基于SPR生物传感器的抗生素残留检测及影响因素分析

第４３卷第３期　２０１０年３月　天津大学学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｖｂ１．４３　ＮＯ．３　Ｍａｔ．２Ｏｌ０　基于ＳＰＲ生物传感器的抗生素残留检测及影响因素分析　石　婷，刘　瑾，张婉洁，苏　洋，张增福，徐可欣　（天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津３０００７２）　摘要：为了检测抗生素提出了采用生物分子相互作用原理的检测方法．采用基于表面等离子体共振技术的光学传　感器，通过自组装分子技术将单克隆抗体固定到传感器金膜表面用于检测对应抗原，即待测抗生素，并记录传感器表面　液体折射率的变化曲线，其反映了被吸附抗生素的浓度的大小．对不同浓度的氨苄青霉素水溶液进行了测定，得到该传　感器的工作曲线，整体＿Ｔ－作曲线呈单调上升，且线性关系较好，同时得到了该检测方法的最低检测极限为１．２５　ｎｇ／ｍＬ。　明显低于欧盟规定的最大残留限量（４　ｇｇ／ｋｇ）．进一步分析了流速、温度、ｐＨ值和离子浓度对检测的影响，获得了该检　测方法的最佳测量条件，提高了该方法的检测精度，从而保障了该方法的有效性．　关键词：抗生素残留；表面等离子体共振；免疫测定；生物分子相互作用　中图分类号：０６５７　文献标志码：Ａ　文章编号：０４９３．２１３７（２０１０）０３—０２５５—０７　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　Ｒｅｓｉｄｕｅｓ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ＳＨＩ　Ｔｉｎｇ，ＬＩＵ　Ｊｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｗａｎ－ｊｉｅ，ＳＵＹａｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｚｅｎｇ—ｆｕ，ＸＵ　Ｋｅ—ｘｉｎ　（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３０００７２，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｂｉｏ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）ｗａｓ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉ－　ｏｔｉｃｓ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ｍｉｌｋ　ｂｙ　ａｄｏｐｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｏｌｄ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ＳＰＲ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｎｔｉｇｅｎｓ—ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘ　（ＲＩ）ｃｕｒｖｅｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｌｉｑｕｉｄｓ，ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ｒｅｃｏｒｄｅｄ　ｂｙ　ＳＰＲ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，ａｒｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｉｎ　ｍｉｌｋ．　，ａｔｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉＯｎｓ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ＰａＤｅ　Ｔｈｅ　ｗｈｏｌｅ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｃｕｒｖｅ　ｗｉｔｈ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｏｒ　ｗａｓ　ａｃｑｕｉｒｅｄ．Ｔｈｅ　ｌｏｗｅｓｔ　ｌｉｍｉｔ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｒｅａｃｈｅｄ　１．２５　ｎｇ／ｍＬ，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｍｕｃｈ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ｌｉｍｉｔ（ＭＲＬ：４　ｇｇ／ｋｇ）ｓｅｔ　ｂｙ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｕｎｉｏｎ．　Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｆｌｏｗ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｑｕｉｄ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ　ｒａｎｇｅ　ａｎｄ　ｉｏｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ—　ｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｇｅｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｅｎｓｕｒｅ　ｉｔｓ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ—　ｎｅｓｓ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ａｃｃｕｒａｃｙ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ；ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ｂｉｏ—ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　抗生素是一种杀菌、消毒和抗炎症的药物，广泛　应用于许多疾病的治疗．若抗生素残留在牛奶中，长　期食用就会导致人体对抗生素的免疫，对健康不利，　也可能引起对抗生素过敏的人产生过敏反应．目前鲜　析法（波谱法和色谱及联用技术等）、免疫法（放射免　疫法、荧光免疫法和酶联免疫法等）．但这些方法都有　各自的缺点，如耗时长、检测程序复杂、费用高等．微　生物受阻法则必须经过几小时甚至数十小时的培养　过程才能观察到结果；色谱检测法操作过程虽然简　奶中抗生素残留的检测方法大致分为３类＿Ｊ　Ｊ：生物　测定法（微生物测定法和放射受体测定法等）、理化分　收稿日期　２００９—０２．１９；修回日期：２００９．０６—２４．　便，但前处理耗时耗力；微生物检测法则需要培养细　３０７００１４６，３０８００２３９）；高等学校博士点专项科研基金资助项目（２００７００５６０７６，２００７００５６０７５）；天津市　基金项目　国家自然科学基金资助项目（应用基础与前沿技术研究计划资助项目（０６ＹＦＧＤＧＸ１７４００）．　作者简介　石通讯作者　刘婷（１９８４一　），女，博士研究生．　瑾，Ｌｉｕ－ｊｉｎ＠ｔｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　天　津　大　学　学　报　第４３卷第３期　菌，制备培养基和抗生素标准残留奶样，准备过程比　较复杂；酶联免疫法检测精度高，但是其耗材为一次　性的，且成本很高．因此，牛奶中抗生素残留的检测　领域一直受制于检测技术的发展，不能实现真正的强　制性检测，在与发达国家的贸易中也屡遭禁止．　笔者主要研究和发展一种新型的基于表面等离　子体的光学生物传感技术，用于抗生素残留快速检　出．该检测法较上述几种方法有明显的优点：①检测　存在以下不足：①检测方法繁琐，有待于改进和发展，　需要发展一种相对适用性较强、可推广的检测方法；　②国外这些研究机构均采用Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司生产的　ＢＩＡｃｏｒｅ仪器，但ＢＩＡｃｏｒｅ仪器的价格非常高，采用　现成的ＣＭ５芯片，成本太高不利于此项技术的推广，　笔者采用ＳＰＲ传感器进行系统集成，以求突破受制　于ＢＩＡｃｏｒｅ仪器的现状；③现有的研究成果大多是研　究可以检测到哪种抗生素，以及可以达到的检测极限　时间短，２０ｍｉｎ即可分析１个样品；②操作简便；③表　精度，对实验条件、影响抗原抗体的特异性反应的各　面等离子体共振（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）检　测法敏感性高，准确度高．青霉素Ｇ的检测限为　１－２／ａｇ／ｋｇ，其他青霉素类药物的检测限也低于欧盟规　定的标准　Ｊ，低于色谱检测限３－５　ｇｇ／ｋｇ和微生物受　阻检测法的检测限【４Ｊ．　２００１年Ｇａｕｄｉｎ　Ｖ等　首次开展了利用ＳＰＲ生　物传感器和免疫测定原理进行牛奶中的氯霉素和青　霉素的检测研究．２００２年瑞典大学农学院的Ｇｕｓｔａｖｓ．　ｓｏｎ等　ｊ也报道了利用ＳＰＲ方法检测牛奶中的　内　酰胺类抗生素含量，并且对青霉素Ｇ的检测极限达　到了１～２　ｇｇ／ｋｇ，远低于欧盟对青霉素Ｇ的最低检出　量（ｍａｘｉｍｕｍ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ｌｉｍｉｔ，ＭＲＬ）（４　ｇｇ／ｋｇ）的要求．但　是他们采用的是ＤＤ—ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ酶与　内酰胺　类抗生素的相互作用以及　．内酰胺类抗生素与其相　应抗体的相互作用，该方法首先需要ＤＤ　ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐ．　ｔｉｄａｓｅ酶与３．