雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究
姓名：***申请学位级别：硕士专业：海洋化学指导教师：***
20080901
摘要摘要虾青素是～种具有高经济价值的类嘏萝卜素，鉴于其强大的抗氧化功能，在饲料、食晶、傈健品、化妆品及医药等行业均存在广泛应用和广阔酌发展前景。作为新有毫籍的虾青素合成生物体孛积累量最高斡物种，蔫生红球藻己成惫近年来该领域的研究热点之一。本文首先开展了雨生红球藻混合营养和异养培养方式下的最佳碳源及其浓度研究，结果表骧，在混合营养和异养培养条件下，醋酸钠均是较丙二酸钠更适手雨生红球藻生长和虾青素积累的碳源，其最佳初始浓度分别为１．０ｇ·Ｌ．１和２．０ｇ＇Ｌ～。其细胞平均生长速率分别为０．２９《１和Ｏ．１３６扩’；胁迫７ｄ后细胞干重和虾青素含量分裂隽０．９８７＝Ｌ－０．１０ｌｇ’Ｌ～，２０。３０４圭０。７０５ｍｇ‘０２和０．７６３＝ｔ＝０．０５１ｇ·ｒ１，１４。９２８＝ｔ＝０。５１８ｍｇ－Ｌ１，混合营养较对照组（光合是养＞提高２５％和２｜％，惩异养培养则下降。因此结果表明以１．０ｇ·Ｌ－‘醋酸钠为碳源的混会营养方式是适合雨生红球藻培养的最佳营养方式。其次开展最佳营养方式结合半连续培养模式研究发现较一次培养，半连续培养模式下一定的更新率（２０％，３０％）能有效促进雨生红球藻的生长和虾青素的积累，其中∞％更新率组的藻粉产率最高，达１．３２ｇ－Ｕ‘；丽３０％更新率缰的虾青素产率最高，达２２，９４ｍｇ‘ｏ’，但与２０％蔓薪率维差异不显著（矿Ｏ．０５）。此外利用光生物反应器培养藤生红球藻，能使雨生红球藻细胞获得快速生长，提高生物量，并缩短胁迫周期，但虾青素的产率并不离。本文还开展了Ｃ侥超临赛萃取惑生红球藻中虾鬻素的工艺研究，在戮内尚属首次。以虾青索提取率为指标，通过考察萃取压力、萃取温度、Ｃ０２萃取流速三因素对该指标的影响，应用了中心组合设计实验与响应面分析方法，建立了最佳工艺条件药：萃取压力４４。６ＭＰａ，萃取溢度甜。２℃，ｃ０２流速７．１Ｌ嚣１，萃取时阗３。５ｈ，在此条件下获褥的虾青素提取率可达１．０２８％。本研究还针对雨生红球藻来源的虾脊素的稳定性开展研究发现：湿度离子毒ｅ℃可影响色素的稳定性；光照可导致虾青素的降解，不圈光照对虾毒素稳定性影响作用的大小顺序为避光＜室内光＜室外光；虾青素对碱不稳定，碱浓度越摘要大，游离虾青素降解越严重，因此虾青素酯皂化过程中应选择合适的碱浓度和皂化时间，以减小碱对虾青素的降解作用；添加一定量（０．２％）的ＢＨＴ还原剂对虾青素有较好的保护作用，可使虾青素保存一周时间内含量基本没有变化。同时探讨了雨生红球藻来源的虾青素对血鹦鹉观赏鱼的生长、着色及抗氧化能力的影响。结果表明与对照组相比，喂食添加虾青素饲料的鱼在生长、着色以及机体抗氧化能力均有显著提高。喂食添加虾青素饲料实验组鱼体增重３００％，较对照组提高５０％；鱼皮肤、鳞片中虾青素、类胡萝卜含量分别是实验前含量的１７４％，１８４％和２０７％，２５６％；鱼肌肉中的总抗氧化能力在实验过程中始终显著高于对照组。关键词：虾青素；雨生红球藻；血鹦鹉；混合营养；异养培养；半连续培养；Ｃ０２超临界萃取；响应面法；稳定性；总抗氧化能力ＵＡｂｓｔｒａｃｔＡｓｔａｘａｎｔｌ衄ａｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｐｉｇｍｅｎｔ，ｉｓａｐｏｗｅｒｆｕｌｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｗｉｔｈｈｉｇｈｅｃｏｎｏｍｉｃｖａｌｕｅｆｏｒｆｅｅｄｓｔｕｆｆ，ｆｏｏｄ，ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌａｎｄｃｏｓｍｅｔｉｃｓｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．ＧｒｅｅｎａｌｇａＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｔｈｅｒｉｃｈｅｓｔＳＯＵｒＣｅｏｆｎａｔｕｒａｌａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ，ｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｆｏｃｕｓｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．Ｉｎｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓ，ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ，ａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｔｕｄｉｅｄｉｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎＷａｓａｎｏｒｎａｍｅｎｔａｌｆｉｓｈｍｏｄｅｌ．ｏｆＢｅｎｅｆｉｔｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｒｂｏｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎｆｏｒＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｕｎｄｅｒｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃａｎｄｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｍｉｃｒｏａｌｇａｇｒｅｗｂｅｔｔｅｒｏｎａｃｅｔａｔｅｔｈａｎｏｎｍａｌｏｎａｔｅｉｎｂｏｔｌｌｃｕｌｔｕｒｅｍｏｄｅｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆａｃｅｔａｔｅｆｏｒｉｔｓｇｒｏｗｔｈａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｕｎｄｅｒｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃａｎｄｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｗｅｒｅ１．０ｇ＇Ｌ。ｌａｎｄ２．０ｇ＇Ｌ～，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓｏｆｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃａｎｄｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｗｅｒｅ０．２９ｄ．１ｗｅｉｇｈｔａｎｄ０．１３６ｄ～．Ｃｅｌｌｓｄｒｙａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃｏｒｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃａｆｔｅｒ８－ｄａｙｓ’０．７６３＋０．０５１ｇ＇Ｌ～，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅ０．９８７４－０．１０１９·Ｌ～，２０．３０４４－０．７０５ｍｇ·Ｌ—ｏｒ１４．９２８４－０．５１８ｍｇ‘Ｌ一，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ晰ｔｌｌａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｈｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ，ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈｏｆｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ３５％，ｒａｔｅ，ｃｅｌｌｓｄｒｙｗｅｉｇｈｔａｎｄ２５％，２ｌ％．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｓｅｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃｐｌｕｖｉａｌｉｓ．ｐａｒａｍｅｔｅｒｓｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ．Ｓｏａｗｉｔｈ１．０ｇ‘Ｌ－１ａｃｅｔａｔｅｉｓｇｏｏｄｃｈｏｉｃｅｆｏｒｃｕｌｔｕｒｉｎｇＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＳｅｍｉｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ、析ｔｌｌｔｈｅｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｕｎｄｅｒｔｈｅｆｏｒｍｅｒｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔｒｏｐｈｉｃｍｏｄｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｆａｓｔｓｔａｇｅｏｆｓｅｍｉｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅ、析ｔ｝ｌｄａｉｌｙｒｅｎｅｗａｌｒａｔｅｓｏｆ２０％ａｎｄ３０％ｏｂｔａｉｎｅｄ２．２ａｎｄ３．