(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103849658 A(43)申请公布日 2014.06.11
(21)申请号 201410103412.8(22)申请日 2014.03.20
(71)申请人河南科技大学
地址471000 河南省洛阳市涧西区西苑路
48号(72)发明人纠敏 汪伦记 赵君峰 黄狮
李净净(74)专利代理机构洛阳公信知识产权事务所
(普通合伙) 41120
代理人罗民健(51)Int.Cl.
C12P 7/64(2006.01)C12R 1/645(2006.01)
权利要求书1页 说明书4页 附图1页权利要求书1页 说明书4页 附图1页
(54)发明名称
一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法(57)摘要
一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法,先制备微生物油脂，即以菊糖提取液为产脂培养基，皮状丝胞酵母为产油脂菌种，在一定培养条件下分批发酵培养，经干燥、提取获得微生物油脂，然后再制备生物柴油，即以微生物油脂为原料，在催化剂作用下，经微波加热，与甲醇进行转酯化反应制得生物柴油。本发明采用菊芋提取液进行发酵生产微生物油脂，既解决了采用菊粉生产油脂需添加酵母膏、蛋白胨和无机盐而导致油脂生产成本过高的缺点，显著降低了生物柴油生产的成本，又充分利用了菊芋资源，而且建立的微波加热制备生物柴油的生产工艺操作简便、环境友好、反应速度快，生物柴油产率高、易于控制，具有良好的工业化应用前景。CN 103849658 ACN 103849658 A
权 利 要 求 书
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1.一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）菊糖提取液的制备取鲜菊芋经切片，烘干粉碎后，过100目筛制得菊芋粉，称取一定量菊芋粉溶于蒸馏水中，料水重量比为1:9，经85 ℃水浴保温80min后，在离心机中以4000r/min的转速离心10min，除去沉淀，取上清液即为菊糖提取液，备用；
2）产脂培养基制备将步骤1）制备的菊糖提取液的pH值调节至4.6，向其中加入菊糖外切酶，酶的添加量为20U/g菊糖提取液，在55℃的条件下保温酶解8h，酶解后，调节其pH值为5.5，然后将酶解液在115℃的条件下灭菌30min即制得产脂培养基，备用；
3）皮状丝孢酵母油脂制备将步骤2）中制备好的产脂培养基中接入皮状丝孢酵母，接种量为10％，然后在温度为30℃、转速为200r/min的条件下培养96h后，以4000r/min的转速离心分离后得到富含油脂的皮状丝孢酵母菌体；
将得到的皮状丝孢酵母菌体于80℃干燥箱中烘至恒重，采用酸热法提取得到皮状丝孢酵母油脂，备用；
4）取一定量步骤3）中制备的皮状丝孢酵母油脂置于单口烧瓶中，在微波炉中微波辐射一定时间以除去水分，称取反应所需的氢氧化钠溶解于一定量的无水甲醇中，配制成催化剂甲醇溶液，所述的催化剂用量为皮状丝孢酵母油脂质量的1%，醇油摩尔比为6:1，将配制好的催化剂甲醇溶液倒入烧瓶内，然后将烧瓶放入微波炉进行加热，所述的微波功率为400W，加热时间为1.0～3.0min，搅拌进行反应，待反应结束后，加入1mol/L的盐酸中和催化剂使反应终止；
将反应后的混合物置于分液漏斗中，静置分层，上层为生物柴油与甲醇的混合物，下层为甘油相，取上层相在常压下进行70℃蒸馏，使甲醇分离，将蒸馏后的酯相置于分液漏斗中，从分液漏斗上方倒入50℃的蒸馏水，以洗去少量的皂和其他可溶物，然后再置于微波炉中，用400W功率加热5min后取出静置10min，重复上述蒸馏分离甲醇、水洗和加热操作两次，最后再用质量分数10%的无水硫酸钠除去残余水分，即得到透明、浅黄色的生物柴油。
2.根据权利要求1所述的一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法，其特征在于：所述步骤3）中的酸提法的具体操作为：按照每克烘干后的菌体加入4mol/L盐酸溶液10mL的比例加入盐酸溶液，利用振荡器振荡1-2min混合均匀，然后在室温下放置30min，再沸水中水浴加热3min后立即放置在-20℃的低温下使其迅速冷却，冷却后按体积比1∶1 的比例向其中加入甲醇、氯仿提取液，充分混合后离心分层，收集氯仿层，再加入等量的氯仿，重复离心分层操作，将提取液中的氯仿回收，得到微生物油脂。
