各国药典细菌内毒素检查法的比较

各国药典细菌内毒素检查法的比较

1968年美国科学家Dr. Levin和Bang建立了鲎试验法。此后世界各国对鲎试剂的生产和应用得以迅速发展。1980年美国药典20版首先收载了细菌内毒素检查法。随后,英国药典、日本药局方、中国药典等也相继收载了该方法。本文主要对中国药典1995年版与英国药典1995年增补本、美国药典23版和日本药局方13版等的细菌内毒素检查法进行了比较。

1 检验品种的比较

中国药典1995年版二部共收载细菌内毒素检查品种12个,2000年版二部增至47个,而美国药典23版收载了471个品种进行细菌内毒素检查。因此,我们需加紧对更多的品种进行细菌内毒素检查方法的研究,加快该法对药品检验的普及和推广工作,提高我国药品标准和检验水平。

2 检验方法的比较

细菌内毒素试验的方法有凝胶法、浊度法、显色基质法、免疫学法等。其中凝胶法多为限量检查法,浊度法和显色基质法为定量检查法,且后两种方法都属于分光光度法。浊度法还可分为终点浊度法和动态浊度法;显色基质法也可分为终点显色基质法和动态显色基质法。

凝胶法是较为经典的方法,各国药典都有收载,而收载了细菌内毒素定量测定法的有美

国药典、英国药典、欧洲药典和日本药局方等。中国药典1995年版只收载了凝胶法,2000年版才涉及到定量测定法。因此,我们还需要对细菌内毒素定量测定进行研究,需要有供定量测定用的标准品、仪器和试剂,以后逐步建立起我国的细菌内毒素定量测定方法。

3 细菌内毒素标准品

各国药典均设置了细菌内毒素的标准品,其中中国药典、英国药典和美国药典还可采用根据标准品为基准进行标定的工作标准品或对照标准品。除英国药典采用U为内毒素的单位外,其余各国药典都用EU为内毒素的单位。

美国药典和中国药典对内毒素标准品每一步稀释时的混匀时间作出了明确规定。除中国药典外,其余各国药典规定了内毒素标准贮备液在冰箱里保存不得超过14d,且用前应在旋涡混合器上充分混合至少3min。

4 细菌内毒素检查用水

细菌内毒素检查用水系指与使用批号鲎试剂在一定时间内不产生凝集反应的注射用水。在英国药典中,不允许用家兔热原试验的技术检查细菌内毒素检查用水是否含内毒素。

5 试验准备

由于内毒素能吸附在塑料或玻璃制的小管或吸管表面,塑料材料也可能释放干扰物质,因此英国药典要求检查所用的材料,并建议检验者在更换新批号的材料时要重新检查。

在英国药典中没具体指明除去外源性内毒素的方法,而在中国药典和日本药局方中明确指出所用容器或器皿要在250℃条件下干烤至少1h。美国药典也采用高温烘烤法除去外源性内毒素。无论使用什么材料,什么方法,都应确认在试验中没有可被检测的外源性内毒素和(或)干扰作用。

6 限量法的检查

6.1 鲎试剂灵敏度复核

鲎试剂灵敏度的复核主要是用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素标准品制备成4个连续的2倍稀释的系列溶液,即2λ(λ为鲎试剂灵敏度)、λ、0.5λ和0.25λ,然后按细菌内毒素检查法下操作,最后根据试验结果,计算出每一系列稀释液出现阳性结果的最低浓度对数平均值,该平均值的反对数即为鲎试剂的灵敏度测定值。

除日本药局方外,英国药典和美国药典均要求在做鲎试剂灵敏度复核时要设置阴性对照。中国药典1995年版的1998年增补本中也增加了这一要求。有了阴性对照,才能证实鲎试剂及细菌内毒素检查用水中没有可测出的内毒素,使试验更具科学性和可靠性。

