抗菌肽的制备

农历四月初六

饲料添加剂是保障畜禽饲料安全的关键因子，也是影响猪肉品质和出口创汇的直接因素。开发动物内源性抗菌肽产品用于畜牧业，保障饲料安全性，提高猪肉品质，是国家重大科技专项“食品安全关键技术”的一个重要领域。随着现代畜禽饲养业集约化提高，病原传播和入侵及各种应激作用日益强化，使得肠道表达量有限的抗菌肽难以对畜禽自身的保健起很大作用。

长期以来，人们一直通过在动物饲料中添加抗生素、抗菌药物类生长促进剂来控制腹泻、维持健康、促进生长及提高饲料利用率。但是大量使用抗生素、抗菌药物在抑制病原微生物的同时，也抑杀了动物体内生理性微生物，破坏了微生物种群或群落间相互制约的微生态平衡，从而导致动物，特别是幼龄动物对病原微生物的易感性；同时，抗生素、抗菌药物的长期使用会导致耐药菌株的产生，而这些耐药菌株在一定条件下又能将耐药因子传递给其他细菌，使其他异种菌也变成耐药菌株，为动物疾病的控制与治疗带来麻烦。有些人畜共用的抗生素所产生的耐药菌株。甚至会对人类疾病的防治造成严重影响。因此，很多国家通过立法禁止使用部分抗生素、抗菌药物。为了寻找抗生素的替代品，生产出既能防止畜禽疾病发生，促进生长，副作用又小、无残留、无耐药性的绿色饲料添加剂，国内外许多畜牧兽医工作者进行了随着抗生素的大量广泛用于饲料中和人们对食品和环境质量的要求越来越高，人们对抗生素的副作用认识日益加深，抗生素在饲料业中的应用，已面临着淘汰或禁用的局面。应用无毒无公害的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项重要内容。随着我国进入WTO，抗生素作饲料添加剂必将严重影响畜产品在国际市场的竞争力，应用生物技术研究与开发新型抗菌剂是我国饲料科学界一项紧迫的任务。

抗菌肽具广谱抗菌作用，对畜禽具促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。可应用生物工程的技术方法生产抗病菌的转基因动植物产品,同时可以通过基因工程的技术方法大量的表达抗菌肽,使之成为新一代肽类抗菌药的来源，具有出广阔的应用前景。

1抗菌肽的分类

1.1哺乳动物抗菌肽

哺乳动物抗菌肽广泛存在于嗜中性白细胞、黏膜和皮肤等。例如,在猪肠中存在富含pro-arg、CecropinP1、有78个氨基酸残基的NK-lysin、在猪白细胞中分离出5个小分子抗菌肽,它们仅含16～18个氨基酸残基;在绵羊中至少已发现10种抗菌肽基因;牛中至少已发现30种抗菌肽;另外,牛奶中也分离到3种抗菌肽,它们具有抑制肠毒性大肠杆菌,单核细胞增多性李氏杆菌的生长。防御素是哺乳动物中研究最多的抗菌肽,包括两大类:α-防御素和β-防御素。主要存在于哺乳动物的白细胞、吞噬细胞或小肠的潘氏细胞中,特别是在嗜中性白细胞中。防御素通常由27～54个氨基酸残基组成,通过保守半胱氨酸构成3个稳定的链内二硫键使肽环合形成稳定的反向平行的β片状结构。哺乳动物防御素具有保守的6个半胱氨酸,能形成3个稳定的链内二硫键,这也是区别其他抗菌肽的主要特征之一。防御素抗微生物谱比较广泛,包括革兰氏阳性菌和阴性菌、螺旋体、真菌和一些被膜病毒,此外,对恶性细胞也具有毒杀作用。

1.2昆虫抗菌肽

从天蚕的免疫血淋巴中分离得到的高效抗菌肽Cecropins是最早发现的抗菌肽。此后在许多昆虫中也鉴定出有Ce-cropins或类似分子。Lee等在猪的肠中也发现了一个Cecropin,这可能暗示Ce-cropins广泛存在于动物中。Cecropins对各种大肠杆菌和其他革兰氏阴性细菌,如沙门氏菌,具有很强活性,且对某些革兰氏阳性菌也具有杀伤活性,但对霉菌和其他真核细菌无细胞毒性作用。Cecropins为一线性阳离子肽家庭,链长35～40个氨基酸残基。Cecropins的cDNA序列分析显示其前体分子含62～64个氨基酸残基,具有保