７ｆｏｌｄｈｉｇｈｅｒｂｉｏｍａｓｓｔｈａｎｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ；ｉｎｔｈｅｓｅｃｏｎｄｓｔａｇｅ，ｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆａｌｇａｕｎｄｅｒａｎｙｒｅｎｅｗａｌｒａｔｅｓＷａｓｒｅｍａｒｋａｂｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ（矿０．０５），ｗｈｉｌｅｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｎｅｗａｌｒａｔｅｓ（矿０．０５）．ＴｈｅｈｉｇｈｅｓｔｙｉｅｌｄｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎＷａｓ２２．９４ｍｇ’Ｌ～，ｏｂｔａｉｎｅｄｔｈａｔｏｆ２０％ｒｅｎｅｗａｌａｔａｒｅｎｅｗａｌｒａｔｅｏｆ３０％，ｗｈｉｃｈｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｔｏｃｕｌｔｕｒｅ护Ｏ．０５）．ａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｓｔｒｅｓｓｃｙｃｌｅ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆＢｅｓｉｄｅｓ，Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｔｈｅｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｇｒｅｗｆａｓｔｅｒ，ｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｂｉｏｍａｓｓｎｏｔｈｉｇｈｅｒ．ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｗａｓＡｓｔｕｄｙｏｆｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌＣ０２ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓＷａｓｔｉｍｅｏｎｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｒｅｓｓｕｒｅｓ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ，Ｃ０２ｆｌｏｗｒａｔｅｓａｎｄｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓＴｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｌｌＲｅｓｐｏｎｓｅＳｕｒｆａｃｅＭｅｔｈｏｄ（ＲＳＭ）．ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ：ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎＷａｓ１．０２８％ｕｎｄｅｒｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｐｒｅｓｓｕｒｅｏｆ４４．６ＭＰａ，ｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ６４．２℃，ｔｈｅＣ０２ｆｌｏｗｒａｔｅｏｆ７．１Ｌ·ｈ‘，ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｆｏｒ３．５ｈ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ，ｌｉｇｈｔ，ａｌｋａｌｉｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓａｎｄｒｅｄｕｃｉｎｇａｇｅｎｔｓｏｎｔｈｅｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｖａｌｕｅｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｈｅｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ４０℃；ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎｆｒｅｅａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ；ｒｅｄｕｃｉｎｇａｎｄａｌｋａｌｉｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｐｒｏｔｅｃｔＣａｌｌｌｅａｄｔｏｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｆｒｏｍｏｘｉｄａｔｉｏｎ，ＳＯａｇｅｎｔｓＣａｎｉｎａａｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｄｉｄｎｏｔＥｆｆｅｃｔｓｏｆｃｈａｎｇｅｄｆｒｏｍｗｅｅｋｗｉｔｌｌ０．２％ＢＨＴ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓｏｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈ，ｘｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｓｙｎｓｐｉｌｕｍｗｅｒｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｙｏｆｏｒｎａｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｉｅｄ．ＣｏｍｐａｒｅｄｆｉｓｈＣｉｃｈｌａｓｏｍａｃｉｔｒｉｎｅｌｌｕｍｆｉｓｈｆｅｄＣ谢ｔＩｌｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｅｏｖｅｒ、ｖｉｔｌｌａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ—ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｄｉｅｔｆｏｒ５０ｄａｙｓｇａｉｎｅｄａｎｄ１８４％ｈｉｇｈｅｒ５０％ｈｉｇｈｅｒｗｅｉｇｈｔ，１７４％ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｔｈｅｓｃａｌｅｓａｎｄｓｋｉｎ，２０７％ａｎｄ２５６％ｈｉｇｈｅｒｔｏｔａｌｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｔｈｅｓｃａｌｅｓａｎｄｓｋｉｎ，ａｎｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｏｔａｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｃａｐａｃｉｔｙ（ＴＡＣ）ｉｎｔｈｅｍｕｓｃｌｅ．ＫｅｙＷｏｒｄｓ：Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ；ＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＭｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃ；Ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ；ｐｌｕｖｉａｌｉｓ；ＣｉｃｈｌａｓｏｍａｃｉｔｒｉｎｅｌｌｕｍＲｅｓｐｏｎｓｅＳｕｒｆａｃｅＸＣｓｙｎｓｐｉｌｕｍ；Ｍｅｔｈｏｄ（ＲＳＭ）；Ｓｅｍｉｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅ；ＳｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌＣ０２Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；Ｓｔａｂｉｌｉ移；ＴＡＣＩＶ厦门大学学位论文原创性声明本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适当万式明确标明，并符合法律规范和《厦门大学研冗生字术活动规范（试行）》。Ｙ；＃ｉ－，该学位论文为（７盖１牵聊“拷鞣明剐别教授课题（组）的研究成果，获得（ｉ劲著暂扎代琴）课题（组）经费或实验室的资助，在（孑勘牵有机以雪）实验室完成。（请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验宰名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声明。）声明人（签名）：差＊羲彬年７月彦日厦门大学学位论文著作权使用声明本人同意厦门大学根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文（包括纸质版和电子版），允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。本学位论文属于：（）１．经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于年月日解密，解密后适用上述授权。（√ｆ）２．不保密，适用上述授权。（请在以上相应括号内打“√”或填上相应内容。