猪瘟巢式RT—PCR监测方法的建立

验研究　猪瘟巢式ＲＴ　ＰＣＲ　监测方法的建立　杨若松　，寇晓晶　，李敬　，张俊　，贺忠海　（１．河北省张家口市动物疫病预防控制中心政府，张家口０７５０００；　２．甘肃省动物疫病预防控制中心。兰州７３００００）　ＤＯｌ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１－６０２７．２０１３．１２．０１２　猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，由于本病死　亡率高，对养猪业的危害极大，是现今严重危害养猪业的主　要传染病之一。本研究根据ＧｅｎＢａｎｋ收录的ＣＳＦＶ猪瘟野毒　株全基因序列ＪＬ１（ＥＵ４９７４１０）为参照，建立猪瘟病毒ＰＣＲ　监测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和可重复性。　１样品和试剂　阳性结果为获得了５４６　ｌｉｔ的特异性目的条带。其结果如图　所示：　图ＰＣＲ检测猪瘟病毒结果　本实验的样品来自河北省疑似患有猪瘟的猪场，主要试　剂包括ＴＲＩｚ０１．Ｉ．Ｓ　Ｒｅｇｅｎｔ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ｐＧＥＭ—Ｔ　Ｅａｓｙ　购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＡＭＶ反转录酶、Ｒｎａｓｅ—Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｒＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓＭｉｘ、ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ　２　０００等均购自宝生物（大连）工程有限公司。　２监测引物的设计　２０００　１０００　７６０　６００　２６０　１Ｏ０　本研究在猪瘟病毒全基因３４４０～４３５０位相对保守的核　苷酸之间，设计ＰＣＲ引物，扩增的目的片段为５４６ｎｔ。　３猪瘟病毒巢式ＲＴ—ＰＣＲ监测方法的建立　１２３４５　Ｍ　６７８９１０１　１　Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００；１－９为ＣＳＦＶ细胞毒ＰＣＲ扩增结果；　１０为阳性对照；１１为阴性对照。　３．１猪瘟病毒ＫＮＡ的提取明书。　参照ＴＲＩｚｏ１．ＬＳ　Ｒｅｇｅｎｔ试剂说　猪瘟病毒反转录体系为　４猪瘟病毒巢式ＲＴ—ＰＣＲ监测方法的特异性、敏感性、重　复性试验　３．２猪瘟病毒反转录体系的建立２０　Ｌ：ＲＮＡ模板３　Ｌ、弓Ｉ物ＰＲ１　１　Ｌ、ｄＮＴＰ　４　Ｌ、　Ｒｎａｓｅ—Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　０．５　Ｌ、ＡＭＶ０．５　Ｌ、５　Ｘ　ＡＭＶ　Ｂｕｆｆｅｒ　４　Ｌ，　通过进一步特异性、敏感性、重复性试验发现，本实验建　立的猪瘟巢式ＲＴ－ＰＣＲ检测方法具有良好的特异性；同时，　可以从拷贝数为１０２／Ｉ￣Ｌ的猪瘟病料中检测到猪瘟病毒，具有　很高的灵敏性；本检测方法具有很高的复核率，重复性很好。　由于本研究建立的猪瘟病毒巢式ＲＴ—ＰＣＲ方法的引物序列　均在具有猪瘟病毒序列的保守区，具有更好的应用前景。　补ＤＥＰＣ水至２０　Ｌ。４２％反转录１ｈ，得到相应的ｃＤＮＡ模　板。　３．３猪症病毒巢式ＰＣＫ方法的建立步对猪瘟病毒ＤＮＡ进行扩增：　本实验方法分为２　猪瘟病毒１扩ＰＣＲ体系为２５　Ｌ：反转录产物３　Ｌ、　１０ＸＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５　Ｌ、ｄＮＴＰｓ　２Ｉ－ＬＬ、一扩上下游引物ＰＲ１　和ＰＦ１各０．５　Ｌ、ｒＴａｑ　Ｏ．２５　Ｌ、补水至２５　Ｌ。反应程序为：　９４％变性５ｍｉｎ；９４ｏＣ　３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２％１ｍＪｎ，共３２个循　环；最后７２％延伸１０ｍｉｎ。　猪瘟病毒２扩ＰＣＲ体系为２５　Ｌ：３　Ｌ　１扩ＰＣＲ产　物、１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　２．５　Ｌ、ｄＮＴＰｓ　２　Ｌ、二扩上下游引物　ＰＲ２和ＰＦ２各０．５　Ｌ、ｒＴａｑ　０．２５　Ｌ、补水至２５　Ｌ。反应程　序为：９４℃变性５ｍｉｎ；９４％３０ｓ，５５￣Ｃ　３０ｓ，７２￣Ｃ　ｌｍｉｎ，共３２　个循环；最后７２℃延伸ｌＯｍｉｎ。　３．４通过凝胶电泳，在凝胶成像设备上观察ＰＣＲ扩增产物，　２０１３年第１２期　●