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CN 103849658 A
说 明 书
一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法
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技术领域
本发明涉及生物能源和生物催化技术领域，具体的说是一种利用皮状丝孢酵母制
备生物柴油的方法。
[0001]
背景技术
化石能源支撑了19世纪到20世纪近200年来人类文明的进步和经济社会发展。
然而，化石能源的不可再生性和人类对其的巨大消耗，使化石能源正在逐渐走向枯竭，同时，由于大量的化石能源消费，也造成严重的环境污染。因此，世界各国都在寻求以可再生、清洁的能源替代化石能源。其中生物柴油被公认为是可替代化石燃料的绿色能源。[0003] 生物柴油指的是动、植物或微生物油脂经酯化反应后得到的长链脂肪酸烷基单酯。由于具有清洁、可再生、对环境友好的特性，生物柴油已日益受到欧美及亚洲一些能耗大国的重视，并获得了长足的发展。在生物柴油的生产中，原料成本占生产成本的75％以上，是制约生物柴油工业化生产的主要因素。美国主要采用豆油，欧洲采用菜籽油，印度尼西亚和日本分别采用棕榈油和废油生产生物柴油。但我国人口众多，耕地资源匮乏，若直接利用菜籽油或豆油等食用油脂生产生物柴油，由于原料和经济原因，不具备经济性。[0004] 微生物油脂发酵技术是生物柴油生产的一个研究发展方向。微生物油脂的脂肪酸组成与植物油相近，以C16和C18系脂肪酸为主。微生物发酵产油具有发酵周期短，可连续生产等优点；而且产油微生物菌种资源丰富，能利用和转化各种农林废弃木质纤维素原料，对中国这样一个农业占较大比重的国家具有特殊意义。目前，对培养产油微生物碳源的研究主要集中在葡萄糖基原料、淀粉质原料和纤维素原料。淀粉质原料主要指玉米、大米、小麦、土豆和甘薯等粮食作物。以淀粉质为原料生产生物柴油需先对淀粉进行高温蒸煮和酶解糖化后制得淀粉糖，然后利用油脂微生物对所得的淀粉糖进行发酵生产油脂，提取制备生物柴油。目前，在对淀粉质原料的利用过程中，添加淀粉酶或产淀粉酶的微生物对其进行预先的糖化处理是必要的步骤，这在实际生产中增加了生产成本，并且也会增加染菌机会。
[0002]
发明内容
[0005] 为解决现有技术中需要进行预先糖化处理导致的生产成本和感染杂菌的几率增加的问题，本发明提供了一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法，该方法选择菊芋作为油脂生产的碳源，不再需要将原料进行糖化就可对其直接利用，实现了对原料的一步发酵。
[0006] 本发明为解决上述技术问题采用的技术方案为：一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法，包括以下步骤：
1）菊糖提取液的制备取鲜菊芋经切片，烘干粉碎后，过100目筛制得菊芋粉，称取一定量菊芋粉溶于蒸馏水中，料水重量比为1:9，经85 ℃水浴保温80min后，在离心机中以4000r/min的转速离心10min，除去沉淀，取上清液即为菊糖提取液，备用；
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说 明 书
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2）产脂培养基制备将步骤1）制备的菊糖提取液的pH值调节至4.6，向其中加入菊糖外切酶，酶的添加量为20U/g菊糖提取液，在55℃的条件下保温酶解8h，酶解后，调节其pH值为5.5，然后将酶解液在115℃的条件下灭菌30min即制得产脂培养基，备用；
3）皮状丝孢酵母油脂制备将步骤2）中制备好的产脂培养基中接入皮状丝孢酵母，接种量为10％，然后在温度为30℃、转速为200r/min的条件下培养96h后，以4000r/min的转速离心分离后得到富含油脂的皮状丝孢酵母菌体；
将得到的皮状丝孢酵母菌体于80℃干燥箱中烘至恒重，采用酸热法提取得到皮状丝孢酵母油脂，备用；
