广东省地区结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型及耐药相关性

)２０１８,３４(７

:/DOI１０．３９６９i．ssn．１００２－２６９４．２０１８．００．１１０j

中国人兽共患病学报

ChineseJournalofZoonoses

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􀅰论　著􀅰

广东省地区结核分枝杆菌寡核苷酸

基因分型及耐药相关性

蔡杏珊,许蕴怡,张院良,马品云,苏碧仪,谭耀驹

摘　要:目的　研究结核分枝杆菌(不同基因型在广东省各地区的流行情况及其耐药相关性.方法　随机数字法MTB)

抽取广州市胸科医院２采用比例法进行药物敏０１４－２０１５年临床分离的来自于广东省不同地区的５０４株结核分枝杆菌菌株,

２

)感性实验,选用间隔区寡核苷酸分型方法(对结核分枝杆菌进行基因分型.基因型耐药率差异比较采用χ检Soliotinpgypg

)验.结果　(在５１０４株结核分枝杆菌临床分离株中北京家族和非北京家族分别是３８６株和１１８株.非北京家族中,T家族

高达４其余是H８株;３家族、EAI家族、MANU家族、AMBIGO家族、LAM家族以及新发基因型.北京家族构成比在性别、),.年龄上无统计学差异(但在汕头、汕尾、揭阳、东莞四个地级市的构成比低于广州市,差异有统计学意义(P＞０．０５P＜０􀆰０５)、、、、吡嗪酰胺利福平(链霉素(乙胺丁醇(SIT１、SIT５３、SIT５２、SIT１９、SIT５２３.SIT１基因型的异烟肼(INH)RFP)SM)EMB))主要流行基因型北京家族的ISIT５２３在RFP、SM、EMB、MDR的耐药率方面高于SIT１(３NH、PZA、AMK的耐药率高于非),).结论　广东省结核分枝杆菌呈基因多北京家族,差异有统计学意义(其余药物的耐药性无显著性差异(P＜０．０５P＞０．０５态性,北京基因型菌株为本省结核分枝杆菌主要流行株,而且与异烟肼、吡嗪酰胺、阿米卡星耐药相关.非北京基因型在潮汕和东莞等华侨之乡比例有所增加.

关键词:结核分枝杆菌;寡核苷酸类;基因型;抗药性;细菌

()中图分类号:R３７８．９１　　　文献标识码:A　　　文章编号:１００２－２６９４２０１８０７－０６４３－０５

(、阿米卡星(、、、左氧氟沙星(耐多药(泛耐药(而PZA)AMK)LVFX)MDR)XDR)的耐药率均高于SIT５３、SIT５２、SIT１９,()其主要流行簇依次为:２５０４株结核分枝杆菌中,４５３株在SPOIDB４．０数据库中分为４９种寡核苷酸类型归类于３０个簇,

GenotinnddruesistanceanalsisofMcobacteriumyypgagry

,tuberculosisfromGuandonreaChinagga

,,,,,CAIXinＧshanXUYunＧiZHANGYuanＧlianMAPinＧunSUBiＧiTANYaoＧugyggyyj

(GuanzhouChestHosital,Guanzhou５１００９５,China)gpg:WAbstractestudiedtheprevalenceanddruesistanceofdifferentgenotesofMcobacteriumtuberculosis(MTB)ingrypyvariousreionsofGuandonrovince．Atotalof５０４clinicalisolateswerecollectedbuanzhouChestHositalinGuanＧgggPyGgpg:()theseMTB．DifferencesingenoteresistancerateswerecomaredusinheChiＧsuaretest．Resultsshowedthat１Amonyppgtqg

,donrom２０１４to２０１５,China．Proortionalmethodfordruensitivitestandsoliotinaschosentogenotinfgfpgsytpgypgwypgo

