实时荧光定量PCR

1、实时定量PCR是什么?

定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃。

白话版：简单的说，就是在PCR体系中加入荧光，以便对反应体系和反应进程进行监测，记录，分析。而PCR仪无非是在普通PCR的基础上加上个荧光探头和相应的数据处理软件而已。所以说，FQ-PCR不神秘。

2、为什么要发展出FQ-PCR?

早期定量PCR 技术的难点主要在于：（1）如何确定PCR 正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR 产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。（2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA(1)或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；有的研究者加一个竞争性模板，有的做限制性的稀释梯度分析，或者加一个PCR 模拟（mimic）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增。而扩增产物的检测通常在跑胶以后通过染料，放射活性或者探针进行检测。

在实时PCR 中，不再需要担心扩增的线性和放射性污染，也不再需要跑胶和手工收集数据，2到3小时之内就可以拿到数据。除此之外，实时PCR 还有其它的一些优点：灵敏度大大提高；可以实现高通量；所有实验在封闭系统内完成，可变因素大大减少；可以进行多重PCR 反应，而且不需要后期处理。

白话版：定量PCR是为了测定或比较扩增前样品的量，普通PCR的扩增有线性(中期)和平台期(后期)，而到了平台期，拷贝数不一样的样品会得到相同的终产物量；早期的定量只能称为半定量，而且定量是终产物采用跑胶，染EB，测光密度的方法，不仅不准确，而且繁琐。FQ-PCR的出现真是应时而现啊！

3、科学研究中核酸定量有何意义?

白话版：科研中最基本，最常用的是比较基因表达的差异。一般从两个水平来看，一是mRNA水平；二是蛋白水平。mRNA水平在FQ-PCR出现前进行的是反转录半定量PCR、跑胶、测EB的光密度，其缺点已在上个问题中谈到。

4、FQ-PCR可以干些什么?

①可以对各种基因的表达进行定量分析，如：同一基因在不同组织中的表达差异、同一基因在不同药物处理后的表达差异、转基因食品的检测。

②可以进行点突变分析和等位基因分析，用不同的荧光报告基团标记 Taqman 探针，然后分别与野生型和突变型杂交，如果一种荧光信号明显强于另一种荧光信号，则表明它是纯合子；如果两种荧光信号都明显增强，则表明它是杂合子。分子信标（ Molecular Beacon ）就是专门为这种技术设计的探针。

③可以进行单核苷酸多态性的分析，检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。

④可以进行 DNA 甲基化检测， DNA 甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight 的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman 探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。

⑤对传染性疾病进行定量定性分析，这在我国应用比较广泛，大家比较熟悉。许多生产临床 PCR 试剂的厂商已经陆续推出了一系列的诊断试剂，如：肝炎系列、性病系列、肿瘤系列等等。

白话版：上面的罗列让人头大，但在硕士阶段用得最多的还是第一条，其他的用途需要特异的探针，老板要心疼的。

5、作FQ-PCR需要准备些什么?

以检测mRNA表达差异（荧光染料为SYBR Green I）为例说明：

①总RNA提取试剂：如trizol

②反转录试剂：Oligo(dT)作为mRNA的通用引物；目标基因和内参基因的引物(以多重PCR参数标准设计，两对引物一般分别在两管中扩增，要考虑引物退火温度一致的问题，最好是直接引用国外文献上FQ-PCR的引物和反应条件，否则反应条件要自己摸索)；反转录酶；Taq酶；dNTP；RT-PCR buffer；[或者直接应用一步法反转录试剂盒，反应体系中加入SYBR Green I]

③（FQ-PCR用）SYBR Green I荧光染料（这东西便宜，如果要用特异性荧光显示两

种序列的扩增，一般用TaqMan探针，由公司设计、合成，价格不菲）

6、作FQ-PCR作表达差异分析一般步骤是怎样的？

①组织或细胞总RNA的提取，依试剂说明进行。由于mRNA很快会降解，所以尽快取材提取mRNA保存很重要。（提取总mRNA的过程中，-20℃可保存，具体参照RNA提取试剂的说明）

②确定反应体系，加样到FQ-PCR反应管中（我院的FQ-PCR仪要使用配套的反应管或反应板）

③进行扩增，电脑自动记录数据，在相应人员（王博士、任东明）的协助下完成数据的分析，得出结论。

7、哪些情况会导致标本的RNA降解？（参考TRIZOL的说明）

①用来提取RNA的标本保存在-5~-20℃（保存RNA应该用-60~-70℃）

②细胞被胰蛋白酶消化

③提取RNA所用的溶液中含有RNA酶

④用含甲醛的琼脂糖凝胶电泳，pH值低于3.5。

RNA degradation

Tissues were not immediately processed or frozen after removal from the animal.

Samples used for isolation, or the isolated RNA preparations were stored at -5 to-20°C, instead of -60 to -70°C.

Cells were dispersed by trypsin digestion.

Aqueous solutions or tubes were not RNase-free.

