(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104140937 A(43)申请公布日 2014.11.12
(21)申请号 201410225304.8(22)申请日 2014.05.24(83)生物保藏信息
CGMCC No.9066 2014.04.16
(71)申请人东北农业大学
地址150000 黑龙江省哈尔滨市香坊区公滨
路木材街59号(72)发明人孟祥晨 彭悦 朱文婕 李艾黎(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)A61K 35/74(2006.01)A61P 31/04(2006.01)A61P 1/02(2006.01)C12R 1/25(2006.01)
(54)发明名称
植物乳杆菌KLDS1001及其在抑制口腔变异链球菌中的用途(57)摘要
植物乳杆菌KLDS1001及其在抑制口腔变异链球菌中的用途，属于微生物技术领域。本发明提供的植物乳杆菌KLDS1001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.9066，保藏日期为2014年04月16日，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其对口腔变异链球菌具有抑制作用，可以作为口腔保健品，如：口香糖，保健药品的一种添加成分，用于口腔保健；可以作为口腔清洁产品的成分之一，添加到牙膏、漱口水当中，用于口腔清洁和减少口腔中变异链球菌的数量；开发益生菌疗法用于预防和治疗龋齿等口腔疾病。
权利要求书1页 说明书8页 附图2页权利要求书1页 说明书8页 附图2页
CN 104140937 A CN 104140937 A
权 利 要 求 书
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1.植物乳杆菌KLDS1001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.9066。
2.如权利要求1所述植物乳杆菌KLDS1001在抑制口腔变异链球菌中的用途。
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植物乳杆菌KLDS1001及其在抑制口腔变异链球菌中的用
途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株具有潜在口腔益生功能的植物乳杆菌
(Lactobacillus plantarum)及其应用。
[0001]
背景技术
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)Y29对口腔变异链球菌具有一定的抑制
作用；对口腔内溶菌酶和过氧化氢具有一定的耐受性，能够适应口腔环境。但是，没有关于菌株的产酸能力和致龋能力的相关分析，菌株能够产生胞外多糖，具有一定的齿表面粘附能力，是潜在的致龋菌。
[0003] 植物乳杆菌HO-69具有较弱的齿表面粘附能力，对口腔粘膜的粘附能力较强，非酸抑菌物质对变异链球菌具有抑菌作用并具有广谱的抑菌效果。但是，缺少对于菌株应用安全性的评价，没有对抗药性，引起粘膜感染的特性进行研究。
[0002]
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一株对口腔变异链球菌具有抑制作用的植物乳杆菌KLDS1001及其应用。
[0005] 本发明提供的植物乳杆菌KLDS1001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9066，保藏日期为2014年04月16日，菌种的分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。KLDS1001为革兰氏阳性短杆菌，成对或成链状排列。于MRS平板培养后，菌落呈白色，圆形，枕状光滑，边缘整齐。其菌体和菌落形态特征如图1-3所示。
[0006] 本发明提供的植物乳杆菌KLDS1001对变异链球菌的抑菌圈直径为19.47±0.50mm，与国内和国际上的研究相比抑菌活性较好。通过测定植物乳杆菌KLDS1001对变异链球菌在玻璃试管表面形成菌膜的影响，比较直观的发现，菌株可以有效的降低变异链球菌在菌膜当中的数量。从以上体外实验的结果来看，菌株能够有效的抑制变异链球菌的生长并减少口腔菌斑中变异链球菌的数量。与传统益生菌株LGG相比，本发明提供的植物乳杆菌KLDS1001抑菌能力较强，抑制变异链球菌菌膜形成的能力相近。