,the５０４isolatesofMTB,３８６strainswereinBeiinfamiliesand１１８werenonＧBeiinfamilies．AmontheNonＧbeiinfamiljgjggjgy),te．TherewasnosinificantdifferenceingenderandaebetweenconstituentratiosofBeiinfamilP＞０．０５buttheconＧypggjgy()()withasinificantdifference(P＜０．０５．２Amonthe５０４isolatesofMTB,４５３strainsweredividedinto４９tesofolionuＧggypg,,MANUf,,Tfamilasuo４８．TherestwereH３familEAIfamilamilAMBIGOfamilLAMfamilndnewgenoＧywptyyyyya

,,,stituentratiosinfourprefectureＧlevelcitiesinShantouShanweiJieanndDonuanwerelowerthanthoseinGuanzhouygaggg,:cleotideandclassifiedas３０clustersinSPOIDB４．０databasThemainpoularclusterswereSIT１,SIT５３,SIT５２,SIT１９,p,,,,SIT５２３．TheresistanceratesofIsoniazid(INH)rifamicin(RFP)stretomcin(SM)ethambutol(EMB)razinamideppypy(,,,m,PZA)amikacin(AMK)levofloxacin(LVFX)ultidruＧresistant(MDR)anＧdruesistance(XDR)inSIT１genotegpgRyp

)广州市医药卫生科技项目(No．２０１６１A０１１０３３:通讯作者:谭耀驹,Emailzchtan＠１６３．comg作者单位:广州市胸科医院检验科,广州　５１００９５

()werehiherthanAboveSIT５３,SIT５２,SIT１９．ButresistanceofSIT５２３inRFP,SM,EMB,MDRwerehiherthanSIT１．３gg

washiherthanthenonＧBeiinamil．Thedifferencewasgjgfy

)statisticallinificant(P＜０．０５．TherewasnosinificantdifferＧysgg)enceinotherdrus(P＞０．０５．MTBinGuandonasgeneticallgggwyTheresistanceofofINH,PZAandAMKintheBeiinamiljgfy

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中国人兽共患病学报

()２０１８,３４７

livininChaoshanandDonuan．ggg

,,sistancetoisoniazidrazinamideandamikacin．NonＧBeiinenoteshaveincreasedintheproortionofoverseasChinesepyjggypp

:M;;;Kewordscobacteriumtuberculosis;olionucleotidesenotedruesistancebacterialggypgryy

,,olmorhicandtheBeiinenotestrainwasthemaineidemicstrainofMTBintheprovinceandwasassociatedwithreＧpypjggypp

()SuortedbheMedicalandHealthScienceandTechnoloroectofGuanzhouGrantNo．２０１６１A０１１０３３ppytgyPjg:,:CorresondinuthorTanYaoＧuEmailzchtan＠１６３．compgajg

是我国重点防控的　　结核病严重危害人类健康,重大疾病之一.近年来,人口流动的增加和耐药结１．２　主要仪器与试剂　１)SAN９６熔解曲线检测

仪、BACTECMGIT９６０系统、LabＧAid８２０核酸提核分枝杆菌的增多更加剧了结核病在人群间的传播,因此必须加强对结核病有效的控制和监测.分子流行病学,尤其是基因分型方法是监测结核病流行和传播的有效手段.

间隔区寡核苷酸分型法(spaceroligonucletide菌家族遗传的技术yping,spoligotypin,g由于其有可靠)是一项用于鉴别结核分枝杆、高效等特点,因此被广泛采用,特别在北京家族菌株中[

１Ｇ２

]多个亚洲国家分离的结核分枝杆菌的基因分型结果

.目前,表明,北京基因型是主要流行基因型[３]

基因型在俄罗斯也是优势基因型[４

],但是.此外,在,芬北京丹麦等北欧国家却很少发现[５]

.而在我国南方,兰北

、

京基因型的比例会有所降低,其它基因型例如族、HaMANU家族菌株,UT家

型及

H型家ar族le等m菌H３基因型、株会有增多[６

Ｇ８

]中,北京基因型导致了耐多药结核病的暴发.而在先前,的一些研报道究推测,北京基因型与耐药性相关[

１,９]

一个人口流动大省,结核病的疫情比较复杂.广,东耐药情省是况比较严重,为了解广东地区各种基因型与耐药性的关系,作者收集广州市胸科医院的东省各地区的结核分枝杆菌临床分离株５０４株来自广,采用igotyping方法进行基因分型,

比例法进行常规sp

o抗Ｇ结核药耐药性检测,并对各基因型及耐药情况进行分析.

