土壤微生物生物量的测定方法
1土壤微生物碳的测定方法〔熏蒸提取----仪器分析法〕
1.1 根本原理
新鲜土样经氯仿熏蒸后〔24h〕，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数〔KEC〕，从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器
自动总有机碳〔TOC〕分析仪〔Shimadzu Model TOC—500,JANPAN〕、真空枯燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂
1〕无乙醇氯仿〔CHCL3〕；
2〕0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中
3〕工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、
70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。〔其实一般情况下，
仪器会自带的标曲，一般不用自己做的〕
1.4 操作步骤
1.4.1 土壤的前处理〔过筛和水分调节略〕 1.4.2 熏蒸
称取新鲜〔相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定〕3份分别放
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入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空枯燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿〔约2/3〕的15ml烧杯2或3只，烧杯放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，枯燥器底部参加少量水以保持容器湿度。盖上真空枯燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空枯燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理
熏蒸完毕后，翻开真空枯燥器阀门〔应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做〕，取出盛有氯仿〔可重复利用〕和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁枯燥器，反复抽真空〔5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全翻开枯燥器盖子〕，直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一枯燥器中为不熏蒸对照处理。〔注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提〕1.4.4 浸提过滤
从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，参加40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液〔土水比为1:4，考虑到土样的原因，此局部熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个参加量要根据TOC仪器的进入量决定〕300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存〔但使用前需解冻摇匀〕〔注意这局部很重要，有研究结果说明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元〕。 1.4.5 TOC仪器测定
※
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吸取上述土壤提取液10ul〔这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进展稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。〕注入自动总有机碳〔TOC〕分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪〔Shimadzu Model TOC---500,JAPAN〕为例。
1.5 计算
SMBC=(ECCHCL3—ECCK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/0.45
2 土壤微生物生物量氮〔茚三酮比色法〕
土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下
2.1 根本原理〔茚三酮比色法〕
Amato和Ladd〔1988〕研究说明新鲜土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成分为α-氨基酸态氮和铵态氮，这两种氮形态可以用茚三酮反响定量测定，并发现熏蒸与未熏蒸土壤提取的茚三酮反响态氮的增量，与其土壤微生物生物量碳之间存在显著的相关性。因此，人们采用熏蒸提取茚三酮比色法来测定土壤微生物生物量氮〔FE-Nnin〕。 2.2 实验仪器
分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空枯燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等
2.3 实验试剂
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1〕无乙醇氯仿〔CH3Cl〕；
