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实验类型：√验证□综合□设计□创新实验日期：实验成绩：
实验十细菌菌落总数（CFU）的测定
一、实验目的：
1．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。 2．了解培养基平板菌落计数原则
二、实验基本原理：
细菌菌落总数（CFU）是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃培养24h后所生长的腐生性细菌菌落总数。它是有机污染程度的指标，也是卫生指标。在饮用水中所测得的细菌菌落总数除说明水有机污染的程度外，还指示该饮用水能否饮用。但还应当指出的是，水源水中的细菌菌落总数不能说明污染的来源。因此，结合大肠菌群数以判断水的污染的安全程度就更全面。
我国现行生活饮用水的卫生标准（GB5749－2006）规定：细菌菌落总数在1ml自来水中不得超过80个。
细菌种类很多，有各自的生理特性，必须用适合它们的培养基才能将它们培养出来。然而在实验工作中不易做到，通常用一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生性细菌，以它的菌落总数表明有机污染程度。
三、主要仪器设备及耗材：
电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，电热培养箱，恒温水浴，冰箱，菌落计数器，放大镜，肉膏蛋白胨脂培养基，灭菌水，灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四、实验步骤：
1．水样的采取
供细菌学检验用的水样，必须按无菌操作的基本要求进行采样，并保证在运送，贮存过程中不受污染。为了要正确反映水质在采样时的真实情况，水样在采取后应立即送检，一般从取样到检验不应超过4小时。条件不允许立即检验时，应存于冰箱，但也不应超过24小时，并应在检验报告单上注明。
（1）生活饮用水（自来水）先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，用灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
（2）池水、河水或湖水应取距水面10—15㎝的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，立即返回实验室检查，否则需放入冰箱中保存。
2．细菌总数测定 （1）自来水
(a)用灭菌吸管吸取1ml水样，注入灭菌培养皿中。共做三个平皿。
(b)分别倾注约15ml已溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
(c)另取三空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15ml，作空白对照。 (d)培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24小时，进行菌落计数。 三个平板的平均菌落数即为1ml水样的细菌总数。
（2）池水、河水或湖水等
(a)稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再从第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30—300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2与10-3三个连续稀释
度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。
(b)自最后三个稀释度的试管中各取1ml稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做三个培养皿。
(c)各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。
(d)凝固后倒置于37℃培养箱中培养24小时。 3．菌落计数
用肉眼观察，计平板上的细菌菌落总数，也可用放大镜和菌落计数器计数，记下同一浓度的三个平板的菌落总数。各种不同情况的计算方法如下：
（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选择平均菌落数在30—300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。
（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30—300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数。若大于2，则取其中较小的菌落总数。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。
（7）菌落计数的报告，菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的位数，以四舍五入方法计算。微了缩短数字后面的零数，可用科学计数法表示（见例表报告方式栏）。
计算菌落总数方法举例 例次 1 2 3 4 5 6 不同稀释度的平均菌落数 10 1365 2760 2890 无法计数 27 无法计数 -1菌落总数 （个/ml） 16400 37750 27100 513000 270 30500 报告方式 （个/ml） 16000或1.6×10 38000或3.8×10 27000或2.7×10 510000或5.1×10 270或2.7×10 31000或3.1×10 42544410 164 295 271 1650 11 305 -210 20 46 60 513 5 12 -3备注 两位以后的数字采取四舍五入的方法去掉 五、实验数据及处理结果
湖水水样：
平行样 1 2 3 平均 不同稀释度的平均菌落数 湖水水样菌落总数（报告方式）（个/ml）： 自来水样：
平行样 菌落数 1 2 3 平均 自来水菌落总数（个/ml）： 六、思考讨论题
1、测定水中菌落总数有什么实际意义？ 2、根据我国水质标准，讨论你这次检验结果？
七、实验体会及对实验改进的建议
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