桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较

Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.11

桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较

张淑红，吴清平，徐晓可，张菊梅，潘宝怡、彭飞艇

（广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东省微生物应用新技术公共实验室,广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地,广东省微生物研究所，广东广州 510070）

摘要：分别采用传统国标GB/T 8538-2008方法、基于OprL基因的PCR方法和环介导等温扩增(LAMP)方法检测桶装水中的铜绿假单胞菌，比较三种方法的检测效果。结果显示，采集的46份市场水样中，用传统GB8538-2008方法检出了3份阳性样品，检出率为6.5%，检测时间至少2天；而PCR和LAMP方法都检出4份阳性样品，检出率为8.7%，并且可在24 h内报告结果。PCR和LAMP方法与传统方法相比具有快速灵敏等优点，可用于大批量水样的快速检测和结果初筛。

关键词：铜绿假单胞菌；传统方法；PCR；LAMP 文章篇号：1673-9078(2011)11-1403-1405

Comparison of Detection of Pseudomonas aeruginosa in Bottled Water

ZHANG Shu-hong, WU Qing-ping, XU Xiao-ke, ZHANG Ju-mei, PAN Bao-yi, PENG Fei-ting

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding

Base ),South China Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China)

detect the Pseudomonas aeruginosa in bottled water and the results were compared. It was found that 3 bottled water samples (6.5%) were positive detected by GB8538-2008 method, while 4 bottled water samples were detected positive by both PCR and LAMP methods with the positive rate of 8.7%. As for the test of time, the traditional method need at least 2 days to finish, compared to less than 24h using PCR and LAMP methods. Therefore, PCR and LAMP assays were more rapid and sensitive than traditional method, which may be used for rapid detection of large quantities of water samples.

Key words：Pseudomonas aeruginosa; Traditional Method; PCR; LAMP

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病[1~3]。 近年来，随着全球范围内桶装饮用水消费量的不断上升，国内外有关铜绿假单胞菌污染桶装水的报道逐渐增多，引起了诸多学者和消费者的普遍关注[4~10]

。目前桶装饮用水铜绿假单胞菌检测技术方面，除传统的生化培养外，PCR和环介导等温扩增技术（LAMP）等分子方法逐步建立起来，应用于水样快速检测中。本文通过对市场销售的桶装水进行抽样检测，比较了传统培养法与PCR和LAMP方法的特点，为桶装饮用水的快速检测提供参考。

oderw.m收稿日期：2011-08-01

基金项目：广东省科技计划项目（2009A080209002、2010B031000020） 作者简介：张淑红（1978-），女，硕士，助理研究员，研究方向：食品微生物安全检测技术 通讯作者：吴清平研究员

wwnfoAbstract: Three methods including traditional method GB/T 8538-2008, PCR assay based on OprL gene and LAMP assay were used to

od.com.cn1 材料与方法

1.1 样品来源和标准菌株

所检测的46份水样为广州市场销售的各类品牌桶装饮用水（包括34份矿泉水、2份纯净水和10份山泉水），样品均在保质期内。 1.2 主要仪器

SIGMA1-15微量离心机、SIGMA 3K30台式高速冷冻离心机、PE2400 PCR仪、电泳仪、UVⅠ凝胶成像系统、TOMYES-215日本全自动灭菌、移液器、恒温培养箱、FMC-1000恒温水浴锅、超净工作台等。 1.3 主要试剂

DNA Marker2000购自TaKaRa公司；PCR Mix购自Fermentas公司；铜绿假单胞菌LAMP试剂盒购自华峰生物科技有限公司；琼脂糖购自美国Promega公司。LB肉汤、CN琼脂及配套试剂、乙酰胺肉汤、金氏B(King′s B)培养基、氧化酶试纸等购自广东环凯微生物科技有限公司。

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od1.4 铜绿假单胞菌的传统检测方法

参考《饮用天然矿泉水检验方法》GB/T 8538-2008/54铜绿假单胞菌-滤膜法和ISO16266：2006（E）水质-铜绿假单胞菌的检测和计数－滤膜法进行检验[11~12]。具体步骤：将250 mL水样用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂选择性培养基上，36 ±1℃ ℃恒温培养48 h。铜绿假单胞菌在CN琼脂出现的菌落形态有3种：有脓青素产生的蓝/绿色、无荧光的菌落，直接判为检出；产生有荧光素的黄色菌落，进一步做产氨(乙酰胺肉汤)试验确认，产氨试验阳性的判为检出；产生红脓素的红褐色、无荧光的菌落，要继续做氧化酶试验、产氨试验、荧光(金氏B斜面)试验，若氧化酶阳性、产氨试验阳性结果判为铜绿假单胞菌检出。