羧胺酸在４７℃下进行５　ｍｉｎ的孵化形　成结合物后才能使用，在检测过程中一般保持３７℃，　且用到的试剂也比较多：ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ抗体、３．羧胺酸、　３．羧胺酸抗体或者２．羧胺酸抗体，至少需要２种抗　体，且为间接检测，通过检测３一羧胺酸或者２．羧胺酸　间接获得ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ的含量．因此，该方法测试环节　比较繁琐，外界条件要求高，不适于应用场合．德国　的Ｗｕｐｐｅａａｌ大学的食品化学系　］，研究了采用青霉　素绑定蛋白２ｘ＊（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２ｘ　，ＰＢＰ　２ｘ＊）进行抗生素的测量．他们利用了ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ—　ｌａｂｅｌｌｅｄ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（ＤＩＧ—ＡＭＰＩ）与ＰＢＰ　２ｘ＊之间的绑　定作用，这种方法是非特异性的绑定，采用涂抹ＰＢＰ　２ｘ　的ＳＰＲ传感器，除了可以检测到ＤＩＧ．ＡＭＰＩ外，　还检测到了脱脂牛奶中的ｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ａｍｐｉｃｉｌ—　ｌｉｎ、ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ、ｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ、ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ和ｃｅｆｏｐｅｒａ－　ｚｏｎｅ．现阶段，所有这些研究小组都是采用了ＢＩＡｃｏｒｅ　仪器．　综上所述，利用ＳＰＲ生物传感器进行抗生素残　留的免疫测定方法已经得到了很好的实验验证，检测　精度相对其他抗生素检测方法是非常高的，但同时也　种因素的讨论相对较少，研究不够全面和深入．因　此，发展一种流程简单、检测效率高、成本低的检测方　法是将ＳＰＲ检测技术向抗生素残留检测领域的应用　推进的必然趋势．　笔者提出了一种基于抗原抗体相互作用原理的　ＳＰＲ检测抗生素的新方法，该方法检测流程相对简　单，对ＳＰＲ传感器预处理后，可以进行反复多次测　量，且传感器的制备成本非常低，利于该方法的推广　和应用．为此研究了基于ＳＰＲ传感器金膜的分子固　定技术，将用于检测的抗生素抗体固定到金膜表面，　制成对某种抗生素有特异性吸附作用的生物传感器，　摆脱了对ＢＩＡｃｏｒｅ公司的芯片的制约，实现了传感器　的自制备．通过抗生素与相应抗体之间的相互作用　原理，实现了抗生素的直接测量．并针对兽药中常用　的氨苄青霉素进行了实验研究，采用氨苄青霉素单克　隆抗体固定到传感器金膜表面，获得该传感器的工作　曲线及最低检出限．最后，探讨了实验条件对测量方　法的影响，考察流速、温度、ｐＨ值及离子浓度对测量　的影响，以期获得最佳的测量条件，对该方法的使用　和推广具有很好的指导意义．　１　实验原理　１．１　表面等离子体共振技术用于生物分子相互作用　分析　ＳＰＲ是电磁波所激励的在金属和电介质交界面　上形成的影响电磁波传播的谐振波，是一种光学现　象，一种消逝波．表面等离子体共振技术是１９世纪　７０年代开始逐渐发展起来的一项新型的测量测试技　术．利用ＳＰＲ制成的生物传感器进一步利用了生物　分子相互作用分析（ｂｉｏ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙ．　ｓｉｓ，ＢＩＡ）这一原理．ＢＩＡ现象的本质是，产生表面等　离子共振现象时的光入射角称为ＳＰＲ角，ＳＰＲ角随　金膜表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又与　金膜表面结合的分子质量成正比．ＳＰＲ生物传感器　２０１０年３月　石婷等：基于ＳＰＲ生物传感器的抗生素残留检测及影响因素分析　正是基于ＢＩＡ这一原理，将探针或配体固定于传感　器芯片镀着的金膜表面，含分析物的液体流过传感片　表面，分子间发生特异性结合时可引起传感片表面折　射率改变，通过检测ＳＰＲ信号改变而监测分子问的　相互作用．在分子作用过程中，靶物质可以天然状态　存在于分析物中，在自然条件下进行分析，因此保证　了所得结果的真实性．因此，该技术具有实时、免标　记、无需事先纯化地定量检测生物分子和监测两种或　多种分子问的结合的优点．　１．２传感器表面的分子自组装分子层的建立　采用免疫技术对传感器进行化学处理，将其制作　成对抗生素有特异性吸附作用的生物传感器，将抗体　固定在传感器表面．目前抗体在传感器表面的固定　方法主要包括：氨基偶联法、巯基偶联法、醛基偶联　法、组氢酸一镍螯合法及亲和吸附法等．在实验中采用　常用的方法，即氨基偶联法，其原理为羧甲基化葡聚　糖表面羧基与蛋白质的氨基通过化学交联反应，将抗　体通过形成共价键的形式固定在金膜表面．具体流　程如图１所示，在金膜表面形成ＢＳＡ蛋白质层；再通　过ＥＤＣ／ＮＨＳ的混合液活化羧化的ＢＳＡ蛋白质层，　形成有活性的ＮＨＳ酯蛋白层；抗体通过与活化的　ＮＨＳ酯蛋白层发生反应，通过氨基形成共价键连接；　最后用乙醇胺封闭没有反应的活化ＮＨＳ酯蛋白　层．