特别策划·饲料聚焦大量的研究。

研究发现，动物抗菌肽具有代替传统抗生素的潜力，是近几年开发的一类新型饲料添加剂，其优点主要表现在：抑制微生物的生长非常迅速；抗菌谱广，不仅对植物病原菌有强抑制作用，而且对畜禽和水产动物的病原菌也有很强的抑制作用；无免疫原性，对人畜无毒副作用；具有良好的溶解性和热稳定性；对较高的离子强度或较

助于基因工程的手段，根据抗菌肽构效和功能的关系，将已知的抗菌肽结构进行改造或将已知功能的抗菌肽活性部位杂合，希望获得抗菌活力更强，抗菌谱更广的抗菌肽。

目前，国内作为添加剂生产应用的主要是蚕抗菌肽AD-酵母制剂，大多数的畜禽试验也是围绕这种抗菌肽进行的。温刘发等通过在断奶仔猪的饲料中用抗菌肽代

增4菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量。陈晓生等，在肉鸭日粮中添加液体的蚕抗菌肽AD-酵母制剂发现，肉鸭血清代谢激素的活动显著增强，IGF-1浓度升高，营养物质合成加强，尿素氮浓度显著降低，体内氮排出减少，抗菌肽能使肉鸭的产肉率提高，腹脂率、内脏器官比重降低，在适当剂量时，使用效果与金霉素基本一致。此外，国外有报道称，抗菌肽对饲料防霉也有一定的效果。

以上研究虽然为抗菌肽的应用奠定了基础，但在应用过程中皆出现了单一抗菌肽抗菌谱窄，活性难以保持的现象，使抗菌肽难以在应用中发挥其应有的作用。为获得杀菌活力强、抗菌谱广的抗菌肽，国内外研究者对杂合抗菌肽进行了广泛的研究。金丰良等利用家蝇抗菌肽Ce-cropin和猪小肠中的抗菌肽CecropinP和蟾蜍中的抗菌肽maganin的氨基酸序列进行了改造和杂和，获得了具有自主知识产权的杀菌谱广、杀菌活力更强的抗菌肽，并在改造的酵母系统中获得了高效表达，在30升发酵罐中得到扩大表达，使抗菌肽的表达量达到了28毫克／升，是国内抗菌肽表达的最高水平，使抗菌肽在饲料中应用成为可能。

广东海大集团畜牧水产研究中心

郭吉余赵敏刘兆金511400

抗菌肽的制备大的pH变化具有较好的耐受性，甚至有抵抗消化道多肽酶水解的能力。因此，抗菌肽越来越受到研究人员的关注。

天然抗菌肽作为饲料添加剂具有众多传统抗生素所没有的优点，但它在昆虫组织中的含量很少，直接从动物体中纯化抗菌肽得率低，工序繁琐，成本太高，并且在应用中表现出单一天然抗菌肽抗菌活力低和抗菌谱窄等缺陷。这些都不利于昆虫抗菌肽在饲料添加剂中的广泛应用。另一种制备抗菌肽的方法是采用化学合成法，这种方法虽然简单容易，但价格比较昂贵，在应用中受到了限制。目前，国内外学者都借

替抗生素，对仔猪的腹泻、生产性能等作了比较，结果表明，抗菌肽在仔猪断奶应激期间抗腹泻效果不比抗生素差，适量的抗菌肽比抗生素促生长的效果要好，但高剂量的抗菌肽则降低了仔猪的生长，推测造成这一现象的原因是高剂量的抗菌肽破坏了猪肠道内微生物种群的平衡，降低了猪肠道的免疫力。黄永彤等发现，抗菌肽对肉鸡有促进生长和提高免疫力作用，与中草药抗生素相比，在出栏率、平均体重、饲料效率等方面两者均无显著性差异，且在出栏前3天停喂。温刘发等通过饮水方式给粤黄鸡添加抗菌肽的饲养试验结果表明，抗

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守的信号序列和前导序列。该基因在蚕中

有3个;果蝇中有4个。损伤和感染时诱导该基因表达。如注射细菌碎片或LPS后几小时内昆虫脂肪细胞中特异性mRNA大量增加,24小时内即可在血淋巴液中检测出Cecropins。天然免疫细胞膜受体识别微生物成分后,通过Toll通路而激活NF-KB样子。