　材料与方法．１　菌株来源　随机数字表法从广州市胸科医院结核分枝杆菌菌株库中选取５０４株广东省不同地区近年在临床上分离的结核分枝杆菌菌株,包括广州市株３、０江门２株、东莞１２株、佛山８株、河源１４株、惠州６州８株、１株、揭阳普宁２４株、罗定远１６株、３株、茂名汕头１８株１３株、梅、潮汕株、潮州２株、１株、清汕尾２５株、韶关５株、深圳５株、阳江１株、云浮山７株、珠海７株、湛江２株,经转种后备用１４株、漳州１株、肇庆.４株、中取仪.试剂盒２()荧结核分枝杆菌光PCR熔解M曲cS线po法lig)o、tDypNinAg分型检测

提取液及

D培养药敏管购自NA提取磁珠条购于厦门致善生物科技公司;１．３　药敏及菌种鉴定方法BD公司.７H９分枝杆菌药物敏感性测定标准化操作程序　结核分枝杆菌参照«

»[１０]

进行药

敏试验,异烟肼(m,、P(Eytcihna,mSbMu)、,利I福so平nia(zidINH)、R吡ifa嗪mp

酰in,链霉素胺RF(P)、乙(St胺re丁p

to醇Ｇ,星Z(AA)m、i左ka氧tolcin氟,沙EMAMK星B()L)e药敏试验采用vofloxacin,LVPy

razinMGFXIT９)、a阿mi６０米de法卡,待仪器自动报告结果时,记录报阳时间并分析结果;菌种鉴定方法采用晶芯基因芯片法.

１．４　DNA提取挑取一环(结核分枝杆５－菌１菌０　用接种环(落mg于在罗氏２培２S养WG标准接种环)

)基上生长良好的震荡器震荡破碎,核酸提取仪中提取９９℃２０灭菌０μLDNA提取液中,涡旋２０min,采用磁珠法于１．５　基因分型DNA,－２０℃保存备用.

iMeltingcu　采用熔解曲线间隔区寡核苷酸分

型(rveSpoligotyping,McSpoligotypＧ引ng

物)法序.列结核,引分物枝序杆列菌信基息因为组D序R列GGGGACGACＧ３′,DRb:５′ＧCa:设５′Ｇ计G荧GT光TPCTRT

SGpGolAigAotAypCiＧn３g′.分型检测试剂盒使用说明根据厦门致善C结G核AG分A枝G,

杆GG选择结核菌GMAcC

Ｇ分枝杆菌所携带的模型.首先４,３个特异的间隔区(为检测在高度同源的同向S重pac复er序)作列

(对通用引物扩增出间隔区DR,directrep

eat)上设计一对通用引物(,并利用这其次,根据每个间隔区的S１~S４３)的PCR产物;特异杂交的荧光探针.每条荧光探针都带有特征性

DNA序列设计能够与之的荧光标记和熔点温度组合.当PCR产物中存在某一间隔区序列时,相应的荧光探针就能与之杂交形成特征的熔解曲线峰;最后,通过这些熔解曲线峰的组成确认待检样品中所存在的间隔区,从而推断tl１１５７期

蔡杏珊等:广东省地区结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型及耐药相关性

/).株,分别占０．９９％(５５０４

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样品中所携带的结核分枝杆菌型别.其扩增、熔解共５１０S→５７℃退火１５S→７６℃延伸１０S,０个循环

,→９５℃３min→３５℃１min３５℃∽９０℃以０．０４１．６　质量控制　在结核分枝杆菌复合群GrA基y

因的序列片段上设计一对扩增引物及相应的检测探针,作为体系的内控指示样品质量是否合格.采用曲线分析程序如下:９５℃预热５min→９５℃解链

且此阶段采集℃/S的升温速率进行熔解曲线分析,FAM、HEX、ROX和CY５通道荧光信号.