该化学处理过程中金膜表面的微观分子变化如图　２所示．　图１传感器表面分子自组装分子层的建立流程　Ｆｉｇ．１　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｆｌｍ　ｏｎ　ｓｅｎｓｏｒ　ｓｕｒｆａｃｅ　Ａ—ｓＰＲ传感器；Ｂ一金膜表面；ｃ—ＢＳＡ蛋白层；　一羧化连接键；Ｅ一氨苄青霉素抗体；Ｆ一氨苄青霉素　图２传感器金膜表面结构示意　Ｆｉｇ．２　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｄｉａｇｒａｍ　ｏｆ　ｇｏｌｄ　ｉｆｌｍ　ｓｅｎｓｏｒ　ｓｕｒｆａｃｅ　２实验与结果　２．１　仪器装置与试剂　２．１．１仪器装置　采用的实验系统如图３所示．微量注射泵（Ｋｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ　Ｉｎｃ．）能够自动控制注射器来恒速注射液体，　Ｓｐｒｅｅｔａ表面等离子体共振测量系统（ＴＩ美国德州仪　器公司）用来监测流过传感器金膜表面的液体折射率　的变化　Ｊ，六通道选择阀（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ公司）可以进行不　同试剂间的选择切换，根据需要向传感器选择注入不　同试剂．　往射器　滓　图３表面等离子体共振测量实验装置示意　Ｆｉｇ．３　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｄｉａｇｒａｍ　ｏｆ　ＳＰＲ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　２．１．２试剂　磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ），】０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４；牛血　清白蛋白（ＢＳＡ），美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司生产；１一（３．二　甲氨基丙基）．３一乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ．ＨＣＬ），上　海延长生化有限公司生产；Ｎ．羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ）　上海延长生化有限公司生产；丁二酸酐（ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｎ　ｈｙｄｒｉｄｅ），美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司生产；二甲亚砜　（ＤＭＳＯ），美国Ａｍｒｅｓｃｏ公司生产；大鼠单克隆抗氨　苄青霉素抗体（ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏ—ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎｔｉ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，ＭｃＡｂ），美国ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ公司生产；乙　醇胺（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ），美国Ｓｉｇｍａ．　Ａｌｄｒｉｃｈ公司生产；氨苄青霉素（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ），生物分子　级，德国ＳＥＲＶＡ公司生产．实验中用到所有的试剂均　为分析纯，水为去离子水．　２。２　ＳＰＲ生物传感器的制备　预处理过程：在金膜表面修饰一层用ＥＤＣ／ＮＨＳ　活化的ＢＳＡ，混合溶液中各溶液的体积比为　ｓＡ：　ＶＥＤｃ：　Ｈｓ＝５：２：２（室温下保持１５　ｍｉｎ），形成均　匀的交叉连接的蛋白层；再利用磷酸二氢钠盐和　ＤＭＳＯ配置的丁二琥珀酸酐溶液（ｐＨ为６．５）浸泡蛋　白质层（室温下保持１２ｈ），使蛋白质层羧化，成为金　・２５８・　天　津　大　学　学　报　第４３卷第３期　膜和抗体的连接纽带．　抗体的固定过程：调节液体流速为１０　Ｌ／ｍｉｎ，向　传感器内通人ＰＢＳ溶液，待基线稳定后通入ＥＤＣ／　ＮＨＳ（体积比为１：１）５～１０ｒａｉｎ，活化羧化的ＢＳＡ蛋　度的增大，折射率也增大，存在正比关系．１．２５　ｎｇ／ｍＬ　的折射率差值为８０×１０一　左右，大于４５　Ｘ　１０～，认为　是可信测量，因此，该方法的检出限低于　１．２５　ｎｇ／ｍＬ．该方法的检出限远远低于欧盟规定的最　白质层，形成有活性的ＮＨＳ酯蛋白层，通人ＰＢＳ缓　冲液冲洗，待基线稳定后再通人ＭｃＡｂ１０　ａｉｒｎ，ＭｃＡｂ　大残留限量（４　ｇｇ／ｋｇ）　，也是其他方法不能比拟的．　通过与活化的蛋白层发生反应，通过氨基形成共价键　连接，为了封住未反应的活化羧基官能团，通人　１　ｍｏｌ／Ｌ乙醇胺溶液，封闭没有反应的活化ＮＨＳ酯蛋　白层．　