保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。）声明人（签名）：名扎璇降７月莎日第一章绪论第一章绪论１虾青素的化学结构、理化性质、生理功能及其应用１．１虾青素的化学结构虾青素（Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）属萜烯类不饱和化合物，是一种酮式类胡萝卜素，其化学名称为３，３’一二羟基一１３，ｐ’－胡萝卜素－４，４’－二酮，分子式为Ｃ４０Ｈ５２０４，相对分子质量为５９６．８６，其分子结构如下：ｏｏＨ图１．１虾青素的构型Ｆｉｇ．１．１Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ虾青素是ｐ．胡萝卜素的衍生物，由８个异戊二烯（Ｃ５）碳单元组成。每个双键均可以以顺式结构（Ｚ式，两个集团位于双键的同侧）或反式结构（Ｅ式，两个集团位于双键的异侧）存在。Ｅ式结构从热动力学角度是最稳定的，因为其双键的取代基团不存在空间障碍。天然虾青素中９、１３和１５位存在Ｚ式结构，因此虾青素可能的几何异构体有：全．Ｅ、（９Ｚ）、（１３Ｚ）、（１５Ｚ）、（９Ｚ、１３Ｚ）、（９Ｚ、１５Ｚ）、（１３Ｚ、１５Ｚ）和（９Ｚ、１３Ｚ、１５Ｚ）等（Ｂｒａｕｎｅ明和高蓝，２００３）。ａｎｄＥｋｅｌｕｎｄ，１９９０；李浩虾青素分子两端各有一个羟基，羟基与脂肪酸反应可生成虾青素单酯和虾青素双酯，酯化作用使虾青素的疏水性增加，双酯比单酯的亲脂性更强。研究表明，虾青素酯比游离虾青素更稳定，更有利于其在组织中沉积（Ｍ越，１９９１）。与两个羟基分别连接的两个碳原子（Ｃ．３和Ｃ一３’）为手性碳原子，以它们为对称中心，可形成３Ｒ，３’Ｒ、３Ｓ，３＇Ｓ、３Ｒ，３＇８三种旋光异构体（见图１．２）。雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究化学合成的虾青素均为游离虾青素，立体结构体的质量比为：ｎ（３Ｓ，３＇Ｓ）：ｎ（３Ｒ，３’Ｓ）：ｎ（３Ｒ，３’Ｒ）拦１：２：１。天然虾青索均以３Ｒ，３’Ｒ或３Ｓ，３’Ｓ形式存在（李浩明霸高蓝，２００３）。自然界的天然虾青素主要存在于一些藻类、酵母和细菌的细胞中，甲壳动物的外壳以及一些鸟类的羽毛中也含有少量的虾青素。ＯＨ０豫、３‘蠢图重．２虾青素的立体结构体图Ｆｉｇ．１．２ＳｐａｔｉａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｇｒａｐｈｏｆＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎ１．２虾青素的理化性质虾青素是一种粉红色针状结晶体，具有光泽，熔点为２１６℃，不溶于水，易溶于吡啶、苯、二硫化碳、二氯甲烷、氯仿等有机溶剂，微溶于石油醚、乙醇、譬酵、乙醚、丙酮等大多数有机溶剂。室瀑下虾青素在部分溶剂中的溶解度如下表：表１．１虾青素在不同溶剂中的溶解度Ｔａｂｌｅ１．１Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｌｖｅｎｔｓ虾青素的长链不饱和双键结构体系使其具有高度的不稳定性：对光、氧、热等特别敏感，易于异构化和降解。加入抗氧化剂如抗坏皿酸，乙氧基喹啉、二丁基羟基甲苯（ＢＨＴ）对其有一定的保护作用（Ｔｅｅ２ｅｔａ１．，１９９１；陈晓明等，２００１）。第一章绪论～般在提取剂中添加Ｏ．１％或Ｏ．２％的ＢＨＴ（Ｎｏｂｒｅｅｔａ１．，２００６）。１．３虾青素的生理功能１．３．１抗氧化功能虾青素具有很长的共轭双键，位于共轭双键链末端的不饱和酮基、羟基，其中羟基和酮基又构成伐．羟基酮，这些独特的分子结构均具有活泼的电子效应，能向自蠢基提供电子或吸弓｜自由基的未配对电子，易与蠢由基反应而清除自由基，起到抗氧化作翔。虾青素的抗氧化作用毖其它类型的类胡萝ｂ素更强（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，１９９７），其清除自由基的能力和淬灭单线氧的活性比维生素Ｅ强５５０倍，比玉米黄质、番茄红素、叶黄素、角黄素以及Ｂ．胡萝ｂ素等其它的类胡萝卜素高１０倍，是花青素的１７倍，故称其为“超级维生素Ｅ”（Ｍｉｋｉ，１９９１；ＳｈｉｎｉｄｚｕａｎｄＧｏｒｏ，１９９６；Ｈａｉｌａｅｔａ１．，１９９７；Ｎａｋａｇａｗａｅｔａ１．，１９９７；Ｎａｇｕｉｂ，２０００）。研究发现不同色素淬灭分子氧的能力不同，其大小顺序为虾青素＞ａ。胡萝｝、素＞多．胡萝｝、素＞红木素＞玉米黄质＞黄体素＞胆红素＞腱绿素（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎｅｔ１９９７）。ａ１．，虾青素具有很强的抗氧化性和清除自由基的能力，其对人类身体的健康起着极其重要的作用，可有效地防止组织、细胞和ＤＮＡ被氧化损伤（汪洪涛，２００６）。具体功能如下：（１）显著增强肌体免疫力虾青素可增强Ｔ细胞，刺激人体内血细胞产生免疫球蛋自（Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉｅｔａｌ．，１９９６）；能显著增强肌体的免疫系统功能，增加肌体对病毒、细菌、寄生生物等的抵抗力（ＯｋａｉａｎｄＨｉｇａｓｈｉ．Ｏｋａｉ，１９９６）；对恢复老龄动物的体液免疫系统作用明显（Ｎｉｓｈｉｋａｗａｅｔａ１．，１９９７）。此终，其在抗原入侵初期增强特异性体液免疫反应的效果优予Ｂ．胡萝卜素等物质（Ｏ’ＣｏｎｎｅｒＯ’Ｂｒｉｅｎ，２０００）。ａｎｄ（２）卓越的抗癌、防癌特性虾青素可有效的抑制癌变，对膀胱癌、口腔癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌和肝癌等众多癌症均有显著的抑制效用，且所需剂量较小（Ｌｅｅｅｔａ１．，１９９７ｒＧｒａｄｅｌｅｔｅｔａ１．，１９９８；ＬｏｒｅｎｚａｎｄＣｙｓｅｗｓｋｉ，２０００）。（３）优良的抗衰老、防老化能力虾青素强大的抗氧化活性使其成为商效的光保护剂，通过口服可起到阻止皮肤光老化的作用，且作用效果优于维生素Ａ、褥生红球藻的培养及篡掰青索的提取、稳定性鞫巍用研究ｐ＊胡萝卜素和叶黄素（ＬｏｒｅｎｚａｎｄＣｙｓｅｗｓｋｉ，２０００）。此外，虫下青素可以强化肌体需氧代谢，增强肌肉力量和耐受力，起到抗衰老的作用（魏东和严小君，２００Ｉ）。乏霉）卓越魏游治心盔警等疾病功效不趣襄脂翁酸吴有降垂、降盘嚣、致善血液燕质等功用，露虾青素刘是人体内誉饱和脂肪酸的保护剡，防止其被氧化，麸褥降低心血篱疾病蛉发病率（ＬｏｒｅｎｚａｎｄＣｙｓｅｗｓｋｉ，２０００）。此鲤，虾青素麓有效防止撬嬲膜氧纯秘感光器维稳损嫠，维护视觉系统靛毽康。霹黠，虾青素露由于受到氧化损伤丽导致的脊髓损伤、帕金森氏综合症等多种中枢神经系统的损伤具有鼹著疗效（Ｍａｒｔｉｎｅｔａ１．，２００３）。１．３．２着色功麓虾脊素是一种粉红色的类麓萝ｂ素，是类胡萝卜素生物合成途径的合成终点，吴蠢较强酶色素撬积能宓乏吴汪等，１９９７），它进入动物体嚣可以不经黪镰或生物转化直接贮存在组织中，使鱼、虾、蟹等的皮肤謦日肌肉璺现健康丽鲜艳的颜色，使家禽的羽亳、皮肤、脚及禽蛋等呈现金黄色或红色（屈健，２００２）。大多数动物都不能合成类端萝卜素，爨此冀鲜艳体色瓣维持只裁依赖煞潦瓣类麓萝｝、素兹补充。旱在１９８０荦，Ｊｏｈｎｓｏｎ等在鲑蛰、鳟趣藉褥建的镯料中添翔可产生虾青素的袭发夫酵母，使褥它嬲懿体色交霉鲜亮《蔡骥剐等，２００３；陆开形等，２§够）；北极红点鲑饲料中添加虾青索，其肌肉的红色程度与添加虾黉素豹量呈正相关（屈健，２００２）；虾青索是大玛哈鱼和红鳟鱼饲料中的苜选色素（Ｃｈｏｕｂｅｒｔｅｔａｌ．，１９９６；Ｂｅｌｌｅｔａｌ。，２０００）。虹鳟薛镳料率添熊１００ｍｇ·Ｌ心酌虾青素可使箕飘岗中熬类胡萝｝、素禽量大幅度升离（Ｃｈｏｕｂｅｒｔ戡ａｌ。，１９９６）。虾青豢麓够增加红惫棘鬟鱼背部皮肤中类胡箩｝、素含量，从而影响其背部皮肤的色度，使其接近予野生鱼的水平，参瓣萝孓素帮番茄红素均无越效采（Ｓｔａｖｒｏｓ，２００５）。虾青素霹有效地改善葬建鱼、蛭、蟹的体趣，可提鑫其视觉美感及索蝼价值，是业态入士公诀效果最健的观赏鱼着色剂（ＡｋｏａｎｄＴａｍａｒｕ，１９９９）。饲喂添加合成虾青素饲料的锦鲤，其体色与来添加组对阮显著增强；喂食富有虾青素的雨生缀球藻的金鱼瞧髓够获得最佳豹红色色度《鑫毒）（Ｇｏｕｖｅｉａ嫒ａｌ。，２００３）。金鱼饲料孛添加嚣９ｍｇ．ｋｇ’谶１００（Ｇｏｕｖｅｉａｅｔｍｇ·培’的虾青素，其皮肤和尾鬯中类胡萝卜素的沉积量最高ａｌ，，２００５）。与仅嚷添撼融嘏萝卜素嚣锊料裙魄，喂食添加虾脊素４第一章绪论或虾青素与ｐ－胡萝卜素混合物饲料的脂鲤（Ｈｙｐｈｅｓｓｏｂｒｙｃｏｎｃａｌｌｉｓｔｕｓ）体内虾青素含量较高（Ｗａｎｇｅｔａ１．，２００６）。有关养殖观赏鱼的着色目前尚未发现有任何一种产品能像由雨生红球藻提供的天然虾青素那样效果显著而且持久（蔡明刚等，２００３）。１．４虾青素的应用超强的抗氧化能力和多种的生物活性，以及艳丽的红色赋予了虾青素广泛的应用前景和市场潜力。它已广泛应用于水产、家禽养殖业、食品、保健品、化妆品和医药业。其中，水产养殖业是虾青素最大的市场之一。加拿大的ＦＩＡ和美国的ＦＤＡ已批准雨生红球藻藻粉可以作为三文鱼的色素添加剂。虾青素作为水产饲料添加剂的应用价值在于它能显著提高养殖动物的体色，增强机体免疫能力，大幅度提高存活率，促进生长、繁殖和发育。饲料中添加一定量的虾青素能有效提高鱼、虾、蟹等水产养殖生物的营养价值，使养殖对象组织中的维生素Ａ、Ｃ、Ｅ的含量明显增加，类脂含量也呈现显著的增加趋势，增加量可达２０％以上（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎｅｔａ１．，１９９５ａ；ＬｏｒｅｎｚａｎｄＣｙｓｅｗｓｋｉ，２０００），从而大大提高养殖动物的市场价值。２虾青素的主要生产方法２．１化学合成法早在８０年代，瑞士罗氏（Ｈｏｆｆｍａｎｎ．Ｌａ－Ｒｏｃｈｅｅ）公司以（Ｓ）．３．乙酸基４氧一ｐ．