[0007] 本发明提供的植物乳杆菌KLDS1001能够在pH为3-5的条件下保持良好的生长状态，在pH为2的条件下培养1h后保持4.79±0.49logcfu的活菌数，说明菌株能够较好的适应由于进食引起的口腔内pH的变化；菌株在过氧化氢浓度为1mM/L的条件下生长良好，在5mM/L的条件下培养6h后，存活的菌数为3.29±0.07logcfu对口腔内和口腔清洁用品中的过氧化氢具有较强的耐受性，能够较好的适应口腔环境。
[0008]
作为新的口腔益生菌，乳酸菌在应用的过程中可能具有以下危害：(1)由于具有较强的产酸能力而具有一定的致病性；(2)可能携带耐药性基因，存在耐药性基因水平转
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移的危害；(3)可能引起口腔粘膜的感染。植物乳杆菌KLDS1001培养72h分解羟磷灰石产生钙的量为0.29±0.02μg/mL，仅具有轻微的降解能力，此降解量与传统益生菌LGG相似(0.27±0.01μg/mL)，说明菌株分解牙釉质导致龋齿的能力弱。菌株不具有溶血性，不能引起口腔内粘膜的感染。菌株对万古霉素、克林霉素和链霉素具有耐药性。[0009] 本发明提供的植物乳杆菌KLDS1001可以作为口腔保健品，如：口香糖，保健药品的一种添加成分，用于口腔保健；可以作为口腔清洁产品的成分之一，添加到牙膏、漱口水当中，用于口腔清洁和减少口腔中变异链球菌的数量；开发益生菌疗法用于预防和治疗龋齿等口腔疾病。
[0010] 保藏信息：[0011] 保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；[0012] 保藏单位简称：CGMCC；[0013] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所；[0014] 保藏日期：2014年04月16日；[0015] 保藏编号：CGMCC No.9066。附图说明
图1为KLDS1001菌落形态；
[0017] 图2为KLDS1001菌落于高倍显微镜下观察形态；[0018] 图3为KLDS1001革兰氏染色后菌体形态；
[0019] 图4为菌株KLDS1001与LGG对变异链球菌菌膜形成的影响，菌株KLDS1001与LGG能够有效的抑制变异链球菌菌膜形成，并且筛选菌株和益生菌LGG具有相似的抑菌能力；
[0016]
图5为菌株KLDS1001、LGG和变异链球菌对羟磷灰石的降解能力，菌株KLDS1001与LGG均具有较弱的羟磷灰石降解能力；
[0021] 图6为不同pH对菌株KLDS1001生长的影响；
[0022] 图7为不同浓度的过氧化氢对菌株KLDS1001生长的影响，菌株KLDS1.0659在低pH与过氧化氢存在的条件下培养一段时间，均能保持一定存活菌数，对环境的抵抗能力较强。
[0020]
具体实施方式
[0023] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0024] 本发明提供的植物乳杆菌KLDS1001是从新疆酸乳中分离得到的，其分离方法如下：取一定量新疆自然发酵的酸奶样品，在脱脂乳培养基中进行富集，划线于MRS平板(pH6.5)中，37℃培养24h，挑取圆形，白色乳白色的特征菌落进行革兰氏染色，挑取革兰氏阳性杆菌的菌体进行分纯。纯化后的菌株进行吲哚试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、产硫化氢试验，将试验均为阴性反应的菌株初步鉴定为乳杆菌属。然后采用糖发酵实验和16s rDNA的方法对菌株进行种水平的鉴定。
[0025] 本发明中的植物乳杆菌KLDS1001的生理生化鉴定结果见表1：
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硝酸盐还原实验产硫化氢实验吲哚实验
[0028]
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表1
明胶液化过氧化氢酶实验
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本发明提供的植物乳杆菌KLDS1001糖醇发酵实验结果见表2：[0029] 表2
[0030]
名称甘露糖果糖乳糖半乳糖纤维二塘麦芽糖海藻糖水杨苷葡萄糖苦杏仁苷阿拉伯糖
KLDS1001++++++++++-名称蔗糖蜜二糖D-核糖木糖甘露醇山梨醇棉子糖松三糖
KLDS1001+++-+-+-
葡糖糖酸盐+七叶苷L-鼠李糖
++
植物乳杆菌KLDS1001的16s rDNA测序鉴定结果如下：
[0032] GGGGCAGGGCGGCAGCTATAATGCAGTCGACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAAT
[0031]
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GCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTTAAGT。
