免疫荧光步骤

一． 细胞免疫荧光步骤：

二． 1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

三． 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

四． 2. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

五． 3. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。

六． 4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

七． 5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

八． 6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。

九． 7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

十． 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，盖上盖玻片，显微镜下拍照。

二． 大鼠颈动脉组织做免疫荧光。具体步骤是：

1.生理盐水心脏灌注清洗。取颈动脉，预冷的4%甲醛固定过夜后，30%蔗糖PBS沉

底。

2.OCT包埋，放-20°c，短期内冰冻切片6um，-80°c保存

3.取出切片立即0.01M PBS洗5min x 3次（下同)

5.0.2%PBST (Triton X－100)室温通透8min，PBS洗3次

6.5%正常驴血清+0.02%PBST室温封闭30min(二抗是驴来源)

7.吸掉血清，直接加一抗0.02%PBST液(1:500)，4°c过夜

8.室温复温15min，PBS洗

9.加二抗，37°c恒温箱孵育50min

10.直接加DAPI孵育10min

11.摇床PBS洗10min x 3次

12.甘油封片，共聚焦拍照。