病理学技术在水生动物疾病学上的应用进展

中田Ｉ柯方竹（１『『、ｌ蔓）渔业·譬术论坛沦文！｛三［１８］文其乙．产气荧膜梭菌肠霉素的致病机理研究进展［Ｊ］．动物医学进展．２００２，２３（２）：１７－１９．病理学技术在水生动物疾病学上的应用进展汀开鞔何敏李证军（四川农业人学．水生动物疾ｊｉｉｉ研究中心雅安市６２５０１４）（Ｐｑ川省水产局成都市６１００７２）摘要本文对病理学技术在水生动物疾病研究中的地位和作用进行了阐述，并对传统病理学技术向现代病理学技术的发展进行了分析，同时对病理学技术在水生动物研究中的应用所取得的进展进行了综述总结。关键词水生动物疾病病理学技术１水产动物病理学技术的发展病理学是研究动物疾病的原因、发生、发展规律及患病机体的形态结构，物质代谢和机能变化的－ｒｌ学科。它既可作为基础理论学科为临床医学奠定坚实的基础，义可作为应Ｈｊ学科直接参与疾病的诊断和防治，因此病理学长期以米被形象地喻为“桥梁学科”和“权威诊断”。传统病理学主要是采心尸检、活检、肉眼观察及光镜观察等研究手段。观察动物组织的病变特点，它为病理学的进一步发展奠定了坚实的基础。国际著名病理学家ＫａｒｌＬｅｎｎｅｒｔ提出：“技术是病理学之母”。随着科技进步，传统病理学与其它学科的相互渗透。细胞病理学、超微病理学、免疫病理学、分子病理学、信息病理学等相继出现，构成了现代病理学体系。该体系吸收了当今生物化学、免疫学和分子生物学的最新研究方法和取得的最新成果，使病理学的观察从器官、细胞水平，深入剑弧细胞、蚩白表达及基冈的改变。这不仅使病理学的研究更深入一步，同时也使病理学的研究方法渗透剑各基础学科。水生动物病理学技术是水生动物疾病研究不可缺少的部分，与人类医学和兽医学中病理学的应州相比，水生动物病理学技术起步较晚，技术水平相对落后，但近年来取得了飞速的发展。有关水生动物病理学第一部较完整的著作是Ｗ．Ｅ。里贝林、Ｇ．三垣两博士１９７２编著的《鱼类病理学》，但该寸５只是分类编辑了一次国际的鱼病研究学会的论文。其后，日本的江草周三等１９７９年出版了《鱼类病理组织学》：美国的Ｒｏｂｅｒｔｓ七十年代早期编著的｛ＦｉｓｈＰａｔｈｏｌｏｇｙ》第一版，重点是描述传统病理学和微生物技术方面的研究，现在｛ＦｉｓｈＰａｔｈｏｌｏｇｙ｝已经出版了第一二版，其内容也在原米基础上加入了分子生物学技术，说明水产动物病理学的发展已进入一个新的研究阶段。在我国，著名的鱼病学专家黄琪琰教授等一批学者对我国水产动物病理学的发展作出了重人贡献，对许多水产动物疾病进行了较早的研究和描述，为奠定我国水产动物疾病学研究打下了重要的基础。随着水生经济动物养殖业的发展，特别是海水经济动物养殖的兴起，养殖品种的不断扩大，疾病研究的范嗣也随之扩人，不但对淡水温水性鱼类的疾病进行研究，而且对冷水性鱼类、海水鱼类、咸淡水鱼类、甲壳类、软体动物、两栖类、爬行类以及观赏性水生动物等水生养殖动物的疾病利防治也展开研究，研究技术也已从显微组织病理深入到弧显微组织病理、生物化学技术、免疫组织化学技术以及分子生物学技术，尤其是分子生物学技术在水生动物疾病上的研究对水产动物病理学的发展产生了深远的影响，促进了水生动物病理学技术的飞速发展。２病理学技术在水产动物疾病上的应用１９４中国南方行（市、区）渔、ｌｋ学术论坛论文集２．