2〕0.5mol/L (K2SO4)溶液：称取硫酸钾〔K2SO4〕87g，溶于去离子水中，稀 释至1000ml；
3〕pH5.2的乙酸锂〔LiOH•H2O〕溶液：称取氢氧化锂〔LiOH•H2O〕168g，加
入冰乙酸〔优级纯〕279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%氢氧化钠溶
液调节pH至5.2。
4〕茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜〔C2H6OS〕和乙酸锂溶液50ml参加4g水
合茚三酮〔C9H4O3•H2O〕和0.12g复原茚三酮〔C18H10O6•2H2O〕搅拌至完全
溶解；
5〕50%乙醇水溶液：吸取50ml 99%乙醇于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容； 6〕1mol/L的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵〔称 前105℃烘2h〕溶于0.5mol/L 硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000ml，
摇匀，于4℃冰箱中保存。
7〕0.1mol/L 的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10ml 1mol/L的硫酸铵标准
储存液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100ml，摇匀。此
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溶液最好现配现用。
8〕工作曲线的制备：分别吸取0.00ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、
mol/L的硫酸铵标准液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液 定容至100ml，摇匀，其浓度分别为0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、
1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L硫酸铵标准氮的系列溶液。
2.4 操作步骤
2.4.1 土壤的前处理〔和1.4.1一样〕
2.4.2 熏蒸〔和1.4.2一样〕 2.4.3抽真空处理〔和1.4.3一样〕 2.4.4 浸提过滤
从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，参加40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液〔土水比为1:4，考虑到土样的原因，此局部熏蒸和不熏蒸土均为2g，即，2g土：8ml的硫酸钾溶液〕300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存〔但使用前需解冻摇匀〕〔注意这局部很重要，有研究结果说明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃
※，否则将影响浸
提液的效果，，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元〕。
2.4.5 分光光度计比色测定〔此处沸水浴不好控制※〕
-
吸取0.5ml样品提取液和标准工作液，分别置于10ml的塑料离心管中，参加2ml茚三酮显色剂，涡旋搅拌充分混匀，置于试管架上，在沸水中水浴15min，迅速冷却〔冰浴约2min〕，参加5ml稀释液〔50%乙醇水溶液〕，摇匀于570nm下比色。 2.5 结果计算
SMBN=(ECCHCL3—ECCK)*稀释倍数*原来的水土比*5
❖ 土壤微生物生物量氮的测定〔全氮测定法,建议使用此法〕
注意：所配的试剂和全自动凯氏定氮仪的试剂一样，具体见农化分析课本
2.4.1 土壤的前处理〔和1.4.1一样〕
2.4.2 熏蒸〔和1.4.2一样〕 2.4.3抽真空处理〔和1.4.3一样〕 2.4.4 浸提过滤
从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，参加40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液〔土水比为1:4，考虑到土样的原因，此局部熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，2g土：16ml的硫酸钾溶液〕300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存〔但使用前需解冻摇匀〕〔注意这局部很重要，有研究结果说明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃
※，否则将影响
浸提液的效果，，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元〕。
2.4.5 全自动凯氏定氮仪的测定
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吸取10ml滤液与消煮管中，参加K2SO4—CuSO4—Se混合催化剂1.08g，参加4ml浓硫酸；同时设置2—3空白〔10ml的0.5mol/l的K2SO4，参加K2SO4—CuSO4—Se混合催化剂1.08g，参加4ml浓硫酸〕；在高温消化〔340℃消煮3个小时〕至澄清后放置2-3h。然后用全自动凯氏定氮仪测定浸提液中的全氮含量。 2.5 结果计算
EN=(VS-VO)*CH2SO4*14*1000*(16/10)÷WS