紫罗酮为前体物质成功的合成了商品名为加丽素红（ＣａｒｏｈｐｙＵＰｉｎｋ）的虾青素，产物多为顺式３Ｒ，３＇Ｓ结构，虾青素含量为５‰１０％（屈健，２００２）。德国的ＢＡＳＦ公司以３．甲级．５．（２，６，６．三甲基．３．氧．羟基．１．环己烯基）．２，４戊二烯三芳基磷酸盐和２，７一二甲基．２，４，６．三十八烯二醛反应合成９６％一９７％的全反式虾青素（吴彩娟等，２００３）。但化学合成法的工艺复杂，成本高，抗氧化能力和生物可吸收性和都比天然的低，而且合成过程中可能被其他物质污染，出于安全考虑，化学合成的虾青素在多种食品、饲料、化妆品及医药品上应用受到很大的限制。雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究２．２化学提取法化学提取法是指利用水产品加工企业的废弃物如虾壳、蟹壳等提取虾青素。据报道其产率可达１５３峙·ｇ－１（废弃物），以美国螯虾加工工业每年约有１０００万吨甲壳类水产品废弃物为例估计的话，可获取１５３０吨虾青素。然而，水产品废弃物本身易腐败变质，且生产工艺要求苛刻，生产成本很高，产量较低，产品的纯度不高，不适合大规模开发。目前只有少数国家应用这种技术来生产虾青素（王进波，２０００）。２．３生物技术法生物技术法生产天然虾青素主要采用微生物发酵和微藻培养两种方法，由于其产物天然污染少，生物安全性高，日益受到人们的普遍关注。２．３．１微生物发酵研究表明野生型红酵母（萧海杰等，１９９９；贾朋辉，２００４），南极酵母菌（张先华等，２００５；刘均玲等，２００６），黄杆菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ）（张亮等，１９９９），乳酸分支杆菌、短杆菌１０３等虽然不需要光照且可以发酵培养，成本低，但是菌体生长较慢且虾青素含量低，仅为０．４％，无工业利用前景。２．３．２藻类培养很多藻类能够产生虾青素，如极地雪藻（耿予欢等，２００６）、绿球藻Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍｓｐ．ＭＣ．１株系（向文洲等，２００７）等。雨生红球藻（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ）是近年来被研究最多也是应用最广泛的一种，其虾青素的含量可高达细胞干重的３．０％，被看作是天然虾青素的“浓缩品”（蔡明刚和王杉霖，２００３），其虾青素的积累速率和生产总量较其它绿藻高，且所含虾青素及其酯类的配比与水产养殖动物自身配比极为相似，这是通过化学合成和利用酵母菌等提取的虾青素所不具各的优势（ＬｏｒｅｎｚａｎｄＣｙｓｅｗｓｋｉ，２０００；Ｏｍｓａｅｔａ１．，２００１）。因此，雨生红球藻被公认为是自然界中虾青素的最佳来源之一。６第一乖特论陌生红球藻（肌聊埘，。∞∞６ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）是一种单细胞淡水绿藻，隶幅绿藻门（Ｃｈ】ｏｍｐｈａｔａ）、绿藻纲（Ｃｈｌｏｒｏ－ｐｈｙｃｃａｅ），团藻目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）、红球藻科（Ｈａ眦ａｔｏｃｏｃｃａｃ∞ｅ）、红球藻届（Ｈａｃｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）。其生活史呈现多样性，主要具有营养细胞和厚壁孢子两种形态：在弱光、氮磷丰富的环境中以游动的绿色营养细胞形态存在，在该过程中雨生红球藻生长旺盛，细胞内虾青素一般含量较低（Ｔａｎｅｔａｌ，１９９５）：而在不利生存的条件（高光照、高温、高盐或营养盐饥饿）下，则失去鞭毛，以不动的厚壁孢子形态存在，并积累大量的虾青素。喜撩寡巯馕亓等胁ｉ自条忭下目疆丑！Ⅲ！Ｊｒ—１’ＬＪ。ｊ．落一‘暑．：‘．．‘胁迫陆陧一圈１．３雨生红球藻的两阶段培养示意圈Ｆｉｇ．１．３Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｗｏ＿ｓｎｇｅｃｕｌｔｕｒｅｓｆｏｒｌ＇ｌａｅｍａｆｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ４培养方式及环境因子对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响４．１培养方式４．１．１蕾莽方式根据所提供碳源形式的不同，雨生红球藻的营养方式可分为光台自养雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和成用研究（ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）、异养（ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）和混合营养（ｍｉｘｔｒｏｐｈｉｃ）三种。光合自养是指微藻在一定光照条件下利用无机碳（如ＨＣ０３一，Ｃ０２）作为碳源的营养方式；异养一般是指微藻在无光条件下利用有机碳进李亍营养的方式。混合营养是指微藻在～定的光照条件下以醋酸等有机碳作为碳源的营养方式，同时进行光合作用自养和利用有机物化能自养。雨生红球藻能在暗环境下剩用有机碳源异养生长，也能在光照条件下利用有机碳源兼养生长，其代谢机制与其他微藻不同，光合作用和氧化代谢作用是共同起作用的，且两种代谢机制是独立存在的（Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９２）。研究表明，ｅｔ合适的碳源及其浓度对异养和混养条件下的盔下青素积累十分重要（Ｋｏｂａｙａｓｈｉａ１．，１９９１，１９９３；殷明焱等，１９９８；Ｔｒｉｐａｔｈｉ虾青素的积累（Ｔｒｉｐａｔｈｉ长（Ｏｒｏｓａｅｔｅｔｅｔａ１．，２００２），充足的碳能明显促进ａ１．，２００２），但若加入过量的碳将严重抑制红球藻的生ａ１．，２００１）。目前关于碳源的选择及其浓度的研究结果差异较大，一部分学者认为与其他碳源（丙二酸钠，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，乳糖，水杨酸等）相比，醋酸钠为最适的碳源，且其浓度不宜过大，为１１９９８；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ－Ｂｏｃａｎｅｇｒａｅｔｇ＇Ｌ～一１．６４ｇ＇Ｌ一（Ｇｏｎｇｅｔａ１．，ａ１．，２００４；庄惠如等，２０００）：相反，有人认为丙二酸盐作为碳源的效果优于醋酸盐，其虾青素含量是空囱组的１４倍，且高浓度下对红球藻的抑制作用小于醋酸盐（Ｏｒｏｓａｅｔａ１．，２００５）。也有人研究表明，施用水杨酸能够加快虾青素的积累，虾青素的产量较对照组提高了近７５．８％，达１６．８６ｍｇ·∥（离政权等，２００７）。因此不同营养方式下的碳源选择及其浓度仍有待于进一步研究。混合营养是提高光诱导微藻产生色素的产量的有效方法（ｍｃｔａ１．，２００５）。在混合营养过翟中，其细胞生长速度、存滔率、虾青素产量均明显高于光合囱养和异养培养（Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９３：Ｏｒｏｓａｅｔａ１．，２００１；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ－Ｂｏｃａｎｅｇｒａｃｔｅｔａ１．，２００４；高政权等，２００７：庄惠如等，２０００：Ｋａｎｇａ１．，２００５：Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９７）。以醋酸钠为碳源，培养８ｄ后，与光养型（Ｏ．斟童１和５．８Ｉ：Ｌ－０。０９ｍｇ·ｇ一）ｍｇ·ｇ相比，混养型的细胞平均生长速率和虾青素含量分别为Ｏ．７２ｄ．１和５．９０士０．１０一，异养型则分别为Ｏ．５３ｄ．‘和５．００＿：０．０８ｍｇ·ｇ‘（庄惠如等，２０００）；有研究发现在混养条件下，ｌ％或２％的醋酸钠帮２％丙二酸钠为碳源均能显著提高虾青素的积累，分别是对照组（光合自养）的３倍和５倍（Ｏｒｏｓａｅｔａｌ．，２００１）。异养３第一章绪论条件下，盐胁迫的雨生红球藻细胞内虾青素含量仅为对照组（光合自养）的四分之一（Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９７）。此外，雨生红球藻利用重碳酸盐或Ｃ０２进行光合自养，虾青素的含量（７７．２ｍｇ·Ｌ。１）是以醋酸钠为碳源异养培养条件下的４．４倍（Ｋａｎｇｅｔａ１．，２００５）。由此可见，混合营养的效率优于光合自养，光合自养的效率优于异养。异养条件下的效果不如光合自养和混合营养，主要是因为有机碳源的加入容易带来细菌污染，导致藻体生长缓慢，但是异养具有后两者不具备的优点，即不需要光照，大大降低了生产成本，从经济角度而言有助于商业化生产。已有研究表明在一个３．７Ｌ的发酵罐里进行雨生红球藻的异养培养，细胞密度可高达６．５ｇ·Ｌ一，可见异养培养雨生红球藻也能获得高生物量（Ｃｈｅｒｔｅｔａ１．，１９９７）。而且目前已有许多微藻如小球藻，螺旋藻实现了异养发酵生产，既获得高生物量，又极大减少生产投入，并业已实现规模化生产（Ｃｈｅｎｅｔａ１．，２００６），创造出可观的经济效益。因此借鉴其他微藻的异养培养，研究开发利用异养发酵培养雨生红球藻来生产虾青素是十分必要的。４．１．２培养模式根据雨生红球藻的不同存在形式，一般将虾青素的生产分成微藻培育和虾青素积累两阶段进行。第一阶段实现雨生红球藻营养细胞的高密度生长，此阶段微藻中虾青素含量甚少，第二阶段中，往往多通过设置高光照、高温或高盐等人为胁迫手段，促使营养细胞在恶劣的生存环境下转变为厚壁孢子，以达到积累虾青素的目的（Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９３；Ｆａｎｅｔａ１．，１９９４；Ｈａｒｋｅｒｅｔａ１．，１９９６；Ｓａｒａｄａ，２００２）。