1.5 铜绿假单胞菌PCR检测方法

将250 mL水样用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，将滤膜转移至100 mL LB肉汤（内含0.02 g溴化十六烷基三甲胺和1.5 mg萘啶酮酸），选择增菌18 h后，吸取1 mL增菌液，煮沸法提取DNA。参考文献[13]报道，根据外膜蛋白基因oprL进行PCR扩增，引物序列为如下，F：5’-ATG GAA ATG CTG AAA TTC GGC-3’；5’-CTT CTT CAG CTC GAC GCG ACG-3’，扩增片段大小504bp。以铜绿假单胞菌ATCC27853为阳性对照。 1.6 铜绿假单胞菌LAMP检测方法

样品过滤、滤膜增菌和DNA提取同1.5方法，LAMP扩增根据华峰生物公司铜绿假单胞菌LAMP试剂盒说明书进行扩增。

ernfood.com.cn6-19#；7-22#；8-阳性CK。 8-13#。

图1 实际水样PCR扩增结果

Fig.1 The PCR result of water samples

注：M-DL2000；1-阴性CK；2-1#；3-4#；4-8#；5-2#；

2.2.2 LAMP法检测结果

利用华峰生物科技有限公司的LAMP试剂盒对46份桶装水进行铜绿假单胞菌检测，结果有4份样品检测结果阳性（如图2所示）。其中2#、8#、19#和22#样品经过LAMP扩增和显色反应后，反应管变为绿色，与对照菌株ATCC27853颜色反应一致，而其他样品为橙色，表明4份样品有铜绿假单胞菌检出。

图2 实际水样LAMP检测结果 Fig.2 The LAMP result of water samples

注：1-阳性CK；2-2#；3-8#；4-19#；5-22#；6-15#；7-3#；

2.1 传统检测方法检测结果

采集的46份市场桶装水水样，通过传统国标GB/T 8538-2008方法检测，共检出阳性样本3份（样品编号分别为8#、19#和22#）。3份水样经过膜过滤后，将滤膜转移至CN平板，36 ℃±1 ℃培养48 h后，在CN平板上均长出典型的、有脓青素蓝/绿色无荧光的菌落，经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，判断检测结果阳性。

2.2 PCR和LAMP方法检测结果 2.2.1 PCR检测结果

用PCR方法检测46份桶装水样，结果有4份水样检出铜绿假单胞菌（见图1）。从图1可以看出，样品2#、8#、19#和22#经过PCR扩增出504bp大小的目的条带， 与对照菌株ATCC27853条带一致，说明检测结果阳性。

w.m2 结果与分析

ww2.3 三种方法检测结果的比较

传统方法与分子方法的检测结果见表1。传统方法检测3份阳性样品，检出率6.5%，而PCR和LAMP方法检测结果吻合，都检测出4份阳性样品，检出率8.7%。其中2#样品PCR产物经过测序和GeneBank数据库Blast比对，与铜绿假单胞菌相似率大于99%。 产物序列如下：

GTGGCTCTGGCCTGGCTGTGGCTGTGGGTTGCTCCTCCAAGGGCGGCGATGCTTCCGGTGAAGGTGCCAATGGCGGCGTCGACCCGAACGCAGGCTATGGCGCCAACAGCGGTGCCGTTGACGGCAGCCTGAGCGACGAAGCCGCTCTGCGTGCGATCACCACCTTCTACTTCGAGTACGACAGCTCCGACCTGAAGCCGGAAGCCATGCGCGCTCTGGACGTACACGCGAAAGACCTGAAAGGCAGCGGTCAGCGCGTAGTGCTGGAAGGCCACACCGACGAACGTGGCACCCGCGAGTACAACA

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得检出，并且要求对每批成品出厂前进行铜绿假单胞菌检测[15]。