图４显示了抗氨苄青霉素抗体在传感器金膜表　面固定时折射率的变化，通入抗体前后的折射率变化　为２　２２４×１０‘。。，说明抗体已固定在金膜表面，折射率　变化为ｌ，相当于１　ｐｇ／ｍｍ　的量Ｉ】川，以此计算表面抗　体的覆盖量为２．２　ｎｇ／ｍｍ　．　静杂　ｊ｝ｌ　　●　●●　●　ｉ：；｝　ｉ；　Ｊ　３　ｉ　如　ｍ　：兮　∞　图４单克隆抗氨苄青霉素抗体固定时典型的折射率的变化　Ｆｉｇ．４　Ｔｙｐｉｃａｌ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ａｎｔｉ—　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ＭｃＡｂ　２．３抗生素水溶液测量实验　实验过程中，测量基线去离子水的折射率标准差　约为１５　Ｘ　１０～，因此传感器金膜表面的响应，即所测溶　液的折射率变化值应大于３倍的基线标准差４５×１０－６，　才能作为可信测量值．　首先配置含氨苄青霉素质量浓度为２　０００　ｎｇ／ｍＬ　的水样品待用，再分别取一定量的所配样品并将其按　比例分别稀释为１．２５　ｎｇ／ｍＬ、２．５　ｎｇ／ｍＬ、５　ｎｇ／ｍＬ的　水样品待测．测量时（流速１０　ｇＬ／ｍｉｎ）先通人纯水样　品，稳定后通人一种质量浓度的氨苄青霉素水样品，　测量结果为两种样品折射率的差值，再通人氢氧化钠　进行表面重建（流速为２０　ｇＬ／ｍｉｎ），以便进行下次测　量．每种质量浓度的测量都重复上述过程．　图５是３种质量浓度氨苄青霉素水溶液通人传　感器后的折射率的变化曲线，而表１是通人前后的折　射率差值．从图５中可以看出，不同质量浓度的氨苄　青霉素水样品达到动态平衡后有很好的区分（每次测　量的纯水的折射率都修正到１．３３３　０００），并且随着浓　１／ｍｉｎ　图５不同质量浓度的氨苄青霉素水溶液的折射率比较　Ｆｉｇ．５　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　表１通入氨苄青霉素水溶液后的折射率　Ｔａｂ．１　Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　氨苄青霉素水样品的质　纯水样品　被测样品　折射率　量浓度／（ｎｇ・ｍＬ　）　的折射率　的折射率　差值／１０　１．２５　１．３３３　０００　１．３３３　０８３　８３　２．５Ｏ　１．３３３　０００　１．３３３　１４０　１４０　５．ＯＯ　１．３３３　０００　１．３３３　１８２　１８２　图６建立的是不同质量浓度的氨苄青霉素水样　折射率的模型曲线．整体工作曲线呈单调上升，且在　低质量浓度段，线性关系较好；而到了高质量浓度段，　曲线上升减弱．测量未知样品时，先测量未知浓度样　品与纯水的折射率差值，带人到工作曲线中对应的横　坐标即为待测样品的质量浓度．　呈　＼　斟　葚　罨　氨苄青霉素水溶液的质量浓度／（ｎｇ　ｍｆ　图６氨苄青霉素水溶液折射率模型曲线　Ｆｉｇ．６　Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘ　ｍｏｄｅｌ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　３测量条件的影响研究　３．１　进样流速对氨苄青霉素在抗体表面吸附的影响　在表面等离子体共振测量控制系统中，氨苄青霉　素在大鼠单克隆抗体表面吸附过程（宏观动力学过　程）包括两个连续的步骤，即本体溶液中的氨苄青霉　２０１０年３月　石婷等：基于ＳＰＲ生物传感器的抗生素残留检测及影响因素分析　－２５９・　¨∞盯　∞叭　素传输到传感片表面（传质过程）及其与芯片表面大　鼠单克隆抗体的吸附作用（本征吸附动力学）过程ｌ１¨，　即　Ａｂｕｌｋ—＿三　—　Ａｓｕｒｆａｃｅ　（１）　Ａ　ｆａ。。＋Ｂ　ｂ　ＡＢ　（２）　式中：Ａｂ　表示本体溶液中的被吸附物质（氨苄青霉　素）；Ａ。　ｒｆａｃ。表示到达传感片表面的氨苄青霉素；Ｂ表　示固定在传感片表面的大鼠单克隆抗体；Ａ　表示吸　附于大鼠单克隆抗体的被吸附物质（氨苄青霉素）；　￡　表示质量传输系数；ｋ　、ｋｂ表示动力学常数［　】．　ＳＰＲ的折射率表示传感片表面吸附ＡＢ的量．在低流　速阶段，被吸附物的传质速度慢于吸附作用的速度，　即式（１）慢于式（２）时，吸附过程受传质过程控制，折　射率的变化速率是由式（１）中的　决定的．一般而　言，对特定的被吸附物质而言，其本征吸附动力学常　数是一定的，增大流速会加快传质速度，吸附过程经　历由传质过程控制一传质速率与本征吸附动力学控　制一本征动力学控制的过程．当样品流速过大时，传　质速度快于本征吸附动力学速度，吸附过程由本征吸　附动力学控制，折射率的变化速率是由式（２）中的平　衡常数　决定．　对５　ｎｇ／ｍＬ氨苄青霉素水溶液在５个不同流速　下的折射率进行了比较，结果见图７．流速与折射率　差值的关系见图８．　ｔ／ｍＩｉｑ　ｆａ１　５　ｇＬ／ｍｉｎ和１０　ｐＬ／ｍｉｎ　，／ｍｉｌ１　ｆｂ１　１０　ｇＬ／ｍｉｎ、１２　ｇＬ／ｍｉｎ、１５　ｇＬ／ｍｉｎ和２０　ｇＬ／ｍｉｎ　图７不同流速下５　ｎｇ，ｍＬ氨苄青霉素水溶液折射率的比较　Ｆｉｇ．