式中：EN为全氮，VO为滴定空白对照所消耗的标准硫酸体积〔注意：消煮一批土样至少需要3个对照
※〕，V为滴定土样所消耗的标准硫酸体积，C
S
H2SO4
为
硫酸浓度〔这个浓度要进展标定的，具体见农化分析课本〕，14为氮的摩尔质量，1000为千克转化成克，16/10为从16ml的提取液中吸取10ml，WS为干土重
所以： 土壤微生物生物量氮Bn=(ENCHCL3—ENCK)/0,54
见?土壤微生物研究原理与方法?，主编：林先贵 中科院土壤研究所
3 土壤微生物生物量磷〔无机磷测定法〕
Brookes等〔1982〕报道土壤熏蒸处理所释放出来的磷大局部为无机磷酸盐，可被0.5mol/LNaHCO3等提取剂提取，而且熏蒸和未熏蒸土壤之间无机磷的差异，能够反映土壤微生物生物量磷的上下。于是，Brookes等建立了土壤微生物生物量磷的熏蒸提取---无机磷测定法。 3.1 根本原理
新鲜土壤经氯仿熏蒸后〔24h〕，采用0.5mol/LNaHCO3溶液提取被杀死的土壤微生物生物量磷，在锑钼抗混合试剂作用下提取液中正磷酸与钼酸络合形
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成磷钼杂多酸〔在一定酸度条件下〕，可用磷钼比色法测定提取液最好全磷含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机磷量的差值和转换系数〔kp，这个系数很重要，因为如果没有这个系数，所测定的结果就是土壤的速效磷，但是土壤微生物熏蒸后释放的磷大多数是无机磷，而速效磷包括全部水溶性磷、局部吸附态磷及有机态磷，有的土壤中还包括*些沉淀态磷，因此速效磷和无机磷的畴不一样，不要搞混
※〕以及外加无机磷的回收率〔Rpi〕作为校正系数，从而估算土
壤微生物生物量磷。 3.2 实验设备
分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空枯燥器、离心机、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等 3.3 实验试剂
1〕无乙醇氯仿〔CH3Cl〕；
2〕0.5mol/L碳酸氢钠〔NaHCO3〕浸提液：溶解NaHCO342.0g于800ml水中，
以0.5mol/LNaOH溶液调节浸提液的pH至8.5，再用蒸馏水稀释至1000ml。 此溶液曝于空气中可因失去CO2而使pH增高，可于液面加一层矿物油保存。 此溶液储存于塑料瓶中比在玻璃瓶中容易保存，假设储存超过一个月，应检查 pH是否改变；
3〕磷酸二氢钾溶液【p〔KH2PO4〕=250 ug p /ml】：称取1.0984g分析纯磷酸二
氢钾〔称量前105℃烘2~3h
※〕，溶于去离子水并定容至1000ml；
-
4〕钼锑抗试剂：〔间鲍士旦的土壤农化分析课本〕
5〕磷标准液：准确称取在105℃烘箱中烘干的KH2PO4〔分析纯〕0.2195g，溶
解在400ml水中，加浓硫酸5ml〔加硫酸放置霉菌，可是溶液长期保存〕，转
入1000ml容量瓶中，加水定容至刻度。此溶液为50ug/ml磷标准液。吸取上
述磷标准液25ml，定容至250ml，即得5ug/mL磷标准液〔此溶液不可久存
※〕
6〕工作曲线：准确吸取5ug/ml磷标准液0、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml分别放入25ml容量瓶中，加水至约20ml，然后加钼锑抗试剂4ml，最后用水定容至25ml。30min后开场进展比色。各瓶比色液磷的浓度分别为0ug/ml、0.1 ug/ml、0.2 ug/ml、0.4 ug/ml、0.6 ug/ml、0.8 ug/ml、1.0 ug/ml磷。 3.4 操作步骤
3.4.1 土壤的前处理〔和1.4.1一样〕 3.4.2 熏蒸〔和1.4.2一样〕 3.4.3抽真空处理〔和1.4.3一样〕 3.4.4 浸提过滤
从枯燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到250ml聚乙烯提取瓶中，参加200ml 0.5mol/L NaHCO3浸提液〔土水比为1:20，考虑到土样的缺乏，这个局部称取2g土，比值为2g土：40ml NaHCO3〕，300r/min振
-
荡30min，用慢速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存〔但使用前需解冻摇匀〕。 3.4.5无机磷的回收率〔很重要
※〕
另称取经前处理相当于干土2.0g土样2份，分别放入三个50ml聚乙烯提取瓶，参加0.2ml 250 ug p /ml磷酸二氢钾溶液，再参加40ml 0.5mol/L碳酸氢钠〔NaHCO3〕浸提液，同上进展提取。用于测定外加正磷酸盐态无机磷的回收率〔Rpi〕，以校正土壤对熏蒸处理所释放出来的微生物生物量磷的吸附和固定。土壤提取液也立即分析，或—20℃冷冻保存〔但使用前需解冻摇匀〕。 3.4.6 分光光度计比色测定
吸取10ml提取液〔依样品的含磷而定〕于25ml容量瓶中，参加适量的1.0mol/LHCl溶液进展中和，HCl溶液的参加量通常为提取液体积的1/2，放置4h并间隙振荡，以排除溶液中的CO2。补充去离子水至20ml，参加4ml混合显色剂，再加水定容，摇匀。显色完全〔约30min〕后，在882nm波长处进展比色。 3.5 结果计算
土壤微生物生物量磷BP= Ept/〔Kp*Rpi〕单位为mg/kg
式中Ept为熏蒸和未熏蒸的土壤差值，即：(EPCHCL3—EPCK),EPCHCL3〔EPCK〕=W1(分光光度计的值)*2.5(容量瓶的稀释倍数)*4〔40nl浸提液中取10ml〕*20〔水土比〕，Rpi=[(外加KH2PO4溶液土壤的测定值—未熏蒸土壤的差值)/25]*100%,其测定和算法也是和EPCHCL3〔EPCK〕一样；Kp为转化系数，取值为0.4
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