１常规癍理技术常规病理技术主要是指病理解剖技术和组织痫理学技术，是最基本也是最重要的病理学技术，病理学的研究最先就从这里开始，无论其它病理技术的发展应用程度如何，在病理学诊断和研究中，常规病理技术都是必不可少的。病理解剖技术是通过解削动物体观察机体各组织器官的病理变化，找山主要病变、分析判断直接死亡原Ｉ灭｜的一种重要方法，是病理学技术最基础且最重要的一部分。水生动物疾病学的发展首先也是在这一技术基础上不断发展的。常规的组织病理学技术主要是采朋石蜡切片及ＨＥ染色等，通过光学显微镜观察水产动物组织的病变特点，此法是病理学研究从宏观到微观的第一步。黄琪琰等（１９８３）…运川组织病理学技术研究了草鱼细菌性烂鳃病的组织病理变化。郑德崇等（１９８６）啦！对草鱼出血病组织病理学进行了系统的研究。黄珙琰等（１９９１）ｏ。”相继对异育银鲫溶血性腹水病和草鱼疖疮病的组织显微病理进行了研究。Ｌｉｇｈｔｎｅｒ（１９９３）插’应删Ｇｉｅｍｓａ染色涂片法对虾ＢＰＶ进行检测。黄琪琰等（１９９５）州报道淡水鱼类细菌性败血症的肝、脾、肾组织弧显微病理变化及防治方法，并比较了鲫、团头鲂、鲢、鳙患此病后的症状和病理变化。郭琼林等（１９９５）¨ｏ报道鳗鲡爱德华氏菌病病变性质为化脓性炎症。陆宏达等（１９９６）坤１对鳖嗜水气单胞菌败血痖的病理学变化进行了研究。蔡完其等（１９９７）州对中华鳖爱德华氏菌病病原和组织病理进行研究。郭琼林等（１９９７）ｕ刨报道了鳗鲡出血性开口病的组织病理变化。蔡完其等（１９９８）［ｔＪ对由嗜水气单胞菌，普通变形菌等多种细菌引起的中华鳖穿孔病的病理变化进行研究。潘连德等（２０００）ｕ纠对鲟鱼心外膜脓肿的病理学进行了初步研究。郭琼林等（２００１）ｕ引报道了鲤肠道巨囊病的组织病理学变化。汪开毓等（２００２）…ｏ对鲤鱼进行了喹乙醇急性中毒的病理学研究。陆宏达等（２００３）ｕ纠发现病虾腹部向浊的肌肉组织肌纤维肌浆内存在嗜碱性包涵体，肝胰腺、血细胞、心脏和鳃组织细胞脑浆内也有嗜碱性包涵体出现。汪开毓等（２００４）ｕ州报道了由嗜水气单胞菌嗜水Ⅱ种（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｓｕｂｓｐ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）感染鲤鱼引起细菌性败血症的病理学变化，并在病理变化观察的基础上探讨了该病发生的机理。绳秀珍等（２００６）㈣对患淋巴囊肿病毒病的牙鲆和鲈鱼的组织进行显微观察，并对病毒感染的靶器官进行了研究。黄琪琰等（１９９３）¨刚对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病人种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，证实寄生虫性鳃病均可引起鳃纽织发生炎症反应。李海燕等（２００６）ｕ町也运用此法对义尾斗鱼（Ｍａｃｒｏｐｏｄｕｓｏｐｅｒｃｕｌａｒｉｓ）的火钩关睾虫（ＢｅｔｅｒｏｎｃｈｏｃｌｅｉｄｕｓｍａｇｎｉｈａｍａｔｕｓＺｈａｎｇｅｔＪｉ）和小钩关睾虫（Ｈ．ｂｕｓｃｈｋｉｅｌｉＢｙｃｈｏｗｓｋｙ）病进行了病理学研究。叶仕根等（２００６）脚１用含质量分数为１０％的氧化鱼油半精制饲料饲喂鲤，并对鲤摄食氧化鱼油后的病理学变化进行了研究。