]3.3荧光倒置显微镜观察细胞病变[0060]用P2代重组杆状病毒感染sf9细胞，获得P3代重组杆状病毒。感染24h后在荧光倒置显微镜下观察细胞病变，感染组与对照组相比较，感染组细胞的生长明显受到抑制，感染组细胞变大变圆，细胞浆内有许多黑色的小颗粒，有的有空泡。[0061]3.4PCR检测目的基因在杆状病毒中的重组
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对P3代转染重组杆状病毒的sf9细胞沉淀，用基因组DNA纯化试剂盒提取
DNA，用pUC/M13Forward、pUC/M13Reverse引物检测目的基因，结果表明目的基因已经成功整合到杆状病毒基因组上。[0063]3.5Western blot检测目的蛋白的表达及条件的优化
[0064]P1代重组杆状病毒的细胞沉淀和上清分别进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别用HIS抗体和猪的阳性血清、GFP抗体作为一抗，Western blot检测目的基因的表达，结果PEDV-S1获得表达。依据种毒的TCID50，摸索最佳接毒剂量和收获培养物的时间，优化表达条件为：MOI＝2接毒，接毒后三天收样为最佳表达条件。
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<110> 浙江农林大学<120> 利用杆状病毒表达系统表达猪流行腹泻病毒S1蛋白的方法<160> 4SEQ ID NO：1<210> 1<211> 23<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用于扩增重组子的上游引物pUC/M13 Forward<400> 1CCCAGTCACG ACGTTGTAAA ACG 23SEQ ID NO：2<210> 2<211> 23<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用于扩增重组子的下游引物pUC/M13 Reverse<400> 2AGCGGATAAC AATTTCACAC AGG 23SEQ ID NO：3<210> 3<211> 37<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 用于扩增PEDV-S1全长的上游引物PEDV-S1-FL-F<400> 3CCGGAATTCA TGAGGTCTTT AATTTACTTC TGGTTGC 37SEQ ID NO：4<210> 4<211> 41<212> DNA <213> 人工序列<220><223> 用于扩增PEDV-S1全长的下游引物PEDV-S1-FL-R<400> 4
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ACGCGTCGAC TCACTGCACG TGGACCTTTT CAAAAGCTTC G 41
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