雨生红球藻的培养模式主要有如下两种：一次培养（或有限培养，ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｓ），指少量藻液进行接种，培养一段时间，藻类生长繁殖达到较高的密度，即进行采收或进一步扩大培养。将收获藻液置于高光照、高温、高盐和营养盐饥饿等胁迫条件下，促使营养细胞在恶劣的生存环境下转变为厚壁孢子，以达到积累虾青素的目的（Ｈａｒｋｅｒｅｔａ１．，１９９６ｂ；Ｓａｒａｄａｅｔａ１．，２００２）。一次培养模式较为传统，目前国内外的雨生红球藻研究一般均建立在此培养模式上，该模式耗时长、产率低、连续性差，而且雨生红球藻在胁迫过程中大量死亡，不利于大规模培养。半连续式培养（ｓｅｍｉ．ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅｓ）是指在一次培养的基础上，当培养９雨生红球藻的培养及熊虾青素的提取、稳定性和成用研究藻类细胞达到相当浓度后，每天收获～部分藻液，并补充等量的新鲜培养液，继续培养。收获的藻液转入胁遣，积累虾青素。Ｆ森ｂｒｅｇａｓ等（２００１）默雨生红球藻（Ｃｅ船３７缮）于ＯＨＭ培养基孛进行过相关研究，并推辑以半连续模式应用于雨生红球藻的培养具有一定可行性。如若采用半连续式的红球藻培养方法，使红球藻绿色营养细胞在稳定的生理特性条件下，以恒定生长速率连续生产，可获得高产红球藻，剿可推动雨生红球藻的工曼讫生产。４。１．３毙生物反蔽器韵嵩密度培养法嚣蓠使焉的先生物反应器主要分秀蓊大类，鄹开放式毙生物反应器昶封闼式光生物反应器。开放式光生物反应器结构简单、投资成本低、技术要求较低，但却存在培养条件难以控制、易受环境污染等缺点，较不适合雨生红球藻大规模培养。封闭式先生物反应器麓较好酶控制培养环境，僳护徽藻不受周围环境的污染，可以实现赢细胞密度培养（魏东和臧晓南，２００１；Ｋａｅｗｐｉｎｔｏｎｇｅｔａ１．，２００６）。近年来，光生物反应器发展迅猛。国外学者利用光生物反应器进行雨生红球藻的培养研究已有不少报道（Ｖｅｇａ－Ｅｓｔｒａｄａｅｔａｌ。，２００５；Ｌｅｅｅｔｅｔａ１．，２００６；Ｌｏｐｅｚｅｔｅｔａｌ。，ａｌ。，２００６；Ｐｏｗｔｏｎｇｓｏｏｋｅｔａ１．，２００６；Ｓｕｂａｌ。，２００６；Ｋａｅｗｐｉｎｔｏｎｇ２００６；：Ｒａｎｊｂａｒｅｔａ１．，２００７），且已大规模利用光生物反应器进行微藻商业化生产，舞美国赞Ｃｙａｎｏｔｅｃｈ和Ａｑｕａｓｅａｒｃｈ等凡家大公雹己能够利爝光生物反应器培养红球藻实现天然虾青素豹规模化生产。国内光生物反应器的研究楣对比较薄弱，各种硬件相对不足，关予利用光生物反应器进行雨生红球藻的培养仅有若干稿关报道（应巧兰和时勇，２００３；剃伟等，２００６；吴霞等，２００６），我翻有良好的气候条件（日照时趣裾对较长）和辽鲻的土地，菪能因地铡宣充分裂用太鬻光，进行传统的室外大池培养，将熙符合我国国情。因此研究利用光生物反应器进行二级培养（藻种培养兔～级培养），从箍为室外大池培养提供大量藻种，逐级放大，最终实现秀生红球藻翡趣模化齑韭化生产。４。２环境因子对礴生缀球藻合成虾青素韵影晌在雨生红球藻的两个除段培养中，英所需的营养及环境条件不同。第一章绪论４．２．１光照一般认为，２ｋｌｘ以下的弱光有利于红球藻营养细胞的培养（蔡明刚等，２００３），其中最佳光强范围为１．１ｌｄｘ～１．３ｋｌｘ（Ｌｕｅｔａｌ．，１９９４；ＨａｒｋｃｒａｎｄＹｏｕｎｇ，１９９５）。就光的性质而言，红光可促进雨生红球藻的生长（Ｔｏｍｏｈｉｓａｃｔａ１．，２００４：吴霞等，２００６）。光照是诱导虾青素大量积累的重要因子（邱保胜等，２０００）。高光强有利于虾青素积累而不利于生长（殷明炎等，１９９８），但光照过强会致使红球藻大量死亡（Ｂｏｕｓｓｉｂａｅｔａ１．，１９９２；Ｈａｒｋｅｒｃｔａ１．，１９９６ｂ）。不同学者研究结果稍有差异。ｋｌｘ－３６．６ｋｌｘ（Ｈａｒｋｅｒｅｔａ１．，１９９６ｂ）：研究表明，虾青素积累的最适光强范围为３４．４雨生红球藻置于１０ｋＬｘ－１２ｋＬｘ光强下，营养细胞迅速由绿色变为红色，大量积Ｐｇ·ｃｅｌｌｓｄ累虾青素（庄惠如等，２００１）；光强为１７０ｇｍｏｌ·Ｉｎ．２·Ｓ一，虾青素的含量为２０（Ｈｅｅｔａ１．，２００７）。在光的性质方面，蓝光较红光更有利于红球藻合成虾青素ｅｔ（Ｔｏｍｏｈｉｓａａ１．，２００４；吴霞等，２００６）。目前出现如闪光等新型的胁迫方式，如利用发光二极管发射出的闪光能显著促进雨生红球藻中虾青素的积累，含量高达７０肛ｇ·ｍＬ一（Ａｂｄｏｌｍａｊｉｄ４．２．２温度ｅｔａ１．，２００５；Ｔｏｍｏｈｉｓａｅｔａ１．，２００４）。温度对雨生红球藻生长的影响，不同研究结果差异较大。各研究表明，最适温度为１４℃～１５℃（Ｈａｒｋｅｒｅｔａ１．，１９９５）、２５℃－２８℃（Ｌｕ左右（殷明炎等，１９９８）、２５℃下（Ｔｒｉｐａｔｈｉｃｔｃｔａ１．，１９９４）、２０℃ａ１．，２００２）、１５℃～２０℃（蒋霞敏等，２００５）。不同藻种的最适生长温度各异，Ｈ＇ｐｌｕｖｉａｌｉｓ２６、Ｈ＇ｐｌｕｖｉａｌｉｓ３０、Ｈ＇ｐｌｕｖｉａｌｉｓ３４和Ｈ＇ｐｌｕｖｉａｌｉｓＷＺ分别在２０℃、２５℃、２０℃、ｌ５℃时生长繁殖最快（张宝玉等，２００３）。由此可见，雨生红球藻适宜于低温环境下生长，温度范围为１４℃￣２８℃之间。低温有利于雨生红球藻的生长，高温则有利于红球藻积累虾青素（Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａｅｔａ１．，１９９１）。在３０℃的培养条件下红球藻的虾青素积累量是２０℃ｃｔ时的３倍（Ｔｊａｈｊｏｎｏａ１．，１９９４），但也有研究认为３５℃的培养温度可促进各种ｅｔ营养条件下虾青素的累积（Ｔｒｉｐａｔｈｉａ１．，２００２），也有学者研究得出２５～３０℃的温度有利于虾青素累的积量（蒋霞敏等，２００５）。总之，提高温度有利于雨生红雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究球藻中虾青素的积累。４．２．３ｐＨ雨生红球藻是淡水藻类，对ｐＨ的缓冲能力较弱（殷明焱等，１９９８）。大量研究表明，红球藻适宜于中性或稍碱性条件下生长（邱保胜和刘其芳，１９９９；Ｈａｔａｅｔａｌ。，２００１）。多数学者认为蛳值在７。乳８。０之间适合雨生红球藻生长（陈兴才等，２００６；程伟等，２００７；Ｓａｒａｄａｅｔａ１．，２００２）。品系为Ｈ·ｐｌｕｖｉａｌｉｓＷＺ的最适ｐＨ为弱酸性和中性，属较特殊的（张宝玉等，２００３）。实验证舞，虾青素产量的变化与培养基孛ｐＨ范围有很大关系（Ｈａｔａ２００１）。ｐＨ为７．０时，虾青素的产量显著增加（Ｓａｒａｄａｅｔａ１．，２００２）。４．２．４盐度ｅｔａ１．，盐度的适当增加会抑制微藻的生长，但可促进厚壁孢子的形成及虾青素的积累（Ｈａｒｋｅｒｅｔａ１．，１９９６ｂ；Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９７ａ；黄水英等，２００８）。添加～定量的（０．５５阮∞．６３％）的ＮａＣｌ有剩于蒸生红球藻合成虾青素。僵盐度不宣太高，当ＮａＣｌ浓度超过１．０％，会使雨生红球藻大量死亡（Ｓａｒａｄａｅｔａ１．，２００２）。４．２．５维生素维生素不是雨生红球藻生长的必需营养物质，但添加适量的维生素Ｂ可以改善其生长（金传荫等，１９９７；邱保胜和刘其芳，２０００），添加适量的维生素Ｂｌ、Ｂ１２霹促进红球藻水生７４８株（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ。ＨＢ７４８）的生长（金传荫等，１９９７），维生素Ｂ１２能有效促进雨生红球藻７１２株的生长速率，但对其产量却几乎没有影响（张宝玉等，２００３），添加维生素Ｂｌ、Ｂ１２可有效提高藻粉产量和虾青素产量（张英等，２００４）。４。２．６营养元素（１）氮盐氮是雨生红球藻生长的必需元素，最适氮源为硝酸盐，适宜氮浓度范围在２。５—１０ｍｍｏｌ·Ｌ。１之闻（Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａｅｔａｌ。，１９９１；ＨａｒｋｅｒａｎｄＹｏｕｎｇ，１９９５）。低氮１２第一章绪论或氮缺乏可促进雨生红球藻大量积累虾青素，多数学者认为可通过调节培养液中硝酸盐的浓度来控制红球藻对虾青素积累（Ｈａｒｋｅｒｅｔａ１．，１９９６ｂ；Ｆｆｉｂｒｅｇａｓｅｔａ１．，１９９８）。Ｇｏｎｇ和Ｃｈｅｎ（１９９８）认为低浓度的氮（Ｏ．０３ｇ。Ｕ１ＫＮ０３）有利于虾青素的积累。培养液中的氮完全消耗（即缺氮）时才有虾青素的明显积累（庄惠如等，２０００；Ｆｆｉｂｒｅｇａｓｅｔａ１．，２００１；Ｏｒｏｓａｅｔａ１．，２００５）。然而也有研究结果表明氮的存在是虾青素积累的必要条件（Ｂｏｕｓｓｉｂａｅｔａ１．，１９９２）。（２）碳源碳是微藻生长重要元素，它提供细胞中有机物如蛋白质、碳水化合物、脂肪酸等的碳骨架。补充碳源的方法主要有充Ｃ０２、添加ＮａＨＣ０３以及添加乙酸钠（殷明焱等，１９９８）。培养基中加入一定浓度的醋酸盐较适合雨生红球藻的生长（Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９１；Ｆａｎｅｔａ１．，１９９４）。乙酸钠较葡萄糖等其它碳源更能维持雨生红球藻进行混合营养生长和异养生长，两种营养类型下，对乙酸钠的浓度要求分别为０．５ｇ’Ｌ～～１．０ｇ‘Ｌ。１和１．０ｇ＇Ｌ一～１．５ｇ＇Ｌ以（庄惠如等，２０００ａ）。ｅｔ充足的碳对虾青素的积累也很重要（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等，１９９８；Ｔｒｉｐａｔｈｉ（Ｏｒｏｓａｅｔｅｔａ１．，１９９１，１９９３；殷明焱ａ１．，２００２），但若加入过量的碳将严重抑制红球藻的生长Ｃｈｅｎ，ａ１．，２００１ａ）。醋酸钠作为碳源的最适浓度为１．６４ｇ·Ｌ～（Ｇｏｎｇａｎｄ１９９８ａ）；醋酸钠浓度为１．Ｏｇ’Ｌ．１时，虾青素含量可提高到９８ｍｇ。