这些研究涉及了细菌、病毒、寄生虫、营养、中毒等多方面的原冈引起的疾病，研究的对象包括了淡、海水的鱼虾鳖等多种水生动物。２．２超微病理学技术超微病理学技术是研究细胞的超微结构及其病变的一种有力手段，在半个多世纪的实践中，已显示山它旺盛的生命力和Ｊ’．阔的应用前景。它不仅在水生动物疾病的病冈、发病机制的阐明和对疾病本质的认识方面发挥了卓越的作｝｛ｊ，而且在对疾病的诊断方面亦起着日益重要的作用。如张奇丽等（１９９９）托¨对患暴发性传染病的鳜病变组织进行了超微结构观察。周化民等（２０００）盟１应川电镜研究斑节对虾向斑综合症杆状病毒（ＷＳＳＶ）感染的组织特异性，证实ＷＳＳＶ组织特异性著，感染外胚层和中胚层米源的各种组织细胞的细胞核。李海燕等（２０００）比卅从亚显微结构观察患有由柱状屈桡杆菌引起的鳜烂鳃病的鳃、肝、肾组织＿ｊｆＩＩ细胞的病变情况。陆宏达等（２００２）嵋刮通过相差显微镜和电镜观察了中华绒螯蟹血细胞胞质内有无颗粒以及颗粒人小、染色反应、折光性和形成方式的特点。汪开毓等（２００３）幢酬对鲤慢性喹乙醇中毒的超微病理学进行了研究。耿毅等（２００５）拉酬进行了斑点义尾劁疱疹病毒感染的病理形态学观察。乇晓杰等（２００６）拉¨对许氏平啬由鳃、头肾、脾脏在盐度胁迫下的超微结构１９５中闻向方行（市，Ｉ蔓）渔业。’≥术沦坛论文集病理变化进行研究，表明水体盐度变化使实验鱼头肾中细胞排列的紧密程度、粒细胞结构发生了明显变化。２．３生物化学技术２。３．１双向电泳技术双向电泳（２－ＤＥ）是指利川蛋白质的带电性和分子鼍人小的筹异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。随着人类基冈组计划的完成，功能基冈纽时代和蛋白质组时代的剑米，双向电泳技术已经成为生物学研究的核心技术之一。近年来已有研究者将双向电泳技术圳于水产动物疾病研究中，如Ｈｕｌｔｏｎ等（２００２¨划根据对虾自斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）的基冈组分析出其含有的蛋白质等电点，并对其蛋白质进行分析，找山可能与疾病相关的蚩白质，这对该病的诊断以及疫苗研究具有重要意义。２．３．２Ｗｅｓｔｅｍ印迹Ｗｅｓｔｅｍ印迹义称免疫印迹或转移印迹技术，以凝胶电泳高效分离和同相免疫测定相结合而形成。它借助高分辩率的ＰＡＧＥ电泳将混合蚩白质样品有效允离成许多蛋自区带，分离后的蛋白经电泳转移至同相支持物上，通过与特异性抗体的结合，即可定性或定量检测靶蛋白，从而可直接观察到抗血清与特异性抗原的反应。张晓华等（１９９７）删利用此技术对１３株不同来源的副溶血弧菌的外膜蚩自及其抗原性进行了比较研究，发现它们有相似的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱，其中一条４４ｋＤａ的免疫反应带儿乎是所有副溶血弧菌菌株共有的，推测极有可能与副溶血弧菌抗原的特异性有关。２．３．３同：Ｉ：酶技术同一』：酶是生物机体中生理生化的天然标记，可反映机体内的各种变化。不同的疾病所导致的同１：酶表型及活性变化规律，彼此之间存在显著的差异，冈而作为一种研究水产动物疾病机制的：ｊ：具被Ｊ１．泛运朋。