标准菌株H３７RV结核分枝杆菌及BCG分枝杆菌做质量控制菌株.

．７　统计学与分析数据交国际数据　M库wMcsIpRoUliＧgVotNypTiRng的基因分型

plus(http

://Iww．Nw．mE)p[air１２

s]tu.eＧvurn采用ＧtgrpulauBdsieol．oor[１１

]Nugup

me)和e．frric:s８５０S．８p０１o/lSDIBT４V．０IT(hDtt_p

O:/N/进行聚类分析,

不Ｇ同基因型的构成比和耐药率运用行卡方检验等进行数据分析,P＜S０P．０S５S１为９．０软件进

差异有统计学意义.

　结　广　果

．１东省地区结核分枝杆菌的种类晶芯基因芯片鉴定证实为结核分枝杆菌　５采０４株经

用因型两大类poligotyping法分型,

分为北京基因型和非北京Mc基Ｇ

,其中北京基因型菌株为３８６株,占７６．

北京基因型包％,非北京基因型菌株括H３家族１１株,占T家族１２．２％４１(１８８株,占株,占１/５０４９２３．５．４％％(４.８/其中非

５０４);６);株EA,I家族２％７株,

占１．４％(７/５０４);MANU家族占１．(６

/株０４,)占;LAM９４株,占０．８％(４/５０４);AMBIGO０．２４　);０广东省地区主要新发现基因型．８％(４/５０４);３C７A株S１,Ｇ占占De寡核苷７lh酸．３i１株,分％型(３７类/５０．４

型０４

　)２对.％(１/获得的寡核苷酸基因分型数据进一步分类,株共归属于７７种不同寡核苷酸分型类５型０４株分离,其中种在种属S于P新OI发DB４现的．０数据库中可以检索到,另外有４寡核苷酸分型类型.通过使２９用８簇菌ioNu株m比eri例cs聚类分析,为４５３株归类于３０个簇中,

成在成簇的８３．９３％{(４５３Ｇ３０)/５０４.见图１.离株属于３为:SIT１(５０种基因型内,有种主要的流行簇７９,．７数６据％(库４０的２}/５北京基因型)３７０株,占７３．４１SI０４％T)编的分号

０４);SIT５３(T１基因型)１５株,占２．９８％(１５/(３７０

/;(IETA５I２２Ｇ(TM２基因型)a基因型)５７株,占株、SIT１５２．３３９(％Ma(n７u/Ｇ５a０r４基因型)、S５I０T４１)

)９５

图１　结核分枝杆菌寡核苷酸分型聚类图

Tab．１　Mycobacteriumtuberculosisoligonucleotidetyping

clusterog

ram．３　北京基因型的分布特征株结核分枝杆菌北京基因型、　省内各地级市的非北京基因型的分布５０４

见图北京基因型比例分别为２.其中汕头、汕尾:、揭阳、东５)、５８．/)和４５０．０％/(９/莞１８四,)低于广州市的、５个６􀆰地０级％市(１４

的/􀆰０８．５,５％３％(．３(２和４３８/１４２４．３３０,２P),＜差０．０异１．５

有７％个地级市的北京基因型比例分别为);河源统(５计１、学２)

湛江意:、义茂名(χ２

、＝７清远四．７,与广州市的差异５．７％(１２/１４)、７无６．统９％计(学１０/意１３义)(和χ２９５７．１％(８/和０＝３３．８％(１５/１１４６))

、,０．９９,P＞０．０５

于１株不作统计).;５余下的地级市因分离菌株数少．１,０．０２,０．１０４株结核分枝杆菌临床分离株的患者,男性有在性别的构成比３５分６人,女性别为:１４８人,

北京基因型/􀆰２􀆰０４５３)％.(按年龄１２２/１４分８)段,无为统青计少学７４􀆰年差１组异６％(０(―χ(２

２２＝３６４０岁．５３４５６)