ｇｄ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ—Ｂｏｃａｎｅｇｒａｅｔａ１．，２００４）。丙二酸盐作为碳源的效果优于醋酸盐，其虾青素含量是空白组的１４倍，且高浓度下对红球藻的抑制作用小于醋酸盐（Ｏｒｏｓａｅｔａ１．，２００５）。但也有学者研究表明，乙酸钠的补充与氮缺乏对虾青素的积累具有协同作用（胡章立等，２００２）。（３）磷盐研究表明，中等浓度的磷（０．１（Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａｅｔｇ‘ＬｄＫ２ＨＰ０４）即可满足其生长需要ａ１．，１９９１）。且磷酸盐的加入可以提高红球藻培养液中的缓冲性能，扩大其ｐＨ适应范围。很多研究表明，磷缺乏同样可以促进虾青素的积累，但效果不如氮缺乏显著（Ｈａｒｋｅｒｅｔａ１．，１９９６ｂ；Ｂｏｕｓｓｉｂａｅｔａ１．，１９９９；Ｈｅｅｔａ１．，２００７），也有研究报道雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究较高的磷浓度有利于虾青素的积累（Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａ（４）硫酸盐ｅｔａ１．，１９９１）。硫酸盐对虾青素的积累影响的研究甚少。已有研究表明，缺硫对于虾青素的积累极为显著，与缺氮效果相当（Ｈｅｅｔ（５）Ｆｅ２＋ａ１．，２００７）。铁的价态、形态等对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响明显。研究表明，不同形态的铁对雨生红球藻生长和虾青素的积累均具有促进作用，促进效果依次是：柠檬酸铁＞ＥＤＴＡ络合铁＞胶体态水合氧化铁。不同价态的铁对雨生红球藻生长影响各异，Ｆｅ３＋较Ｆｅ“更有利于雨生红球藻在营养生长阶段的生长，且较Ｆｅ２＋组提高１６％；而Ｆｅ２＋更能够提高雨生红球藻细胞积累虾青素的能力，其虾青素含量较Ｆｅ３＋组高ｌＯ％（齐安翔，２００６），这与已有研究结果相似，高浓度的Ｆｅ》可促进红球藻对虾青素的积累，但效果不如缺氮、缺磷显著（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ１９９１；Ｈａｒｋｅｒｅｔｅｔａ１．，ａ１．，１９９６ｂ）。此外，Ｆｅ２＋与某些盐共同作用对虾青素的积累产生不同的影响。如Ｆｅ２＋与醋酸盐一同加入更有利于虾青素的合成，但瓣存在时这静作用受到抑制（Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａｌ。，１９９３）。４．２．７活性氧溶解氧和多种活性氧分子（１０２，Ｈ２０２，ｐｅｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌ和ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｒａｄｉｃａｌ）的存在都可以有效地诱导细胞内虾青素的合成（ＨａｒｋｅｒＫｏｂａｙａｓｈｉｅｔｅｔａｎｉｏｎａ１．’．１９９６ｂ：ａ１．，１９９３：Ｔｊａｈｊｏｎｏｅｔａ１．，１９９４：Ｈａｇｅｎｅｔａ１．，２００１）。已有研究发现在氮限制的连续恒化培养中，溶氧分匿的升高馒红球藻不动细胞数匮增／Ｊｌｌ（Ｌｅｅｅｔａ１．，２００６；邱保胜和刘其芳，２０００）。适当浓度的活性氧诱生剂可增加虾青素含量，但同时又会抑制雨生红球藻的生长（王劲和段舜山，２００６）。｜碡第一睾绪论５雨生红球藻来源的虾青素的提取５．重雨生红球藻细胞璧的破碎方式细胞破碎方式对色素的提取效率来说是非常重要的。在大量的雨生红球藻研究中，细胞破碎方式有组织匀浆器破壁（Ｈａｒｋｅｒｅｔａ１．，１９９６ａ），超声破壁（欧阳琴等，２００５；周湘池等，２００６；陈兴才等，２衡７；壬灵昭等，２∞７），高压均质（欧阳琴等，２００５；陈兴才等，２００７），反复冻融（陈兴才等，２００７），研磨破碎（ＣｈｏｕｂｃｒｔａｎｄＨｅｉｎｒｉｃｈ，１９９３；Ｈａｇｅｎｃｔａ１．，１９９３：Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９３；王灵昭，２００７），酸碱加热法（ＸｙｌａｎｄｅｒａｎｄＢｒａｕｎｅ，１９９４：Ｔｒｉｐａｔｈｉｅｔａ１．，１９９９：Ｒｉｓｅｅｔａ１．，１９９４：Ｂａｒｅｔａ１．，１９９５；Ｓａｒａｄａｅｔａ１．，２００６），或酶解破壁（Ｇｒｕｎｇｅｔａ１．，１９９２：Ｍｅｎｄｅｓｅｔａ１．，２００１）等。利用研钵研磨的细胞破碎方法简便，并能有效的从焉生红球藻中提取虾青素，对于藻细胞的虾青素提取来说，该细胞破碎方法毙较适宜（ＹｕａｎａｎｄＣｈｃｎ，２０００：王灵昭等，２００７）。５．２雨生红球藻来源的虾青素的提取５．２．１溶剂提取法（ＳｏｌｖｅｎｔＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ）虾青素属于萜类化合物，极性不强，具有疏水亲脂性，在室溢下易溶于二氯擎烷（３０ｇ＇Ｌｄ），氯仿（１ｅｇ‘Ｌ－１），二甲亚砜（Ｏ。５ｇ＇Ｌ砖）和丙酮（Ｏ．２ｇ’Ｌｔ）等有机溶剂（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｌ：ａ１．，１９９１）。虾青索在有机溶剂中的溶解度越大，越利于从藻细胞中提取虾青素。因此通常采用溶剂提取法（ＳｏｌｖｅｎｔＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ），即选用合适的溶剂使虾青索尽可能多的溶出。文献中常采用单一有机溶剂如丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、石油醚、二硫化碳等或为上述溶剂不同比例的混合溶剂进行提取（庄惠如等，２００１ｂ；欧阳琴等，２００３；赵立艳等，２００６：Ｏｒｏｓａｒｅｔａ１．，２００５；Ｓａｒａｄａｅｔａ１．，２００６；至灵昭等，２００７）。但是有些有桃溶剂虽是虾青素良好的溶剂，却很难用离心的方法将溶剂与破碎藻细胞完全分离，部分细胞残骸悬浮于有机溶剂中，对后续的生物利用安全性造成隐患。ｌＳ雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究５．２．２超临界萃取法（ＳｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌＦｌｕｉｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＦＥ）超蝮界流体是指在临界温度和临界压力下的物质状态。它兼有了气、液体双重特性。其扩散系数与气体接近，具有较快的传质速率；其密度与液体状态接近，溶解能力较大，从而成为理想的萃取溶剂。超临界流体萃取是刹用超临界流体特有的溶解能力丽发展起来的一种化工分离技术。２０世纪７０年代以来，德国、法国、美国等西方发达国家首先将超临界流体萃取理论用于工业生产中，取得了显著的经济和社会效益（唐仕荣，２００７）。超临界流体具有诸多技术特点：（１）具有高度选择性，可分离高沸点混合物，操作温度低，适于份力量热不稳定的物质；（２）可同时完成蒸馏和萃取过程，可分离难分离的有机混合物，特别是对同系物的分馏更其特色；（３）其萃取能力随流体密度增加瑟提高，当密度保持不变时，在一定范圈内随摹取时阆延长弱增加。（４）可循环利用，耗能较低，无残留、低成本（张镜澄，２０００；陈虹等，１９９９）。超临界流体萃取技术凭借其独特的优势得到越来越广泛的应用和重视。在食品工业中主要是脱除嘲唼豆和茶叶中的咖啡因，啤酒花有效成分的萃取，天然香料的萃取，天然色素的萃取等方面（金竹萍等，２００７）：超临界萃取由于其工艺简单，操作低温，无溶剂残留等特点而成为天然产物的新型工艺之一（廖传华等，２００７）。Ｃ０２无毒、无臭、无味、不燃烧、化学性质稳定、不易与溶质反应；监赛点低（Ｔ－３１．２６℃，Ｐ＝７。２ＭＰａ），易达到；纯度高、价廉、易获得，易与溶剂分离，使用安全无污染。当前绝大部分超临界流体萃取都是采用Ｃ０２作为溶剂。大量研究表明Ｃ０２超临界萃取已广泛应用于微藻天然产物的提取（Ｍｅｎｄｅｓｅｔａ１．，１９９４），如利用Ｃ０２－ＳＦＥ提取产烃葡萄藻（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｂｒａｕｎｉｉ）中的碳水化合物、中肋骨条藻（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａｃｏｓｔａｔｕｍ）中的脂质化合物（Ｐｏｌａｋｅｔａ１．，１９８９）、小球藻中的类胡萝｝、素和脂旗（ＭｅｎｄｅｓａｎｄＦｅｍａｎｄｅｓ。，１９９５）。目前国内外利用Ｃ０２超临界萃取雨生红球藻中虾青素的研究不多，研究结果相对一致，均认为高压、高温、低Ｃ０２流速有利于虾青素的提取（Ｍａｃｈｍｕｄａｈｅｔａ１．，２００６；Ｎｏｂｒｅｅｔａ１．，２００６）。国内在利用Ｃ侥超临界萃取雨生红球藻中虾青素尚未见相关报道，且国外的相关研究基本停留在单因子研究，没有综合考虑各因素问的相互影响，忽略了因子间的交互作用，因此有待予进一步研究。１６第一章绪论５．２．３其它提取方法其他提取方法如微波提取法、酶法提取法。王灵昭等（２００７）研究利用微波提取雨生红球藻中的虾青素，当萃取溶剂为乙酸乙酯／乙醇（１／２，ｖ／ｖ），萃取时间为４．５ｒａｉｎ，萃取功率为５４０Ｗ，液料比为２２０：１时，虾青素的提取率可达１．０２０％。Ｎａｇａｏ等（２００３）利用Ｃａｎｄｉａｄａｒｕｇｏｓａ酶和Ｐｓｅｎｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ酶水解虾青素酯转化为游离虾青素，生物安全性高。５．３虾青素的分离纯化及分析方法５．３．１薄层层析法（ＴｈｉｎＬａｙｅｒＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）薄层层析是一种微量而快速的层析方法。