Formaldehyde used for agarose-gel electrophoresis had a pH below 3.5.

8、FQ-PCR为什么要有内参？一般使用哪些内参？

不论在核酸还是蛋白的检测中，都会涉及到内参的问题。内参是为校正加样时的不一致而设定的一个反应体系量的衡量标准。内参即内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定。一般使用的内参有GAPDH、β-actin。

9、FQ-PCR能作定量是什么原理？

两个重要概念：（1）荧光域值（ threshold）： 以PCR反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号一般荧光域值定义为3---15个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。(2)Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。其含义是：在PCR循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻，可见Ct值取决于阈值。经数

学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。

白话版：如果说上面的原理介绍很“官方”的话，简单的理解，打个比方，A的拷贝数为1，B的拷贝数为5，他们扩增到拷贝数50时，所需要的循环数肯定不一样，A所需的循环数多，B所需的循环数少。这里的拷贝数50就好比荧光域值（ threshold），它是人工设定的值；而各自所需的循环数即是Ct值，通过比较Ct值就可以比较初拷贝数的不同。荧光值的大小反映了扩增产物的量，再打一个比喻——赛跑，终点就好比我们设定的荧光域值（ threshold），而初拷贝数就是不同的起跑点，不同的起跑点到达终点所需的步数（Ct值）不一样。

10、主要采用的指示染料是什么？

主要应用的是SYBR Green I荧光染料、TaqMan探针。

SYBR Green I荧光染料方法的作用原理

SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料，当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。它的缺点是在于能与非特异性双链DNA（如引物二聚体）结合，但是其产生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。

TaqMan探针方法的作用原理

本方法的原理主要是利用Taq 酶的5'→3'外切核酸酶活性并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针，它可以特异性的显示不同的扩增序列，在多重PCR中常用。

11、如何分析FQ-PCR的结果？

比较基因相对表达差异的方法一般为2-ΔΔCt法，公式为：

ΔΔCt=(Cttarget-Ctactin)timeX-(Cttarget-Ctactin)time0

（timeX和time0可以理解成不同组织；处理前后）

ΔCt的计算方法要注意有所区别：（以c-myc与内参GAPDH为例）

如果c-myc和GAPDH在不同管子里做（目前的财力下通常这样，因为SYBR Green I结合DNA双链没有特异性，只有把两种序列分到两个管，在相同的条件下扩增），应该分别计算出c-myc 和GAPDH 的平均Ct来计算△Ct。

如果如果c-myc和GAPDH在同一管子里做（双重PCR，但需要两种TaqMan探针的标记不同

的扩增产物），c-myc和内参GAPDH扩增时加入的cDNA 量都是一样多的，所以可以分别对每个管子计算△CT 值，这些值取平均后再进行2-ΔΔCt计算。

12、我院实时定量PCR仪使用中有哪些主要技术参数？

我院的实时定量PCR仪全名为DNA Engine OpticonTM 2，主要参数如下：

①96孔样品模块能和许多标准的管和平板相匹配（96孔，低剖面的平板和0.2ml的条形管）；

②热盖保证热循环过程无油操作；

③激发光谱范围在470nm到505nm的荧光染料；

④灵敏的光学系统，第一通道能检测发射光谱在523nm到543nm的荧光基团（SYBR® Green, FAM）；第二通道则能检测540nm以上的荧光。

⑥精确度：30秒内精确度为0.3°C

⑦列内均一性：30秒内每一列孔间温度均一性为0.4°C

⑧梯度控制精确度：0.4°C

⑨温度梯度下限：30°C

⑩温度梯度上限：105°C

13.溶解曲线：简单的说来，溶解曲线就是在采用荧光染料法进行实时定量PCR时采用的一种分析手段。当体系的温度逐渐升高的时候，体系中的PCR产物慢慢的由双链变成单链，这是一个逐渐变化的过程。由于荧光染料能插入到双链DNA中而发光，单链不发光，因此可以看到荧光的变化。在实时荧光PCR仪中都应该自带分析软件，看溶解曲线主要是看其峰在什么位置，不同的核酸会有不同的峰。同一核酸的峰差别应该不大，一般能控制在正负0.5度内。

一般染料法定量pcr在进行完pcr后都要运行熔解曲线，一般设定先94度几分钟，然后骤冷到65度（假定65度为退伙温度）。在65度时，pcr产物是以双链的形式存在的，

因为染料是插到双链dna的小沟里然后发荧光的，所以这个时候检测到很强的光信号，随着温度升高，双链逐渐打开，荧光信号逐渐减弱。因为理论上要检测的样本长度一定，所以到达某一个温度的时候，应该全部解链，我们假设在88度的时候pcr产物全部解链，这个时候就是我们在熔解曲线图上看到的所有曲线同时骤然下滑的那个点，一般把最高温设定在94度左右。如果下滑点不在一个温度，说明不是一种产物。

我们也可以通过取log的图来查看，可以更加明显的看到pcr产物是否特异。