,P)和

＞、青年图２　广东省地级市５０４株结核分枝杆菌的北京基因型

及非北京基因型分布图

Fig．２　BeijinggenotypesandnonＧBeijinggenotyp

esof５０４strainsofMycobacteriumtuberculosisinprefecＧturalcitiesofGuangdongP

rovince１Lww２２８６８２２s６５５２８０B５S６４６

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()２０１８,３４７

、,组(老年组(北京基因型２１―６０岁)６１―１００岁)/)/,和７三者间无统计７６􀆰９％(２８０３６４３．０％(６５８９)

２

).χ学差异(＝２．２４,P＞０．０５２．４　北京基因型与耐药表型的关系　在本研究的

５０４株结核分枝杆菌中有３８６株为北京基因型PZA、AMK、LVFX的耐药率及MDR、XDR的比率/、在上述年龄组的构成比分别为:８０􀆰４％(４１５１)

(,,上述两７６􀆰６％)１１８株为非北京基因型(２３．４％)

大类基因型结核分枝杆菌的INH、SM、RFP、EMB、

见图差异３有.统据计统学计意,其义中(χI２NH、PZA、AMK的耐药率

􀆰．００５),其余药物的耐药性无统计学差异＝６．６,６．７和(４χ．０,P．３８＜

２＝１D１R,２．１０,３．１０,２．２６,２．０９,P＞０．０５菌株中,比例为).８２在􀆰１M％DR和,

北京基因型的(８/H０３６)家和族９０,．E０A％I(１家８/族２０来).说北,耐京药家发族生对率比于高T家族７

、较意义０􀆰２％,.由于后三者家族的分离例数较少,无统计比４．７％~

,耐药率接近于北京家族MANU与LAM９家族呈现一定抗结核药耐药性.药性最低,对以上７种抗结核药物均敏感EAI家族菌株耐(见图３

).图３　结核分枝杆菌基因型各家族的耐药情况(株％)Fig

．３　ResistanceofMycobacteriumtuberculosisineachgenotypesfamily

(strain％)．５　广东省主要流行株的耐药表型分析(图取主要的有代表性的况分析,耐药结果为以北京基因型５种基因型,对其进行耐药情４)　选

其它据显４种基因型的耐药表型与示SITS１IT对比分析１作为对照,

.数

ZA、AMKSIT１基因型的、LVFX、MDRI、NHXDR、P的FP耐、药SM率、均EM高B于

、

~ITM２６５３B．、０(M％T１)DR,、而SI的STI５耐T２５药２(T３２率()方MA、SI面NT高U１Ｇ９于_a(rE)A在I２ＧRMFaP)４、S．３M％

、

５􀆰４％.由于SIT１以外的四种基S因IT型１１例３数􀆰８太％少~,没有统计学比较意义.

图４　结核分枝杆菌５种基因型的耐药率(％)情况Fig．４　Resistancerate(％)of５genotyp

esofMycobacteＧriumtuberculosis３　讨　论

结核病在世界范围内肆虐,其中发现北京基因型的传播与流行是其中一大原因,本研究数据显示:广东省部分地区的北京基因型分离率为行簇为SIT１,占７３．４１％,

高于北印度、伊朗７６．６、％南非,

流越南、泰国[１３Ｇ１７],接近于西北俄罗斯[１８]

.相比于国、内各省,高于云南、香港、台湾等南方地区[１９Ｇ２１

]河南、西藏等西北地区[

２２Ｇ２３]

.北京家族基因型在东,低于

亚地区的大规模流行可能与其强毒力有关,同时也与该地区人群广泛接受卡介苗接种密切相关,有研究表明卡介苗接种产生的保护力无法保护人群对北京家族结核分枝杆菌菌株的感染,因此,对北京基因型深入的研究将提升我们对我国主要流行的基因型的理解.