王金星等（１９９５）恻对中国对虾四种组织的蛋白质、酯酶、乳酸脱氢酶和超氧化物歧化酶等同：ｌ：酶进行了分析研究，并将健康虾与流行病病虾进行了比较，找出了它们之间的差异。江开毓等（２０００）∞”运用ＳＯＤ同．Ｉ：酶电泳酶谱分析鱼类应激性出血症病理，发现病鱼的过氧化物同，ｌ：酶酶谱出现条带的缺失、移位莆ｌ增加等异常现象。王永杰等（２００１）ｍ３运用ＳＬＤＨ同ｊ１．Ｉ酶谱型变化建立了草鱼出缸病的快速诊断方法。吴惠仙等（２００２）啪１研究发现酯酶、过氧化物酶、乳酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶等同ｊｌｒ：酶在日本沼虾中存在着组织和器官的特异性，患黑鳃病后酶带发生显著变化。薛俊增（２００２）岍’采刚乖直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对正常和患“抖抖病”的中华绒螫蟹儿种组织中的可溶性蛋白质及乳酸脱氢酶、酯酶和过氧化物酶等同工酶进行了比较分析，证明了同：．１：酶可以作为水产动物疾病检测与诊断的生理生化指标。２．３免疫组织化学技术免疫组织化学技术是利月ｊ免疫反应以定位组织中某类抗原成分分布的一门技术，借助于荧光素、酶、胶体金等标记抗体与组织切片中相关抗原相结合而特异的识别目标抗原，是一项特异、敏感和简便的技术。免疫荧光抗体和免疫酶标技术在水产动物疾病研究方法上的应用具有灵敏度高，特异性强，定位准确和应刚Ｊ’’泛等优点。２．３．１免疫荧光抗体技术免疫荧光抗体技术以荧光素为标记物，与已知抗体结合作为标准试剂，ｆｌｊ于检测未知抗原，可在荧光显微镜卜．早现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。这项技术将免疫反应的特异性、灵敏性与显微镜技术的精确性相结合，是现代标记免疫检测的重要方法之一·殷战等（１９９４）恻应ＨＪ此技术观察感染鲢鱼组织中的病原菌。夏春等（１９９８）Ⅲ’制作了６种兔抗中国淡水鱼主要病原菌的纯化抗体，州免疫荧光抗体法与各病原菌以及米源丁．水环境和鱼体分离菌发生反应，表明此法能用于检测中国鱼类病原菌的并发、继发和混合性感染。王军等（２００２）ｏ疗。建立了人黄鱼病原溶藻弧菌的免疫荧光抗体检测方法，圳．丁－已感染发病或已感染朱发病大黄鱼的快速检测。徐宋娟等（２００４）惮１应用免疫荧光抗体技术（ＩＦＡＴ）和标记１９６中团南方省（订了、区）渔、Ｉｋ学术论坛论文集链亲和ｆ素一生物索（ＬＳＡＢ）免瘦组化法对患淋巴囊肿病牙鲆的１０种组织进行了检测，发现体表有囊肿症状病鱼的胃、肠、鳃和表皮纽织内有淋巴囊肿病毒存在；体表术见囊肿症状病鱼的。胃、肠和表皮组织内也检Ｙ，ｌＪＮＴ病毒，说明此免疫技术可以应刚于牙鲆淋巴囊肿病的检测与诊断。２．３．２免疫酶标技术免疫酶标技术是利用抗原一抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，达剑在细胞或砸细胞水平上示踪抗原或抗体的部位。其中，酶联免疫吸附试验是免疫酶标技术中最具特异性、敏感性，结果易于检测等特点的一种，所以近米Ｊ“泛被川于水生动物疾病的诊断上。叶雪平等（１９８９）恻戍川此法检测出草鱼出血病病毒抗原。江育林等（１９９０）ｍ１用此法检测了虹鳟的传染性胰脏坏死病病毒。