4）取一定量步骤3）中制备的皮状丝孢酵母油脂置于单口烧瓶中，在微波炉中微波辐射一定时间以除去水分，称取反应所需的氢氧化钠溶解于一定量的无水甲醇中，配制成催化剂甲醇溶液，所述的催化剂用量为皮状丝孢酵母油脂质量的1%，醇油摩尔比为6:1，将配制好的催化剂甲醇溶液倒入烧瓶内，然后将烧瓶放入微波炉进行加热，所述的微波功率为400W，加热时间为1.0～3.0min，搅拌进行反应，待反应结束后，加入1mol/L的盐酸中和催化剂使反应终止；
将反应后的混合物置于分液漏斗中，静置分层，上层为生物柴油与甲醇的混合物，下层为甘油相，取上层相在常压下进行70℃蒸馏，使甲醇分离，将蒸馏后的酯相置于分液漏斗中，从分液漏斗上方倒入50℃的蒸馏水，以洗去少量的皂和其他可溶物，然后再置于微波炉中，用400W功率加热5min后取出静置10min，重复上述蒸馏分离甲醇、水洗和加热操作两次，最后再用质量分数10%的无水硫酸钠除去残余水分，即得到透明、浅黄色的生物柴油。[0007] 所述步骤3）中的酸提法的具体操作为：按照每克烘干后的菌体加入4mol/L盐酸溶液10mL的比例加入盐酸溶液，利用振荡器振荡1～2min混合均匀，然后在室温下放置30min，再沸水中水浴加热3min后立即放置在-20℃的低温下使其迅速冷却，冷却后按体积比1:1 的比例向其中加入甲醇、氯仿提取液，充分混合后离心分层，收集氯仿层，再加入等量的氯仿，重复离心分层操作，将提取液中的氯仿回收，得到微生物油脂。[0008] 本发明中，所述的菊芋购自于洛阳；菊粉酶为常规的水解酶，可由产菊粉酶的微生物发酵制得；皮状丝孢酵母为常规菌种，在微生物保藏中心可取得。[0009] 本发明中，所述催化剂还有用碱、酸、固体碱、固体酸或生物脂肪酶进行转酯化反应制备生物柴油，此时所选取的反应条件、温度和时间对于不同的催化剂有不同的参数范围。
[0010] 有益效果：本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1）对菊芋块茎含有的不同营养成分进行了充分利用，菊糖提取液不仅含有菊糖，还含有蛋白质、氨基酸、无机盐等成分，本发明克服了只采用菊粉对菊芋块茎中除菊糖外其他营养成分利用不完全的缺点；
菊芋与菊粉和其他生2）降低了微生物油脂生产的原料成本和生物柴油的生产成本，
产生物柴油的原料相比，如淀粉质原料、餐饮废油等，具有产量高、价格低廉、易于水解等优点；
3）建立的碱催化微波加热微生物油脂制备生物柴油的工艺操作简便、环境友好、反应
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说 明 书
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速度快、收率高、易于控制，克服传统的水浴加热升温速度慢、加热不均匀、反应时间长等缺点。
附图说明
[0011] 图1为本发明实施例中不同微波加热时间的生物柴油得率表。
具体实施方式
[0012] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。[0013] 实施例1
一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法，包括以下步骤：1）菊糖提取液的制备：称取5kg鲜菊芋，清水洗净，经切片机切片，铺于室外晾晒至干燥，再放入烘箱中，65℃烘干至含水量在5%以下，经粉碎机粉碎后，过100目筛制得约1.3kg菊芋粉。称取100g菊芋粉溶于900mL蒸馏水中，置于恒温水浴锅中，经85 ℃水浴保温80min后，4000r/min离心10min，除去沉淀，取上清液即为菊糖提取液；
2）产脂培养基制备：对步骤1）中制备好的菊糖提取液进行酶解。酶解条件：采用1mmol/LHCl调菊糖提取液pH值至4.6，加入酶活单位为500U/mL的菊糖外切酶酶液3mL，搅拌均匀，55℃保温酶解8h。酶解后，酶解液用0.1mol/LHCl或NaOH调pH值至5.5，分装于500mL三角瓶中，装液量为200mL /500mL三角瓶，放入高压灭菌锅中，115℃灭菌30min备用；