目前这些标准中采用的主要是传统生化方法，包括分离培养、生化鉴定等，不能实现大批量水样的快速检测。为进一步拓展和应用分子生物学方法，本文抽查了广州市场上46份各品牌桶装成品水，平行采用传统国标、PCR方法和LAMP方法对铜绿假单胞菌进行检测。结果发现，传统国标方法GB8538-2008检出3份阳性样品（8#、19#和22#），而PCR和LAMP方法结果一致，都可以检出4份阳性样品（2#、8#、19#和22#）。三种检测方法对8#、19#和22#样品的检测结果吻合，2#样品采用传统的膜过滤和平板培养方法未检出，但是经过PCR产物测序证明样品中存在铜绿假单胞菌。造成这种差异结果的原因主要有两方面，一方面，分析可能是铜绿假单胞菌处于逆境下的不可

w.mod培养态。另一方面，在桶装水中大量死菌存在时PCR

ACCTGGTGCTGCAGGGCGTTTCGCCGGCCCAGCTGGAAC可以检测出（PCR灵敏度约为103 cfu/mL），而传统方TGGTTTCCTACGGTAAAGAGCGTCCGGTCGCCACCGGCC法分离不到，PCR检测结果假阳性。事实上，按照国ACGACGAGCAGTCCTGGGCTCAGAACCGTCGCGTCGAG家标准要求，我国饮用水处理工厂的水源水和水处理CTTGAAGAAGA 工艺相对严格，铜绿假单胞菌不可能达到很高的数量，

表1 传统方法、PCR和LAMP方法检测结果的比较 成品水中存在大量死菌的情况比较少，因此，PCR检Table 1 Comparison of traditional method, PCR and LAMP 测结果是假阳性的可能性较小，基本是由于活菌数量

assay 增长检测出的结果。很多情况下，铜绿假单胞菌经过

水源水消毒，管道消毒和臭氧消毒后，其活力会大大样品来源

传统方法 PCR方法 LAMP方法

降低，处于非可培养状态，导致传统方法培养不出和（数量）

检测结果的假阴性，另外，在受到水中其他杂菌的抑2 3 3 矿泉水（34）

制时也可能导致检测结果的假阴性[16~17]。鉴于此，本1 1 1 山泉水（10）

文在利用PCR和LAMP方法时进行了一定时间增菌0 0 0 纯净水（2）

3 4 4 （前期试验发现18 h是两种检测方法最低的增菌时合计（46）

间），以尽量避免或减少检测结果假阴性。

3 讨论

综合比较三种检测方法可以看出，传统方法的检测周期较长，至少2天报告结果，检测灵敏度低，而在饮用水安全问题不断出现的情况下，桶装水以

PCR和LAMP方法都可以在24 h内完成样品检测，其天然卫生、不含杂质及添加物得到了众多消费者的

具有简便、快速、灵敏等特点。PCR方法整个过程约喜爱，家庭和集体场所饮用桶装水己相当普遍。但是

需要22 h（包括过滤1 min、增菌18 h、过滤1 min、近年来桶装水中铜绿假单胞菌污染问题逐步显现出

DNA提取15 min、PCR扩增3 h、电泳0.5 h）；LAMP来，成为公共卫生的重大隐患。WHO的HACCP评

方法整个检测时间约为19 h（包括过滤1 min、增菌估中明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装饮用水的危害

18 h、DNA提取15 min、LAMP扩增45 min）。与其指示菌[14]。国际水质卫生管理方面，美国、加拿大、

他方法相比，LAMP方法操作更简单，不需昂贵仪器，巴西、日本、欧洲各国及世界卫生组织/粮农组织

仅水浴锅就可以完成，且结果可用肉眼直接观察，已(WHO/FAO)等，均限定瓶装饮用水(包括天然矿泉水

被成功应用于各种食源性致病菌的快速检测[18~19]。同水源)铜绿假单胞菌MPN<3／L或每250 mL中不得检

样，在水样检测方面，为提高检测效率，可以将PCR出。我国新修订的《GB 8537-2008 饮用天然矿泉水》

和LAMP应用于出厂水样铜绿假单胞菌的快速初筛。 标准中也明确规定每250 mL水样中铜绿假单胞菌不

TGGCTCTGGGCGAGCGTCGTGCCAAGGCCGTTCAGCGCT

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