Ｓｎｏｗ（１９９９）ｎ¨等建立出血性败血症病毒（ＶＨＳＹ）的ＥＬＩＳＡ检测方法，刚米检测感染的人菱鲆。干军等（２００１）Ｈ引建立了网箱养殖人黄鱼病原菌－Ｎ溶血弧菌酶联免疫吸附法。杨鸢劬等（２００５）¨３１制备了鳗弧菌Ｂ＿ｌｌ菌株的兔抗血清，并应刚间接酶联免疫吸附法能检出１．５×１０—５个／ｍｌ浓度的Ｂ－１１菌株，对患病鱼体的组织培养物鳗弧菌进行检测，ｒ旱．现明显的Ｉ；ｌＩ性反应。２．４分子生物学技术分子生物学技术是在细胞生物学与分子生物学理论指导下发展起来的一种高新技术，其重要标志是分子克隆技术和细胞融合技术。分子生物学技术已成为指导生命科学发展的尖端技术之一，它也将是征服水生动物疾病，保证水产养殖动物健康、稳定、持续发展的支柱科学。２．４．１单克隆抗体技术单克隆抗体是一个抗体产生细胞与一个骨髓瘤细胞融合而产生的杂交瘤细胞，经无性繁殖而米的细胞群产生的。它与常规血清抗体相比，具有特异性强，亲和性一致，能识别单一抗原决定簇，且容易制备等特点。ｈｒｋｕｓｈ等（１９９２）Ｈ副制备７种斑点义尾鲴病毒ｃＡ８０—５株的单克隆抗体，采用中和试验及直接荧光抗体等方法，发现了ＣＡ８０一５株与其它儿株的抗原性筹别。黄健等（１９９５）¨副应川单克隆抗体酶联免疫技术检测对虾皮下及造血组织坏死病的病原及其传播途径。战文斌等（１９９９）Ⅲ１应用单克隆抗体的荧光抗体方法观察白斑病毒在日本对虾体内的感染增殖。王亮等（２００４）Ｈ列成功获１８株抗牙鲆淋巴囊肿病毒的单克隆抗体，并通过保持细胞系重复获得相同的抗体。而今，单克隆抗体技术已在水产动物病原体检测中得到了广泛应用，如应用于诊断海湾扇贝的鳃立克次体病、鱼类及牡蚜的淋巴细胞病毒病、鲑鳟红嘴病及疖疮病、鳗弧菌病、斑点义尾劁病毒病、嗜水气单胞菌败血症等。２．４．２ＰＣＲ技术，ＰＣＲ技术又称ＤＮＡ体外扩增技术，它是利用体外酶促合成特异ＤＮＡ片段的一种方法，由高温变性模板，引物与模板退火，引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的ＤＮＡ得以迅速扩增。它具有特异性强、敏感性高、重复性好、快速、简便、易自动化等特点。战文斌等（２０００）ｍ’采川ＰＣＲ技术对不同生长期的中国对虾进行了ＷＳＳＶ的检测。冯现维等（２００２）ｍ１采ＨＪＰＣＲ技术对鲤鱼的鳃、口腔黏膜，肌肉、心、肝、脾、肾、肠等组织进行了吉陶单极虫ＤＮＡ的检测。周化比等（２００２）唧’根据副溶血弧菌野生型菌株ＢＢ２２ＦｌａＩ基冈ｃＤＮＡ序列，通过合理的ＰＣＲ反麻，成功地合成ｉｌｊ编码极鞭毛蚩白的ＦｌａＩ基因全长片段，井将其克隆至ｐ～ｌＤｌ８一Ｔ载体质粒上，其序列分析和酶切鉴定显示ＦｌａＩ基冈得到了正确的合成和克隆。邱丽华等（２００４）倬¨采州同源克隆和锚定ＰＣＲ技术，从花鲈中克隆肿瘤坏夕ＥＩ灭ｌ子Ｑ（ＴｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒＱ，ＴＮＦＱ）的ｃＤＮＡ全序列，证实了花鲈ＴＮＦａ基闪存在组成型和诱导型两种表达调控机制，在抵御病原感染过程中发挥重要作用。邹慧斌等（２００５）嶂副通过ＥＳＴ和Ｉ锚定ＰｃＲ技术，从海湾扇贝中克隆得剑一种溶茵酶基冈的全。