对4个连续的2倍稀释的系列溶液的检出结果,美国药典未做说明,中国药典则要求最高浓度4管均为阳性,最低浓度4管均为阴性,而英国药典和日本药局方只要求最低浓度的

结果为阴性。

此外,中国药典和美国药典要求灵敏度测定值在0.5λ~2.0λ之间,且包括0.5λ和2.0λ,英国药典和日本药局方则未对是否包括0.5λ和2.0λ做出说明。

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6.2 供试品干扰试验

供试品干扰试验与鲎试剂灵敏度复核试验最大的不同点在于溶解内毒素标准品的溶剂除了用细菌内毒素检查用水外,还要用未检出内毒素的供试品溶液或不超过最大有效稀释倍数(MVD)的稀释液,其余操作和结果计算则大体相同。仅有英国药典未要求用细菌内毒素检查用水与供试品一同对照,用上述供试品稀释内毒素标准品即可。

在英国药典中排除干扰的方法有稀释、过滤、中和、透析,或加入几种不吸附内毒素,使用更灵敏的鲎试剂等,且要求在干扰排除后,要在供试品中加入内毒素标准品后重复干扰试验,以验证所选处理方法能有效排除干扰而不影响内毒素的测定。而在其他几部药典中提到的方法较少一些。

6.3 检查法

在做供试品细菌内毒素检查时,需设置阴性对照、阳性对照和样品阳性对照。美国药典、英国药典和日本药局方对样品阳性对照都有规定,中国药典是在1995年版的1998年增补本中增加这一项目的。因样品阳性对照可证明在试验条件下被检查的供试品溶液中不

存在干扰作用。

在英国药典中还提出,如有必要,可使用0.1 mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠溶液或一种合适的缓冲液调节供试品pH值,使其pH值在6.5~7.5之间。美国药典和日本药局方也有类似的要求,中国药典目前还没严格要求混合物的pH值。由于混合物的pH值在6.5~7.5之间时,细菌内毒素产生最佳凝结,所以对混合物的pH值做出限定还是有必要的。

6.4 结果判断

几部药典都要求当设置的阳性对照、供试品阳性对照为阳性,阴性对照为阴性,试验才有效。供试品管均为阴性则认为符合规定;若为阳性则不符合规定;如一管为阴性,一管为阳性则需复试。

7 定量法的检查

美国药典和英国药典没有制定出细菌内毒素定量检查法的具体操作,但需要证明该法中的标准曲线符合直线回归要求,对终点法还要求其截距应近似为零,然后通过内推法确定被测物质的内毒素含量。

在日本药局方中收载了两种细菌内毒素定量测定法。第一种是凝胶法,该法要求用细菌内毒素检查用水将供试品和内毒素分别稀释为4个浓度,供试品的稀释倍数分别为1、2、4、8倍,内毒素浓度则分别为2λ、λ、0.5λ和0.25λ,每个浓度均做2管,同时设置阴性对照和阳性对照,按检查法操作。对于供试品稀释液,先计算出溶液的终点浓度,以每一终点

对应的稀释倍数(以十进位小数表示)乘以λ,供试品溶液中内毒素的浓度则通过计算供试品溶液稀释后测得的终点浓度的几何平均值获得。

第二种光度法需要进行标准曲线的可靠性试验和用供试品溶液进行的抑制或增强试验。然后按检查法做2管供试品管,同时制备标准曲线(即阳性对照),设置阴性对照和样品阳性对照。其中样品阳性对照的内毒素浓度为标准曲线中的最高浓度和最低浓度的中间值。供试品内毒素浓度可用阳性对照组产生的回归曲线计算。

在细菌内毒素定量检查法中采用的鲎试剂,生物特异性好,标准化程度高,操作简单,成本低廉,使得这一方法越来越得到普遍的应用。

通过对各国药典中细菌内毒素检查法的比较,可以看出中国药典在此法上已做了很大的改进,但还存在一定的差距。我们相信更规范、更科学、更先进的中国药典细菌内毒素检查法终将出台,继续指导我们对药品的质量监督,发挥出更大的作用。

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