[0033] 综合目前对于口腔益生菌株的评估方法，本发明从菌株的抑菌活性、口腔环境的适应能力、应用安全性三个方面，对菌株进行全面的评价，其中主要包括：采用牛津杯法测定菌株对致龋菌变异链球菌的抑菌活性；目前国内通常采用研究益生菌株和变异链球菌的共聚效果来推测菌株对变异链球菌菌膜形成能力的影响，在这方面的研究相对较少。采用玻璃表面作为体外模型，测定菌株对变异链球菌菌膜形成的影响；测定不同浓度的过氧化氢和pH对菌株口腔内不良环境的抵抗能力；采用测定菌株羟磷灰石降解能力，评价致龋能力；测定菌株对于主要抗生素的耐药性和溶血性，测定菌株是否存在抗药性水平转移的危害和引起粘膜感染的危害。并将菌株的抑菌效果与传统的益生菌LGG对比，比较菌株抑菌效果的优劣，其结果如图4-7所示。
[0034] (1)牛津杯法检测菌株的抑菌活性
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[0035] 将浓度为1×10cfu/mL的菌液以2％的接种量接入20mL MRS液体培养基中，37℃培养24h，使菌株达到稳定生长期。于12000r，4℃的条件下离心10min，用无菌试管收集上清液。用0.22μm滤膜进行过滤，除去菌体及其它杂质。将制备完成的上清液收集于2.0mL EP管中，放入4℃冰箱中备用。
[0036] 将20mL含有2％琼脂的BHI培养基倾倒于无菌平板中，自然晾干。取0.5mL变异链球菌菌液(1×108cfu/mL)，均匀涂布于BHI平板中，在无菌操作台中静置2-3h。在平板中心位置取三点，用镊子轻轻放置3个灭菌后牛津杯(牛津杯直径：6.00mm)。吸取200uL制备好的上清液缓慢加入到牛津杯中，然后将平板平稳移动到37℃培养箱中，培养18h。用镊子取出牛津杯，用游标卡尺测量抑菌圈直径。[0037] 结果显示，植物乳杆菌KLDS1001的抑菌圈直径为19.47±0.50mm显著高于鼠李糖乳杆菌LGG的抑菌圈直径为17.11±0.26mm，具有较好的抑菌效果。[0038] (2)菌株对变异链球菌菌膜形成的影响
[0039] 取5mL小试管中加入2.5mL MRS培养基与2.5mLBHI液体培养基混合后，加入5％的蔗糖，于121℃，15min灭菌。配制2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，用0.22μm的滤膜进行过滤，除去菌体及杂质。实验时，于无菌操作台中，向培养基中加入0.5％的MES缓冲液。将变异链球菌(1×109cfu/mL)以2％的接种量接入到试验用的培养基中，于37℃摇床培养12h后，接入等量的植物乳杆菌，在相同条件下继续培养12h。取出培养物，倾倒出液体培养基，加入5mL PBS缓冲液，轻微震荡，除去未稳定粘附的菌体。洗涤3次后，加入5mLPBS缓冲液，将试管置于超声清洗仪中超声处理30min，使菌体均匀分散于缓冲液中。梯度稀释后，涂布于BHI固体培养基中，37℃培养48h，根据变异链球菌与乳杆菌菌落特征的差异，分别对平皿中乳杆菌与变异链球菌进行菌落计数。[0041] 结果显示，变异链球菌单独培养24h形成的菌膜中变异链球菌的数量为8.49±0.05longcfu，与乳杆菌KLDS1001和LGG共培养后，菌膜中变异链球菌的数量分别下
[0040]
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降至7.72±0.11和7.66±0.09logcfu。由此可知，菌株KLDS1001能够有效抑制菌膜中变异链球菌的数量，并且具有与益生菌LGG相似的抑制效果。
[0042] 与变异链球菌共培养时能够在菌膜当中能够检测到植物乳杆菌KLDS1001的数量为7.21±0.08logcfu。由此可知，植物乳杆菌KLDS1001能够在齿表面生物膜中保持一定数量。
[0043] (3)羟磷灰石降解能力的测定
[0044] 称取分析纯CaCO3粉末2g于称量瓶中，105℃烘干4h后，取出称量瓶，置于干燥器中冷却至室温。称取0.10g烘干后的CaCO3，加入0.5N HC1使其完全溶解，加蒸馏水至100mL定容，配制成浓度为400μg/mL的钙贮备液。将钙贮备液配制成浓度为10μg/mL的钙工作液。
[0045] 取6支10mL试管，按照表3所示的剂量加入钙工作液与蒸馏水，每支试管加入5mL邻甲酚酞显色剂，震荡混匀，于570nm波长条件下测定吸光值。加入显色剂后，于15min内进行比色，按照钙的浓度与所得到的OD值绘制标准曲线。[0046] 表3所需试剂加入量
[0047]
试管编号
1
20.20.8
30.40.6
40.60.4
50.80.2
61.00
Ca工作液(mL)0蒸馏水(mL)
[0048]
1.0