长ｃＤＮＡ，在其编码的氨基酸序列中发现了ｇ型溶菌酶的活性中心（Ｇｎ８２，Ａｓｐ９７，ｈｓｐｌ０８），同时６个保守的半胱氨酸，与１９７中阳南办行（市、Ｉ蔓）油业学术论坛论爻集脊椎动物ｇ型溶菌酶同源性较高反映了ｃ型、ｇ】弘溶荫酶从无脊椎剑脊椎动物的进化是平｛ｒ发生的，这对进一步研究溶菌酶及其分子进化具有重婴意义。２．４．３核酸原位杂交技术核酸原何杂交技术是在一定生物结构基础之上的核酸尔交，其可反应基闪杂交的准确部位，即可检测到特定基闪的准确位置。常青山等（２０００）怖３１以海捕中国对虾为材料，利川ＰＣＲ技术和核酸探针技术，对从中国对虾杆状病毒核酸随机文库中筛选的４个片段，ＪＩｊ地高辛标记作为探针，进行斑点杂交，检测对虾杆状病毒。Ｍａｒｔｈａ等（２００１）Ｂ”以患ＴＳ（ＴａｕｒａＳｙｎｄｒｏｍｅ）病毒的病虾上分离的ＴＳＶ的ｃＤＮＡ为探针进行原位杂交以检ｉ！《｜ＪＴＳＶ病毒的存在。２．４．４ＤＮＡ分子标记技术ＤＮＡ分子标记是以个体间遗传物质内核莳酸序列变异为基础的遗传标记，快速直接的观察和探究到整个基冈组的基冈变异。如今，其已被Ｊ’－泛应Ｊ－ｔＪ２Ｊ水生动物的基冈定位与克隆、物种鉴定及疾病诊断等领域中。２．４．４。ｌＲＦＬＰ标记ＲＦＬＰＨＰ限制性片段长度多态性，利刚特定的限制性内切酶切割不同个体的基冈组ＤＮＡ，得到Ｋ＝短、数营、种类不同的限制性ＤＮＡ片段，通过电泳和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，利用一定的ＤＮＡ标记探针与之杂交，放射白显影后就可得剑反映个体特异性的ＤＮＡ限制性片段多态性图谱。由丁动物线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）分子量小，结构简单，可直接酶切进行ＲＦＬＰ分析，冈此目前ＲＦＬＰ技术在水产动物疾病中的应川主要是对ｍｔＤＮＡ的分析。Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ等（１９９６）婚”在对水产上引起多种鱼病的双ＲＮＡ病毒进行基冈组筹异分析，对编码ＶＰ２蛋白的一段ｃＤＮＡ进行酶切、分析，为不同地区水产双ＲＮＡ病毒的分类提供了依据。Ｌｅｅ等（２００２）嶂副应用此技术检测一些鱼类致病菌在环境中的分布情况及其在不同时期的存活情况。Ｍａｒｉｎａ等（２００４）Ⅲ。利Ｈ｛ＲＦＬＰ结合血清学数据，显示不同地区鲑鱼致病菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｇａｒｖｉｅａｅ）菌问的遗传关系。２．４．４．２ＲＡＰＤ标记ＲＡＰＤ杖Ｐ随机扩增多态性ＤＮＡ，是州一系列不同的碱基顺序随机排列的寡核督酸单链作为引物，对所研究的基冈组ＤＮＡ进：ｆＴＰＣＲ扩增。扩增产物经凝胶电泳，溴化乙锭染色或放射白显影便可得剑许多不同的特征条带。如果基冈组在某些区域内发生ＤＮＡ片段插入、缺欠或碱基突变就可能导致这些特定结合位点的分布发生相应的变化。冈此，目前常借助ＲＡＰＤ分子标记技术进行水产动物的物种鉴定、亲缘关系确定以及系统发育研究。Ｂａｒｄａｒｋｃｉ等（１９９４）瞄引应刚ＲＡＰＤ技术扩增了罗非鱼属的３个种和尼罗罗１卜鱼的４个Ⅱ种的基闪宝ＨＤＮＡ。梁利群等（２００３）酬根据其获得的鲤抗寒性状分子标记及已构建的鲤遗传连锁图谱，结合计算机软件的分析功能，最终将５Ｎ１４５１Ｃ这一与鲤耐寒有关的分子标记定位剑鲤的遗传图谱上。