７　Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘ　ｗｉｔｈ　５　ｎｇ／ｍＬ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｆｏｗ　ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ　图８流速与折射率差值的关系曲线　Ｆｉｇ．８　Ｒｅｌａｔｌｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｆｌｏｗ　ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ　ａｎｄ　ｒｅｆｒａｃｔ－　ｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘ　图８中的曲线反映了抗体过剩时，流动的氨苄青　霉素溶液（抗原）与大鼠单克隆抗体结合反应变化规　律．由于反应后的抗原抗体复合物会附着到棱镜金　膜表面，因此，折射率的变化将能反映出复合物量的　变化．当流速很低时，吸附过程主要受传质过程控制，　形成的抗原抗体复合物较少，折射率差值变化较小．　随着流速的不断提高，抗原分子数不断增加，形成的　抗原抗体复合物也随之增多，折射率差值增大．当流　速为１０　ｇＬ／ｍｉｎ时，折射率差值达到了极值．流速继　续增大时，由结合和解离系数控制，折射率差值又逐　渐变小．　３．２温度对氨苄青霉素在抗体表面吸附的影响　抗体抗原反应，受温度的影响较大．在一定范围　内，温度升高可促进分子运动，使抗原抗体分子碰撞　机会增多，二者的结合反应加速．但温度过高（５６℃　以上），可导致抗原抗体变性或遭破坏，补体被灭活，　已形成的免疫复合物亦将发生解离．一般实验常在　３７℃恒温条件下进行．　图９为５　ｎｇ／ｍＬ氨苄青霉素水溶液在３个不同　温度下的折射率结果．从图９中可看出，３７℃时折　射率最大，２５℃和５０℃时的折射率都小于３７℃时　的，说明３７℃是本实验的最适宜温度，折射率达到　最大．　ｔｉｍＩｎ　图９不同温度下５　ｎｇ／ｍＬ氨苄青霉素水溶液折射率比较　Ｆｉｇ．９　Ｃｏｍｐａｒｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘ　ｗｉｔｈ　５　ｎｇ／ｍＬ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　・２６０・　天　津　大　学　学　报　第４３卷第３期　３．３　ｐＨ值的影响　氨苄青霉素在大鼠单克隆抗体表面的静电吸附　量的大小受氨苄青霉素和大鼠单克隆抗体的电荷类　型及二者表面电荷密度的影响，两者带相反的静电荷　有利于静电吸附的发生．氨苄青霉素带有正电荷有　利于氨苄青霉素在抗体表面的静电吸附．当氨苄青　霉素溶液ｐＨ大于其等电点ｐＩ时，氨苄青霉素表面　带有净的负电荷；ｐＨ小于其等电点ｐＩ时，氨苄青霉　素表面带有净的正电荷．传感片表面的大鼠单克隆　抗体在ｐＨ值大于３．０左右时带负电荷，当ｐＨ值小　于３，０左右时带正电荷ｌ】　Ｊ．因此，当ｐＨ＞ｐＩ时，氨　苄青霉素与大鼠单克隆抗体均带负电荷，不利于两者　的静电吸附；当３．０＜ｐＨ＜ｐＩ时，氨苄青霉素带正电　荷，抗体带负电荷，有利于两者的静电吸附，并且吸附　量随着两者电荷密度的增强而增加；当ｐＨ＜３．０时，　氨苄青霉素与大鼠单克隆抗体均带正电荷，同样不利　于两者的静电吸附．另外在低ｐＨ环境下，蛋白质容　易产生变性，失去其天然构象，所以偶联蛋白的ｐＨ　值不应低于３．０，并高于蛋白质变性失活的ｐＨ．　３．４离子浓度的影响　抗原与抗体特异结合后，亲水胶体变为憎水胶　体．如有适当浓度的电解质存在，可中和其表面电荷，　使电势降低，促进二者相互凝聚出现可见的沉淀或凝　集现象．若无电解质存在，则不易出现可见反应．但如　电解质的浓度过高，则会引起蛋白质非特异性沉　淀．此种作用称为盐析，常用于抗体的提纯．在实验中　为了不使抗原与抗体特异结合后　现沉淀或凝集现　象，用去离子水作为抗原和抗体的稀释剂．　４结论　（１）详细考察了利用ＳＰＲ生物光学传感器测量　牛奶中抗生素的可行性，利用了特异性的氨苄青霉素　抗体对金膜表面进行修饰，折射率大大提高，成功地　测量了不同质量浓度的氨苄青霉素水溶液折射率，　能够分辨最低质量浓度为１．２５　ｎｇ／ｍＬ的样品；同时　根据不同质量浓度样品的折射率不同建立了模型　曲线．　（２）当流速很低时，吸附过程主要受传质过程控　制，流速增大折射率增大，当增大到一定程度后主要　受本征动力学过程控制，即结合和解离系数的控制，　流速增大折射率减小；通过实验可知，１　０　ｇＬ／ｍｉｎ是一　个最佳流速，同种质量浓度的样品此时折射率最大．　（３）温度对氨苄青霉素与抗体的结合也有很大的　影响，温度过高可能会使抗原抗体失活，温度过低分　子运动不积极结合程度不高．根据理论与实验研究　得出，在３７℃恒温条件下，分子碰撞机会最多，折射　率最大，所以选择此温度为实验时温度．　（４）ｐＨ值的选择要根据抗原抗体的等电点不同，　使抗原抗体带相反的电荷，这样有利于二者的结合，　实验中ｐＨ值选择７．０左右，反应在中性环境下进行　时不会影响抗原抗体的理化性质，并且结合程度　最大．　（５）实验中所需溶液全部用去离子水配置以消除　离子对抗原抗体反应的影响，且不会出现沉淀或凝集　现象．　本文的研究为牛奶中抗生素残留检测奠定了良　好的基础．