蜂毒溶血肽是蜜蜂毒液中的一种多肽,由26个氨基酸残基组成。蜂毒溶血肽可直接与红细胞的膜脂作用具有较强的溶血作用。Apila是从蜜蜂体液中提取的一种短肽,由18个氨基酸组成,具有高效广谱的抗菌作用而对真核细胞无毒性。

1.3蛙类抗菌肽

Zaslff在非洲爪蟾皮肤中发现了小分子抗菌肽,称为Magainins。此后相继发现了多种蛙类抗菌肽,如在非洲爪蟾中就有十多种抗菌肽,不仅在皮肤颗粒腺表达,也有存在于胃黏膜和小肠道细胞。蛙类抗菌肽具有协同效应,但不同的蛙类抗菌肽很少具有同源性。

1.4植物抗菌肽

Thionins是最早从植物中分离的抗菌肽。它们对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞均有毒性。其他一些结构上与昆虫、哺乳动物防御素结构相似的植物抗菌肽,称为植物防御素。

1.5细菌抗菌肽

细菌抗菌肽包括阳离子肽和中性肽,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有分泌。例如乳酸链球菌肽是由乳球菌产生的含3～4个氨基酸残基的短肽,它是一种耐酸性物质,即使在胃这样低pH环境中稳定性也很高,能抑制革兰氏阳性菌如梭状芽孢杆菌和李氏杆菌。

2抗菌肽的抗菌机理

抗菌肽具有广谱杀菌作用,抗菌作用主要是由于在两亲性的α螺旋结构作用下,使原核细胞质膜上形成离子通道,

这种离子通道的形成改变了细胞内外的渗透压,使细胞内物质大量外渗,起到杀菌作用。姜明等通过电镜观察了柞蚕抗菌肽对大肠杆菌的作用,发现经一定时间的作用后,在细菌外壁形成了喇叭状缺口,这说明抗菌肽分子是以一端插入细菌细胞膜,通过“打孔”形成一个通道,使细菌细胞膜破裂,原生质“泄漏”而死亡。从这点看,抗菌肽的正电荷与细菌胞膜的磷脂头负电荷间的作用至关重要,在肽分子中N端α螺旋的双亲性是裂解细菌的主要部分,C末端的酰胺化与广谱抗菌有关。从而可看出抗菌肽的抗菌机理与通过阻断大分子的生物合成来发挥作用的抗菌素的抗菌机理完全不同,且病原菌不易对其产生耐药性,因此该物质将成为新抗菌药的来源.。

3抗菌肽的应用研究

温刘发等(2001)报道,通过50升发酵罐培养中间试验，在优化发酵条件后，用甲醇诱导启动醇氧化酶启动子而成功表达抗菌肽基因并分泌抗菌肽到菌体外，培养液中抗菌肽的杀菌活力达5000单位／毫升。进一步改进培养基配方，掌握较适宜的培养条件，包括PH、温度、供气量及搅拌速度等，发酵生产周期可缩短到24小时，杀菌活力达5600单位／毫升。以这些工程酵母发酵液作试验，通过饮水摄入剂量为60单位／只/天的粤黄鸡饲养试验结果表明，抗菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量,对粤黄鸡具有促生长、保健和治疗疾病的功能。蚕抗菌肽酵母制剂作饲料添加剂的应用效果显著。

4抗菌肽作饲料添加剂应用的优势抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温。规模化发酵生产抗菌肽时经高温浓缩工序，可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失活，产品在推广应用后不会出现工程菌的扩散而导致环境生态问题。抗菌肽杀菌机理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，可大规模生产，生产周期短，生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响。再者，抗菌肽产品具广谱抗菌作用，对畜禽具促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂。

总之，抗菌肽有着独特的不同于抗生素的抗菌机理,它广泛存在于多种生物体内,是生物体对外界病原物侵染而产生的一系列免疫反应的产物，具有较强的广谱抗菌能力。寻找各种动物内源性抗菌物质，以现代生物技术方法工业化生产这些在抗病原菌上具有动物“种”专一性或特异性的系列产品，必将成为替代抗生素的新型饲料添加剂。

广东佛山科学技术学院动物科学系田萍姚武群528231

绿色饲料添加剂———抗菌肽