２．４．４．３ＡＦＬＰ标记ＡＦＬＰ即扩增片段长度多态性，是ＲＦＬＰ希ＩＰＣＲ结合的产物。它将ＤＮＡ进行限制性酶切，再将特定的接头连接在酶切片段的两端，形成一个带接头的特异性片段并以此为模板，以接头序列和限制性内切酶的切点序列为基础设计引物，进行ＰＣＲ扩增。只有与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增，从而检测出要求基冈组ＤＮＡ的多态性。Ｎａｋａｍｗａ等（２００１）∞１应川ＡＦＬＰ技术构建了虮鳟向化病个体的遗传图谱，发现其中有４个标记与白化病基冈位点相关并紧密连锁。Ｔｈｏｍａｓ等（２００４）㈣３对抗鲑鱼贫血症的个体和染病夕Ｅ亡个体进行了基冈裂分析，得到了３４０个ＡＦＬＰ标记，这将有助于从分子水平诊断及防治鲑鱼贫血症提供有效途径。２．４．４．４微卫星标记技术微卫星标记技术是基丁－基冈组ＤＮＡ水平的差异进行检测，不受组织，器官种类、环境条件等｜灭Ｉ素影响，冈此可以方便的用．丁辅助育种、覆盖目标基闪的连锁遗传图谱的构建，通过基冈图谱可以详细了解控制那些有价值的抗病性状的位点组成利表达调控机制，以便ｒ操纵这些基因而有效的避免一些病害的爆发。Ｍａｒｉａ等（２００３）ｍ¨应用１１１个微甲星标记和３５２个１９８巾喇南方竹（市、区）渔业学术论坛论文集ＡＦＬＰ标记构建了Ｈ本比口鱼的第一个遗传连锁图谱，为奄找比Ｅ｜鱼病毒性表皮增生，病薛性神经坏夕匕和体色异常等疾痫致病基冈的位点有很人帮助。２．４．５１６Ｓ１６ＳｒＲＮＡ技术ｒＲＮＡ是核糖体ＲＮＡ的一种，具有分子量适中，所含的遗传信息丰富，在结构上分为保守区（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎ）平¨可变区（Ｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎ），保守区能反映生物物种的亲缘关系，可变区具有能揭示生物物种的特征核酸序列等特点，被认为是最适细菌系统发育和分类鉴定的指标。目前１６ＳｒＲＮＡ序列分析己Ｊ’‘泛ＪＨｊ丁．水产动物病原菌的鉴定。Ｒａｇｎｈｉｌｄ等（１９９５）㈣１通过对分离丁人两洋鲑鱼、虹鳟鱼、人菱鲆和鳕鱼中的致病弧菌的１６ＳｒＲＮＡ序列进行比对，对鱼类致病弧菌进行分类。Ｃａｒｌｏｓ等（１９９９）∽ｏ通过对２６株不同来源的鱼病菌的１６ＳｒＲＮＡ基冈序列的分析，确定了鱼出血性败血症病原美入鱼发光杆菌的分类地位，并建立了基于１６ＳｒＲＮＡ基冈的巢式ＰＣＲ病原检测方法。Ｃｅｒｄａ等（２００１）Ｍ”利川一种特异的１６ＳｒＲＮＡ基冈探针对Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ病毒进行检测。邹玉霞等（２００４）泐１通过对人菱鲆出血症病原菌的１６ＳｒＲＮＡ基冈进行系统发育学分析，确定了该病原菌为鳗弧菌。耿毅等（２００６）恻从发生急性流行性传染病的斑点义尾鲴肝、肾分离到一高致病性的菌株，经１６ＳｒＤＮＡ序列分析，鉴定其为嗜麦芽寡养单胞菌（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ２．４．