在牛奶中对氨苄青霉素残留实现成功检　测后，还可将此检测方法推广到其他抗生素，为探索　适合我国的抗生素测量方法提供了可靠的依据，具有　广泛的市场前景．　参考文献：　ｌ　ｌ　Ｊ　Ｍｏｎｔｅｒｏａ　Ａ，Ａｌｔｈａｕｓｂ　Ｒ　Ｌ，Ｍｏｌｉｎａｃ　Ａ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｇｅｎｔｓ　ｂｙ　ａ　ｓｐｅｃｉｉｆｃ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ（Ｅｃｌｉｐｓｅ　１　００）ｆｏｒ　ｅｗｅ　ｍｉｌｋ［Ｊ］．Ｓｍａｌｌ　Ｒｕｍｉｎａｎｔ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，５７（２／３）：２２９．２３７．　１　２］Ｂｅｒｔｒａｍ　Ｇ　Ｋ，Ａｎｇｅｌｉｋａ　Ｓ，Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ａｕｔｏ—　ｍａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｉｎ　ｍｉｌｋ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ，２００４，７６（３）：　６４６—６５４．　１　３　ｊ　Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ　Ｅ．ＳＰＲ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｌａｃｔａｍ　Ａｎ—　ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｌｋ［Ｄ］．Ｕｐｐｓａｌａ：Ｓｗｅｄｉｓｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００３．　［４］李延华，张兰威，王伟君．国标ＴＴＣ法与ＡＯＡＣ纸　片法检测乳中　内酰胺类抗生素残留对比研究［Ｊ］．中　国乳品：ｒ业，２００６，３４（５）：５７．５９．　Ｌｉ　Ｙａｎｈｕａ，Ｚｈａｎｇ　Ｌａｎｗｅｉ，Ｗａｎｇ　Ｗｅｉｊｕｎ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　一ｌａｃｔａｍｓ　ｉｎ　ｍｉｌｋ［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ　Ｄａｉｒｙ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，２００６，３４（５）：５７—５９　（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）．　１　５　Ｊ　Ｇａｕｄｉｎ　Ｖ，Ｆｏｎｔａｉｎｅ　Ｊ，Ｍａｒｉｓ　Ｅ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ｍｉｌｋ　ｂｙ　ａ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ．ｂａｓｅｄ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｓａｍｐｌｅ　ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ａｎａｌ　Ｃｈｉｍ　Ａｃｔａ，２００　１　４３６（２）：１９１—１９８．　１　６　Ｊ　Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ　Ｅ，Ｂｊｕｒｌｉｎｇ　Ｐ，Ｓｔｅｍｅｓｊｏ　Ａ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ　ｉｎ　ｍｉｌｋ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ．　２０１０年３月　石婷等：基于ＳＰＲ生物传感器的抗生素残留检测及影响因素分析　・２６ｌ・　２００２，４６８（１）：１５３—１５９．　Ｃｕｉ　Ｘｉａｏｑｉａｎｇ，Ｓｈａ　Ｙｕｆａｎｇ，Ｙａｎｇ　Ｆａｎ，ｅｔ　ａ１Ｄｅｔｅｃ．　．１　７　Ｊ　Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ　Ｅ，Ｄｅｇｅｌｅａｎ　Ｊ，Ｂｊｕｒｌｉｎｇ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉ—　ｎａｔｉｏｎ　ｏｆ／？一ｌａｃｔａｍｓ　ｉｎ　ｍｉｌｋ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｅｒｒｉｔｉｎ　ｂｙ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｕｎｄｅｒ　ｍａｓｓ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ—ｌｉｍｉｔｅｄ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ＆ｔｙ，２００５，３３（１１）：ｌ６３９—１ｒ６４２（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）．　