本研究分离的非北京基因型菌株占别为T家族、２３．４％,

分因型呈多态性GH分O３家族、、布C.AST１ＧED家eAlI家族、族hi及新发现基因型MANU家族、

LAM９、AMBI,基流行于中南美地区,

EAI家族则主要分布于东南亚和南印度地区,

MAAMN９U是北京家族菌株与欧美家族混合感染而成,L是拉丁美洲地中海基因型,

中国广东省是一个人口流动大省,与各国贸易旅游人口流动相关,例如广州部分地区就是外国人贸易的聚居区,其中有大量的外国人长期居住于此地从事商业贸易,特别是来自于非洲、南亚地区的人群较多,与上述地区频繁的人口流动可能导致在非洲、中亚、南亚流行的结核分枝杆菌在广东地区的播散.而潮汕人(汕头、汕尾、揭阳等地)现聚居海外的有一千多万人口,有“海内一个潮州,海外一个潮州”之说,东莞市地区海外华侨约３０万,是著名的华侨之乡,上述地区在世界范围内的人口流动更为频繁,各国流行的结核菌基００X１４２E４SP７期

蔡杏珊等:广东省地区结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型及耐药相关性

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因型得到传播而至非北京基因型的比例在５０％左右,基因型更具多态性分布特征.性

[２４Ｇ２５]

],２tuberculosisBeiinenote[J．EmernfectDis００３,１３jggypgI[]５EuroeanConcertedActiononNewGenerationGeneticMarkersp

andTechniuesfortheEidemiolondControlofTuberculoＧqpgya/Wgsis．BeiinenoteMcobacteriumtuberculosisanddrureＧjgypgy[]杨筠,董海燕,李定越,等．四川省１６０６株结核分枝杆菌solioＧpg[]谭云洪,赵秀芹,刘志广,等．湖南省２７３１株结核分枝杆菌SoliＧpg

]中华医学杂otinVA基因分型方法及其结果分析[J．ypg和ML志,]():医学研究杂志,tinJ．２０１２,４１５２８Ｇ３１ypg基因分型研究[[],():sistanceJ．EmernfectDis２００６,１６１２７３６Ｇ７４３．gI():９１５５３Ｇ１５５７．

不少文献认为北京基因型与耐药有相关耐药率AMK、LVFX抗结核药以及MDR、XDR上,

]２５

.其均高于非北京基因型,研究结果与逄宇相近[中高于T家族,H３家族,EAI家族.而MANU是

北京家族菌株与欧美家族混合感染而成,耐药率与北京基因型相近.LAM是拉丁美洲地中海的耐药,本研究显示在INH、RFP、EMB、PZA、

基因型,与抗结核药物具有耐药相关性,与文献报道相近

[２６]

药性分析.,我们将发现５种基因型进行耐

药有耐药相关性同时高于SI本T１研北京基因型与抗一究主要的、

二线结核性IT.１９值得注意的是(EAL).而SMIDTR５Ｇ２３SITB(TM５和a３n(XuTＧDa１Rr

)Ｇ),ST有ITB耐５２菌株中有

药(T相２)

关,２．１％和９０．０％均为北京家族,由此可见北京家族是引起广东省耐多药结核和泛耐药结核病的主要基因型.

本研究首次采用新型的自动化基因分型方法对结核分枝杆菌菌株的基因型鉴定,于传统的手动poligotyping方法相比较,

这种方法的自动化程度高,有效减少了人为操作,另一方面,由于自动化的判读而非通过杂交后的人工判读,最大程度降低了传统spoligotyping方法对部分位点杂交非特异信号的误判,使得研究结果更科学.本研究中仅发现了们上述方法良好的应用前景７％的新基因型,显著低于之前的报道

[２４]

,特别是对于条件有限,提示我

的实验室,上述方法有着其更强的优势.

综上所述,经MCspoligotping分型,

广东省部分地区结核分枝杆菌的基因型呈多态性,以北京基因型为主要.流行株为国际数据库SITVIT２编号为时是SIT且与抗结核药物有耐药相关性,同基因型结核M１基因型DRＧT．分B和枝杆XD菌R的ＧT传B的主要流行株.对北京播与耐药机制应引起重视.参考文献:

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