3）皮状丝孢酵母油脂制备：对步骤2）中制备好的菊糖提取液产脂培养基中接入皮状丝孢酵母，接种量10％，在温度为30℃、转速为200r/min下培养96h后，进行4000r/min离心、分离，得到富含油脂的皮状丝孢酵母菌体；将得到的皮状丝孢酵母湿菌体于80℃干燥箱中烘至恒重。采用酸热法提取油脂，操作条件为：每克干菌体加入4mol/L盐酸溶液10mL，利用振荡器振荡大约1-2min使其混匀，在室温下放置约30min，然后再沸水中加热3min，立即放置在-20℃的低温下使其迅速冷却。冷却后加入按体积比1∶1 加入甲醇、氯仿提取液，充分混合后离心分层，收集氯仿层，再加入等量的氯仿，重复前述操作，将提取液中的氯仿回收，得到微生物油脂；
4）生物柴油制备取5g步骤3）中制备的皮状丝孢酵母油脂置于单口烧瓶中，在微波炉中微波辐射一定时间以除去水分。称取反应所需的0.05gNaOH溶解于30g无水甲醇中，配制成催化剂甲醇溶液。将配制好的催化剂甲醇溶液倒入烧瓶内，然后将烧瓶放入微波炉进行加热，所述的微波功率为400W，加热时间为1.0min，搅拌进行反应。待反应结束后，加入1mol/L的盐酸中和催化剂而使反应终止；
将反应混合物置于分液漏斗中，静置分层，上层为生物柴油与甲醇的混合物，下层为甘油相。取上层酯相在常压下进行甲醇蒸馏，控制蒸馏温度在70℃，使甲醇与酯相分离。将蒸馏后的酯相置于分液漏斗中，从分液漏斗上方缓缓倒入50℃的蒸馏水，以洗去少量的皂和其他可溶物，再置于微波炉中，用低档火力（400W）破乳5min后取出静置10min。重复两次，最后用质量分数10%的无水硫酸钠除去残余水分，得到透明、浅黄色的生物柴油。
实施例2
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说 明 书
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一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法，包括以下步骤：1）菊糖提取液的制备，与实施列1相同；2）产脂培养基制备，与实施列1相同；3）皮状丝孢酵母油脂制备，与实施列1相同；4）生物柴油制备
取5g步骤3）中制备的皮状丝孢酵母油脂置于单口烧瓶中，在微波炉中微波辐射一定时间以除去水分。称取反应所需的0.05gNaOH溶解于30g无水甲醇中，配制成催化剂甲醇溶液。将配制好的催化剂甲醇溶液倒入烧瓶内，然后将烧瓶放入微波炉进行加热，所述的微波功率为400W，加热时间为2.0min，搅拌进行反应。待反应结束后，加入1mol/L的盐酸中和催化剂而使反应终止；
将反应混合物置于分液漏斗中，静置分层，上层为生物柴油与甲醇的混合物，下层为甘油相。取上层酯相在常压下进行甲醇蒸馏，控制蒸馏温度在70℃，使甲醇与酯相分离。将蒸馏后的酯相置于分液漏斗中，从分液漏斗上方缓缓倒入50℃的蒸馏水，以洗去少量的皂和其他可溶物，再置于微波炉中，用低档火力（400W）破乳5min后取出静置10min。重复两次，最后用质量分数10%的无水硫酸钠除去残余水分，得到透明、浅黄色的生物柴油。
实施例3
一种利用皮状丝孢酵母制备生物柴油的方法，包括以下步骤：1）菊糖提取液的制备，与实施列1相同；2）产脂培养基制备，与实施列1相同；3）皮状丝孢酵母油脂制备，与实施列1相同；4）生物柴油制备取5g步骤3）中制备的皮状丝孢酵母油脂置于单口烧瓶中，在微波炉中微波辐射一定时间以除去水分。称取反应所需的0.05gNaOH溶解于30g无水甲醇中，配制成催化剂甲醇溶液。将配制好的催化剂甲醇溶液倒入烧瓶内，然后将烧瓶放入微波炉进行加热，所述的微波功率为400W，加热时间为3.0min，搅拌进行反应。待反应结束后，加入1mol/L的盐酸中和催化剂而使反应终止。
[0014] 将反应混合物置于分液漏斗中，静置分层，上层为生物柴油与甲醇的混合物，下层为甘油相。取上层酯相在常压下进行甲醇蒸馏，控制蒸馏温度在70℃，使甲醇与酯相分离。将蒸馏后的酯相置于分液漏斗中，从分液漏斗上方缓缓倒入50℃的蒸馏水，以洗去少量的皂和其他可溶物，再置于微波炉中，用低档火力（400W）破乳5min后取出静置10min。重复两次，最后用质量分数10%的无水硫酸钠除去残余水分，得到透明、浅黄色的生物柴油。
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说 明 书 附 图
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