６基闪芯片技术基冈芯片义称ＤＮＡ芯片，属于生物芯片中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，其基本原理是将人鼙寡核苷酸分子闹定丁支持物上，然后与标记的样晶进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样晶中靶分子的数萤，具有微砸化、集约化和标准化等特点。Ｓｔｅｐｈｅｎ等（２００３）№¨廊川人类ｃＤＮＡ微阵列对健康和感染Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ如病菌的人两洋鲑鱼肝脏内基冈表达的著异进行比较，发现４个位点的基冈表达住染病个体内有明显增加，证明了应川人类ｃＤＮＡ微阵列检测鲑鱼体内差异表达基冈的可行性。Ｓａｎｔｉａｇｏ等（２００４）㈣１对海鱼的５种重要的病原体进行检测，证实其对检测引起人和鱼类多种疾病的多重病原体是一种敏感性强、精确度高的实验手段。３结语水产动物病理技术已经过近半个世纪的发展，随着水产动物疾病研究广泛地与其它先进技术手段相结合，尤其与分子生物学技术的结合，为水产动物疾病的发展带米革命性的变化。快速准确的病原体检测手段，高效免疫疫苗的制备都在很人程度上缓解了病害所带来的严重损失。然而目前的高新技术主要应瑚予基础性研究，这些技术要真正的应用于生产，还有待于条件方法的优化以及仪器设备成本的降低。近儿年米，我国在水产动物疾病防治上取得了一定的进展，但在免疫防护、病害的预测和预报以及健康养殖模式上还有待于进一步深入研究。ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）。参考文献１．黄琪琰，郑德崇，蔡完其，等．草鱼细菌性烂鳃病的组织病理研究［Ｊ］．水产学报，１９８３，７（２）：９５－１０４．２．郑德崇，黄琪琰，１５蔡完其等．草鱼出血病的组织病理研究［Ｊ］．水产学报，１９８６，１０（２）：Ｉ一１５９．３．黄珙琰，郑德崇，刘丽燕，等．异育银鲫溶血性腹水病的组织显微病理研究［Ｊ］．水产学报，１９９ｌ，１５（３）：２１２－２１８．４．黄琪琰，范丽萍．草鱼疖疮病的组织病理研究［Ｊ］．水产科技情报，１９９１，１８（１）：５－７．５．李霞，干Ｊ＇．军．水产动物病理学研究方法的进展［Ｊ］．水产科技，２００２，５：５—８．５．黄琪琰，６．黄琪琰，郑德崇，金丽华．淡水鱼类细菌性败血症的组织亚显微病理及防治研究［Ｊ］．上海１９９中罔南万行（市、区）渔业学术论坛论文棠水产人学学报，１９９５，４（１）：２７－３４．７．郭琼林，卢全章．鳗鲡爱德华氏菌病的组织病理学研究［Ｊ］．水生生物学报，１９９５，１９（１）：５６—６０．８．陆宏达，金丽华．鳖嗜水气单胞菌败血．症的研究［Ｊ］．水产学报，１９９６，２０（３）：２２３—２３４．９．蔡完其，孙佩芳，刘至治．中华鳖爱德华氏菌病病原利组织病理研究［Ｊ］．水产学报，１９９７，２ｌ（４）：４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作者：作者单位：

汪开毓， 何敏， 李正军

汪开毓,何敏(四川农业大学水生动物疾病研究中心,雅安市 625014)， 李正军(四川省水产局 成都市,610072)

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