ｎａｎｃｅ—ｂａｓｅｄ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．２００４．　５２（１０）：２７９１－２７９６．　１　ｌ　２　ｊ　Ｇｌａｓｅｒ　Ｒ　ｗ．Ａｎｔｉｇｅｎ—ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｍａｓｓ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｂｙ　ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　ｔｏ　ａ　ｓｕｒｆａｃｅ：Ａ　ｔｗｏ．　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　［８］　Ｃａｃｃｉａｔｏｒｅ　Ｇ，Ｐｅｔｚ　Ｍ，Ｒａｃｈｉｄ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ／？一ｌａｃｔａｍ　ａｎ—　ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｉｎ　ｍｉｌｋ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２ｘ　ｋｉｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，２１３（１）：　［Ｊ］．Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ，２００４，５２０（１／２）：１０５—　１１５．　１　９　Ｊ　Ａｌｅｘｅｉ　Ｎ　Ｎ，Ｓｃｏｔｔ　Ｄ　Ｓ，Ｄｉ　Ｋ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　Ｂ　ａｔ　ｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ　ｌｅｖ—　ｅｌｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｉｎｉａｔｕｒｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｔｗｏ—・ｃｈａｎｎｅｌ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓ－－　ｍｏｌｌ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＳＰＲ）ｓｅｎｓｏｒ［Ｊ３．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄＢｉｏｅｌｅｃ—　ｔｒｏｎｉｃｓ，２００２，１７（６／７）：５７３—５８４．　１　１０』Ｓｔｅｎｂｅｒｇ　Ｅ，Ｐｅｒｓｓｏｎ　Ｂ，Ｒｏｏｓ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　［Ｊ］，ＪＣｏｌｌｏｉｄＩｎｔｅｒｆａｃｅＳｃｉ，１９９１。４３（２）：５１３—５２６．　［１１］崔小强，沙宇芳，杨帆，等．应用表面等离子体共　振技术在传质控制下检测铁蛋白［Ｊ］．分析化学，　２００５，３３（１１）：１６３９—１６４２．　ｌ５２一ｌ６１．　［１３］裴仁军，崔小强，杨秀荣，等．表面等离子体子共振　技术实时研究蛋白质在修饰表面的静电吸附行为［Ｊ］．　高等学校化学学报，２００１，２２（７）：１１２８一ｌ１３Ｏ．　Ｐｅｉ　Ｒｅｒｕｎ，Ｃｕｉ　Ｘｉａｏｑｉａｎｇ，Ｙａｎｇ　Ｘｉｕｒｏｎｇ，ｅｔ　ａ１．　Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｎ　ｍｏｄｉ—　ｌｆｅｄ　ｓｒｕｆａｃｅ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ．　ｔｉｅｓ，２００１，２２（７）：ｌｌ２８—１１３０（ｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）．　１　１４　ｊ　Ｌｏｆａｓ　Ｓ，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ　Ｂ．Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｈｙｄｒｏｇｅｌ　ｍａｔｒｉｘ　ｏｎ　ｇｏｌｄ　ｓｕｒｆａｃｅｓ　ｉｎ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｓｅｎｓｏｒｓ　ｆｏｒ　ｆａｓｔ　ａｎｄ　ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　ｃｏｖａｌｅｎｔ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇａｎｄｓ［Ｊ］．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ—　ｔｉｏｎｓ．１９９０，２１：１５２６．１５２８．