取100μL植物乳杆菌菌液(1×108cfu/mL)，接入含有0.10g羟磷灰石粉末的4mL
BHI(pH7.0±0.2)液体培养基中。置于37℃条件下分别培养0，3，6，9，12，18，24，36，48，72h，取出试管，于12000r条件下离心10min，收集上清液。取1mL上清液加入洁净的试管当中，加入5mL邻甲酚酞显色剂，于570nm波长条件下进行比色，测定其OD值，根据钙标准曲线，计算乳杆菌培养过程中钙释放量。[0049] 测定结果显示，植物乳杆菌KLDS1001对羟磷灰石具有轻微的降解能力。随着培养时间的增加，羟磷灰石的降解量不断增加，培养9h后降解量趋于平衡。培养72h后，产生钙的量为0.34±0.01μg/mL。培养72h后，变异链球菌与LGG降解羟磷灰石产生钙的量分别为0.70±0.01μg/mL和0.27±0.01μg/mL。因此，菌株KLDS1001与LGG具有相似的降解能力，并远远小于变异链球菌的降解能力。[0050] (4)低pH对菌株生长状态的影响
[0051] 将植物乳杆菌以2％的接种量接入MRS液体培养基中，37℃培养20h，使其达到稳定生长期。于6000r的条件下离心10min，用并pH7.2的PBS缓冲液洗涤三次后，将菌体重悬于PBS缓冲液中，并用PBS缓冲液将菌液浓度调整至108cfu/mL。取1mL该菌液加入到9mL pH分别为2.0、3.0、4.0与5.0的MRS液体培养基中，于37℃条件下，分别培养15、30、45、60min，计算存活的菌数。[0052] 结果显示，植物乳杆菌KLDS1001在pH为3-5的条件下能够良好生长，在pH为2的条件下培养60min后，存活的菌数由7.16±0.14logcfu下降至4.79±0.49logcfu。说明菌株在低pH值的条件下仍能保持一定数量的存活菌数。
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(5)过氧化氢对菌株生长状态的影响
[0054] 将植物乳杆菌以2％的接种量接入MRS液体培养基中，37℃培养20h，使其达到稳定生长期。将培养物于6000rmp的条件下离心10min，用并pH7.2的PBS缓冲液洗涤三次后，将菌体重悬于PBS缓冲液中，并用PBS缓冲液将菌液浓度调整至1×108cfu/mL。用移液枪吸取1mL该菌液加入到9mL MRS液体培养基中，使最终过氧化氢浓度分别为1.0、2.5、5.0mM/L。于37℃条件下，培养2、4、6h，计算存活的菌数。[0055] 结果显示，植物乳杆菌KLDS1001在过氧化氢浓度为1mM/L的条件下生长良好，在5mM/L的条件下培养6h后，存活的菌数为3.29±0.07logcfu对口腔内和口腔清洁用品中的过氧化氢具有较强的耐受性，能够较好的适应口腔环境。[0056] (6)抗生素敏感性的测定[0057] 将氨苄青霉素、万古霉素、四环素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、庆大霉素、克林霉素、链霉素在其适当的溶剂中配制成浓度为10280μg/mL的贮存液。[0058] 采用常量肉汤稀释法进行抗生素敏感性的测定，取13支试管，第一支加入3.6mL MRS培养基，其余加入2mL培养基，依次编号。吸取0.4mL抗生素溶液加入到第一支试管中，震荡数秒混匀之后，析出2mL加入到下一支试管中，震荡混匀，依次进行此操作。将植物乳杆菌的液体培养物调整菌液浓度约为1×107cfu/mL，吸取2mL该菌液分别加入上述试管当中，于37℃条件下培养8h，于波长为600nm条件下测定OD值。[0059] 测定结果显示，植物乳杆菌KLDS1001对万古霉素、克林霉素和链霉素耐药，对其他几种抗生素敏感(表4)。[0060] 表4：KLDS1001的抗生素敏感性
[0061]
(7)溶血性测定
[0063] 挑取菌株单个菌落穿刺接种于含血的琼脂平板内，造成无氧环境，37℃培养48h，使实验菌株在平板内生长和反应。取出平板，在显微镜下放大60倍进行观察。穿刺物琼脂周围出现透明圈的为α溶血，表示完全溶解红细胞；β溶血表示部分溶解红细胞；培养物周围琼脂无溶血圈出现为γ溶血，表示不溶血。[0064] 测定结果显示，植物乳杆菌KLDS1001为γ溶血，即不具有溶血性。对照菌株化脓链球菌溶血圈边界较为清晰为α溶血。
[0062] [0065]
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说 明 书 附 图
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图2图4
图5
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说 明 书 附 图
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