其原理是把吸附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开。通常用硅胶作为一种固相支持物，与水有较强的亲和力而与有机溶剂的亲和力较弱。层析时吸着在硅胶上的水是固定相，而展开溶剂是流动相，当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中分配系数不同时，即能被分离开，通常用比移值（Ｒｆ）来表征组分移动的特性。采用２５％丙酮．７５％正己烷作为展开剂进行薄层层析来分离雨生红球藻中的类胡萝卜素，得到ｐ．胡萝卜素、海胆酮、虾青素酯（６条带）、角黄素、虾青素和叶黄素的色素带，其Ｉ玎值分别是０．９９、０．８７、０．５５－０．８５、０．４４、０．３３和Ｏ．２５。将这些色素带分别剪下后用溶剂洗脱，洗脱后得到纯样品，用氮气吹干后得到纯品（Ｔｏｄｄｅｔａｌｅｔａ１．，２０００）。５．３．２柱层析法（ＣｏｌｕｍｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）该法原理同薄层层析，只是将填料制成层析柱。通常使用硅胶目数为１００—２００目或氧化铝作为填料。已有研究结果表明使用长度为２２．５ｃｍ，直径３０ｒｎｍ的硅胶填充柱纯化雨生红球藻中的虾青素，经流动相将色素过柱分离并洗脱下来，用ＨＰＬＣ结合折光示差检测虾青素的纯度达９８％以上（陈兴才等，２００５）。１７雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究５．３．３高效液相色谱法（Ｈｉｇｈ—ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）目前最常用的色素分离分析纯化方法是高效液相色谱法（舯ＬＣ）。其仪器系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、数据采集与处理系统等部分组成。其工作原理是基子组分在固定相（柱填料）和流动相（淋洗液）中分配系数的微小差异，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附一解吸的分配过程，样品中的各组分将形成不同的迁移速度的谱带而实现分离的新型高效分离技术。目前已建立雨生红球藻中虾青素的反相ＨＰＬＣ（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ．ＰｈａｓｅＨＰＬＣ，ＲＰ－ＨＰＬＣ）分离分析方法，采用二极管阵列检测器（ＤＡＤ）在４７６ｎｎｌ处进行检测，虾青素在１５ｒａｉｎ内得到了较好的分离，雨生红球藻中虾青素的总含量为９．７９～２４．７０（齐安翔等，２００５）。随着人们大规模分离生物活性化合物的需要，制备型ＨＰＬＣ应运箍生。其与分析型ＨＰＬＣ差别在于分离目的不同。在分析型中，需要的是反映样品组成的信息，不需要收集达到特定纯度的馏分，洗提液通常是作为废液来考虑的。僵在制备型ＨＰＬＣ中，为了节省投资和操作费用，必须以最少的时闻生产最大量的产品。ｍｇ·Ｌ以前者要求样品量越少越好，后者为了提高制备量，柱必须“超载”，按照分离一次进样量的多少，制备型ＨＰＬＣ分３种规模，即半制备级ＨＰＬＣ（１０～５０ｍｇ）、克级ＨＰＬＣ（Ｏ．Ｉ—Ｉｇ）和工业级ＨＰＬＣ（２０ｇ’ｆ１）（魏莉等，２００５）。Ｙｕａｎ和Ｃｈｅｎ（２０００）利用半制备ＨＰＬＣ分离纯化雨生红球藻中的虾青素，每克干藻粉制备获得３２．２ｍｇ虾青素，纯度达９４．４％。５．３．４高效逆流色谱（ＨｉｇｈＳｐｅｅｄＣｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＳＣＣＣ）高效逆流色谱是利用溶质在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同，应用色谱层折的方法，将不丽溶质分离。其原理是剩用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的次序，被依次洗脱。在流动相中分配比例大的先被洗脱，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脱（曹学丽，２００５）。Ｌｉ和Ｃｈｅｎ（２００１）利用高速逆流色谱成功分离纯化雨生红球藻中的虾青素，纯度高达９７％。１８第一章绪论６。虽前利用焉生红球藻生产天然虾青素存在的问题雨生红球藻被公认为是自然界中生产天然虾脊素的最好生物，因此规模培养红球藻是获取天然虾青素的最佳途径之一。然而，从目前国际上虾青素微藻生产发展来看，其产业化进程澎存在一系列技术阆题。首先，该藻生产周期长、产藻率较低，同时其自身虾青素含量扔有待进一步提高。其次，虾青素的积累被认为与厚壁孢子的形成有关（Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａｅｔａ１．，１９９１；Ｋｏｂａｙａｓｈｉｃｔａｌ。，１９９１；Ｔａｎｅｔａ１．，１９９５）。在胁迫阶段产生的产品多为微藻厚壁孢子，必须采取相应的破壁技术分离、提取虾青素，这导致生产工艺流程和成本增加，同时也降低了生物利用率。第三，该藻生长对水质及各种、环境因子要求较高，使其生产规模难以扩大。可觅一系列问题融严重阻碍了虾青素的产业化进程。７。本研究的目的、意义及主要内容与研究思路７．１研究目的和意义目前国外已有少数几家公司实现了天然虾青素的微藻生产，在生产技术上形成垄断，导致天然虾青素的市场价格居高不下，而国内仅有荆州天然虾青素公司初具规模，但仍没有实现大规模的工厂化商业生产。因此本研究的目的在于通过培养方式的变革（从光合自养到混合营养或异养培养）以及虾青素的提取工艺等，以期在一定程度上帮助解决薅生红球藻开发和生产中的露临的困难，从两缩短培养周期，克服破壁技术难题，提高虾青素产率、质量及其生物可利用性，进而大幅度降低生产成本，为国内规模化培养雨生红球藻生产虾青素提供科学依据。本研究的开展对加快我国天然虾青素微藻培育技术发展，不断缩小与国际先进水平差距具有较大的现实意义。７。２主要研究内容（１）开展不同培养方式对雨生红球藻的生长和虾青素积累的影响；并尝试利用光生物反应器进行离密度培养，试图为开放式生产池的藻种制备和规模化培养奠定基础；１９黹熙红球藻的培养赦藕囊下青潦的提款、稳定性和戚用研究（２）开展Ｃ０２超临界萃取虾臀素的提取王艺研究；（３）开展雨生纽球藻来源静虾青豢的稳定性爱生物效应耪搽。黜研究思路首先开展遴合异养和混合营养方式的有机碳源研究，并在三种营养方式下《毙会拳养、异养营养、混合蓄养＞，蠡套不鬻受薪率黪半连续培莽模式蓊究，分裂搽避蒌溺培养鸯鼗对蒸生红球藻熬生长期虾毒蠢积累煞影穗。势尝试铡惩竞生物反成器进行高密度培养，试图为开放式生产池的藻种制备和规模化培养奠定基穑。通过戳上培养获褥的藻细臆经Ｃ０２超瓶孬萃取虾青素帮虾篱素酪，获褥褪色素，经皂纯获褥游凄虾青素。最嚣耪步探霉霪露生短塔藻聚源嚣虾毒寨黠繇境因子等懿稳定性以及对舡鹦鹉观赏鱼的着色和机体抗氧化机能力的影响研究。第二章雨生红球藻的培养方式研究第二章雨生红球藻的培养方式研究雨生红球藻作为天然虾青素的最佳来源之一而被广泛重视，成为继螺旋藻、盐藻和小球藻之后的另一种高经济价值的微藻（邱保胜和刘其芳，１９９９ａ；Ｍａｒｇａｆｉｔｈ，１９９９）。合适培养方式是成功开发雨生红球藻的关键技术之（Ｆａｂｒｅｇａｓｅｔａ１．，２００１）。近年来，国内外不同学者在雨生红球藻的生长调控、虾青素的积累机制、虾青素合成的调控及其生物学功能等方面进行了大量的研究（Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａｅｔａ１．，１９９１；ＬｏｒｅｎｚａｎｄＣｙｓｅｗｓｋｉ，２０００；翟兴文，２００２），而关于培养方式的系统研究报道较少。本实验系统研究不同培养方式（营养方式结合培养模式）对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响，最终建立了较适合雨生红球藻的培养方式。并尝试利用光生物反应器培养雨生红球藻，试图为开放式生产池的藻种制备和大规模化生产莫定基础。１材料１．１实验材料雨生红球藻（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ）．从中科院武汉水生生物研究所引进。１．２实验药品及试剂碘化钾（分析纯），碘（分析纯），丙酮（分析纯），去离子水。１．３实验仪器光照培养箱（＠（Ｚ智能型，宁波江南仪器厂）；照度计（ＴＥＳ１３３２Ａ，台湾泰仕公司）高压灭菌锅（ＬＤＺＸ．－４０ＳＢＩ型，上海申安医疗器械厂）；生物显微镜（ＣＸ２１，日本奥林帕斯公司）；可见分光光度计（７２１Ａ型，厦门分析仪器厂）；电热恒温干燥箱（ＧＺＸ．ＤＨ．３０Ｘ３５８，上海跃进医疗器械厂）；２１雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和．陂用研究冷冻离心机（飞鸽ＴＧＬ．１６Ｇ型，上海安亭科学仪器厂）；离心机（８００型，常州国华电器有限公司）；电予天平（ＢＬ６００型，德国赛多利斯系统有限公司）；数控超声波清洗器（ＫＱ。１００ＤＥ型，昆山市超声仪器有限公司）；微量进样器（１００ｐ．Ｌ，美国安捷伦公司）；移液枪（５ｍＬ、ｌｍＬ、２００吐，德国ｂｒａｎｄ公司）；血球记数板（１６ｘ２５，玉环县求精医用仪器厂）；ｐＨ计（便携式ＶＡＲＩＯＰＨ，德国ＷＴＷ公司）；光生物反应器（冬凇Ｌ．Ⅲ篷，烟台高新区海洋生物工程研究所）。２方法２．１雨生红球藻的培养培养温度设为（２３圭１）℃，营养细胞培养阶段的光强设为（１３００－－１６００）ｌｘ，促进虾青素积累的胁迫阶段光强约为（１００００，－，１２０００）ｌｘ。静置培养，每天手摇培养物３—４次，防止粘壁。采用ＢＢＭ培养基，其配方见表２．１。表２．１ＢＢＭ培养基配方Ｔａｂ．２．１ＣｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＢＢＭｍｅｄｉｕｍ成分ＮａＮ０３浓度（ｍｍｏｌ·ｏ’）２．９Ｏ．３Ｏ．４３０．４３１．２９Ｏ．１７０．０３０７０．００７３Ｏ．００４９０．００６３０．００１７０．１８０．１７０．５５０。０１７９ＭｇＳ０４’７Ｈ２０ＮａＣＩＫＥＨＰ０４ＫＨ２Ｐ０４ＣａＣｌ２ＺｎＳ０４·７Ｈ２０ＭｎＣｌ２·４Ｈ２０Ｍ００３ＣｕＳ０４·５Ｈ２０ＣｏＮ０３·６Ｈ２０Ｈ３８０３ＥＤ礅ＫＯＨＦｅＳ０４·７Ｈ２０第二章雨生红球藻的培养方式研究２．２藻细胞数的测定取２ｍＬ藻液，加入Ｏ．２ｍＬ的卢戈氏剂（胁迫阶段细胞计数，不需要固定，省去该步骤），振荡均匀，制片，利用血球计数板计数（仅记录细胞结构完整的细胞数），藻密度计算公式：Ｄｏ（ｃｅｌｌｓ·ｍＬ。１）＝Ｎｏｘｌ．１ｘ１００００其中，Ｎｏ分别为藻细胞总数的计数平均值。２．３细胞平均生长速率的测定细胞平均生长速率为单位时间内单位组织或整体的增长量，按公式Ｋ＝（１ｎＮ２一ＩｎＮ０／（ｔ２一ｔ１）进行计算，其中：Ｎｌ和Ｎ２分别为ｔｌ、ｔ２时刻的细胞数。２．４细胞干重的测定取洗净的离心管，编号后于烘箱中烘烤２ｈ，空气中平衡至恒量，称量后取１０ｍＬ藻液，２个平行，４５００ｒｐｍ离心去除上清液，蒸馏水洗涤２￣３次。置于烘箱内７０℃烘干至恒重，在干燥器中冷却至室温，称量，减量法获得细胞干重。２．５色素的提取取５ｍＬ藻液，４５００ｒｐｍ离心弃上清液，加去离子水洗涤２次，加入２ｍＬ丙酮，玛瑙研钵研磨ｌｍｉｎ（ａｎ少量石英砂），低温离心１５ｍｉｌｌ（１００００ｒｐｍ），保留上清液转移到试管中，避光保存。重复以上操作３～５次，直至藻团呈白色，色素提取完全为止。将色素提取液１３避光保存备分析。０００ｒｐｍ离心１５ｒａｉｎ，上清液于．２０℃密封２．６色素的测定２．６．１总类胡萝Ｉ、素及虾青素的测定将色素提取液于波长为４５０ｎｍ处测定吸光值（Ｊｅｎｓｃｎｃｔａ１．，１９８１），所得吸光值反映溶液中的类胡萝卜素总浓度，以此估算虾青素浓度（以虾青素占类胡萝雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和成用研究卜素的８０％计算）（纪明侯，１９９７）。计算公式如下：Ｃ气∥Ａ４ｓｏＸ１０／２５００ｘｆｆ＝Ｖ辫包ＣＡｘ—ＣＩｅｘ８０％式中：Ｃｘ。为总类胡萝卜素含量（ｍｇ）；ＣＡＸ为虾青素含量（ｒａｇ）＆５０为于波长４５０ｉｌｍ处ｌｃｍ比色皿测得的吸光值；Ｖ为原提取液体积（ｎ也）；ｆ为稀释因子；Ｖｏ为所取藻液体积（ｎ儿）。２．６．２叶绿素的测定将色素提取液依次在７５０、６６４、６４７、６３０ｎｎｌ下测定吸光值，分别为Ａ７５０、Ａ６６４、Ａ６４７、Ａ６３０，按Ｊｅｆｆｒｅｙ－Ｈｕｍｐｈｒｅｙ的方程式计算，可分别得出叶绿素ａ、ｂ、ｃ的含量，三者相加得叶绿素总含量。计算公式如下：（１）丸麓（Ａ＇．＾．－－Ａ７５０）／ｄ（光程，ｃｍ）＂－Ａ＇舅７．－－Ｅ７５０氐６４＝Ａ＇Ｉｘ－－Ａ７５０Ａ６４７＝Ａ＇．ｚ－－Ａ７５０Ａ６３０－＂Ａ’渊ｘ—Ａ７５０（２）Ｃｈｌ—ａ＝１１．８５Ａ６“一１．５４‰７一Ｏ．０８Ａ６３０ｅ挝－ｂ＝一５。４３Ａ戳＋２１。０３Ａ醣７—２。６６Ａ稻ｏＣｌｌｌ—ｃ＝一１．６７Ａ６“一７．６０Ａ６４７＋２４．５２Ａ６３０（３）Ｃｈｉ（ｍｇ‘¨‘）＝（ＣＩｌｌ·ａｔ－Ｃｈｌ—ｂ＋Ｃｈｌ—ｃ）ｘＶｘｌ０００／ｖｏ其中，Ｖ为原提取液体积（越＞；ｖｏ为所取藻液体积（爨Ｌ）。２．７培养方式的研究２．７．Ｉ混合营养条件下的碳源研究以ＢＢＭ配方为基础，分别添加醋酸钠、丙二酸钠两种有机碳源，设置０．２５ｇ＇Ｌ～，Ｏ．５ｇ＇Ｌ～，１．０ｇ＇Ｌ一，２．０ｇ＇Ｌ～，５．０ｇ＇Ｌ。１五个浓度梯度，同时设置浓度为２４第二章雨生红球藻的培养方式研究０即不添加任何有机碳源的空白对照组，即光合自养。每个实验组设置三个平行样。采用２５０ｍＬ锥形瓶培养，接种比例为１：４，接种密度为５．４ｘ１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ一，接种后培养瓶中最终藻液体积为１００ｍＬ，置于光照培养箱中静置培养７ｄ，培养至指数生长期结束后转至高光强条件下，诱导培养１４ｄ后测定单位体积藻粉含量和虾青素含量等指标。２．７．２异养培养条件下的碳源研究以ＢＢＭ配方为基础，分别添加醋酸钠、丙二酸钠两种有机碳源，设置０．２５ｇ·Ｌ～，Ｏ．５ｇ·Ｌ～，１．０ｇ＇Ｌ一，２．０ｇ＇Ｌ一，５．０ｇ＇Ｌｄ五个浓度梯度，同时设置光合自养作为对照组。每个实验组设置三个平行样。采用２５０ｍＬ锥形瓶培养，接种比例为１：４，接种密度为２．１４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ＂１，培养瓶中最终藻液体积为１００ｍＬ，置于光照培养箱中静置培养１０ｄ，至指数生长期结束后转至高光强条件下，诱导培养１４ｄ后测定单位体积藻粉含量和虾青素含量等指标。总体实验方案如表２．２所示。表２．２不同营养方式对雨生红球藻生长及胁迫阶段影响的实验设计方案Ｔａｂ．２．２ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｃｈｅｍｅｆｏｒｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｏｐｈｉｃｍｏｄｅｃｕｌｔｕｒｅｓｔａｇｅｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｖｉａｌｉｓｏｎｔｈｅｔｗｏ２．７．３半连续培养研究由２．７．１获得适合不同培养方式的最佳碳源及其浓度，在此基础上进行选择最佳的营养方式下进行半连续培养模式的研究，分别设置０％，１０％，２０％，３０％，４０％五种更新速率。每组三个平行样。采用２５０ｍＬ锥形瓶培养，接种比例雨擞红球藻的培养及就虾青素的提取、稳定性和应用研究为ｌ：４，接种密度为５．７３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ＂１，培养瓶最终藻液体积为１００ｍＬ。培养至指数生长期后，每２４ｈ按不同更新率取出部分藻液予高光下胁追，并加入相应体积的培养液置光照培养箱孛静曼培养。半连续培养８ｄ薏，全部进入菇光胁迫７ｄ蜃测定单位体积藻粉含量和虾青素含量等指标。２。８光生物反应器的离密度培养剩用ＮＨＬ。ＩＮ型光生物反应器进行蘑生红球藻獒培养，考察培养过程孛缨胞生长及虾青素的积累情况，探索影响高密度培养的因素等。反应器由发酵罐、光照系统、灭菌系统、通气系统、控制系统四部分组成；其中发酵罐材质为硼硅玻璃（含１３％三氧纯二硼），嚣篱状，内径麓９ｃｍ、高６０ｃｍ，培养体积约为１５Ｌ；发酵罐上端有一接种ｎ／ａｎ料口（内径为２．８ｅｒａ），用于接种和加料；侧面有～出料口（内径为１．８ｅｒａ），用于藻液采收；光照系统由６支１２Ｗ日光灯并联组成，可通过控巅工作灯管数量来调节光强；灭菌系统壶高蓬蒸汽发生器组成；通气系统由空气压缩机及空气过滤装置组成：自动控制系统配有温度、ｐＨ值、溶氧电极、搅拌器及其相应的控制装置（加热／冷却循环装置，酸碱泵），可自动控制并显示系统滏度、螬ｌ值、溶解氧彝搅拌速度。实验前利用高压蒸汽发生器进行高压蒸汽灭菌处理ＢＢＭ培养基，冷却室温后加藻液至１１．０Ｌ，接种密度分别为２．３×１０４ｃｅｌｌｓ－ｍＬｌ和０．８４×１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ～。营养缨胞培养除段翻胁迫阶段的平均光强分裂为（１．１～ｌ。３＞ｋｌｘ和（１∞ｌ１）ｋｌｘ。实验中温度控制在２３．５℃，ｐＨ值控制在７．７５－｝．０．１０左右，单礼出气，通气速率约为２．０Ｌ·ｍｉｎ＂‘。其他培养参数的设定如装２．３所示。露对在光照培养藕孛霜２５０ｍＬ酶三角烧瓶培养作为对照组，设鬟３个平行。培养周期弱光生物反碰器，培养过程用ｐＨ计测定培养过程ｐ｝ｌ的变化情况。表２．３光生物反应器的培养参数设定项目觜誉乏麓乒鬻？参慧怒鬻会温度＜℃）ｐＨ２３．５７．８１．５Ｏ．１０。１０．１６０３０５Ｔａｂ．２．３Ｓｅｔｕｐｏｆｃｕｌｔｕｒｅｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｎｔｈｅｐｈｏｔｏ－ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ３０５１第二章雨生红球藻的培养方式研究２．９数据分析利用ＳＰＳＳｌ３．０对数据进行单因素方差分析，多重比较分析与差异显著性检验。３结果与讨论３．１混合营养培养３．１．１醋酸钠对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响图２．２为不同醋酸钠浓度下，雨生红球藻的生长情况比较。由图２．１可知，当醋酸钠浓度大于５ｇ·Ｌ以时，藻密度基本没有增加，甚至有下降的趋势，其平均生长速率为负数（见图２．１ｂ），最终藻密度明显低于其它实验组（庐０．０５），表明高浓度的醋酸钠对雨生红球藻的生长有负作用，严重抑制雨生红球藻生长。当醋酸钠浓度为Ｏ．２５ｇ·Ｌ．１～５ｇ·Ｌ－１，与对照组相比，藻密度均显著增加（ｐ＜ｏ．０５），平均生长速率均大于对照组（见图２．１ｂ），表明较低浓度的醋酸钠对雨生红球藻的生长具有一定的促进作用，尤以１．０ｇ－Ｌｄ最为显著，平均生长速率达为０．３０ｄ－１，最终藻密度为４５．４ｘ１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ＂１，较初始密度提高了７４１％，比对照组提高了４０％。而醋酸钠浓度为２．０ｇ－Ｌ。１实验组与１．０ｇ＇Ｌ以实验组对细胞生长的促进作用没有显著差别（矿Ｏ。０５）。因此初始醋酸钠浓度为１．０ｇ·Ｌ。１或２．０ｇ－Ｌ‘１最有利于雨生红球藻的生长。研究还发现添加不同浓度醋酸钠的实验组，其细胞干重和虾青素含量均显著高于对照组（卿．０５），且不同浓度对雨生红球藻细胞干重和虾青素含量的影响的差异显著（胙０．０５）。随着醋酸钠浓度的升高，细胞干重和虾青素含量均呈先增加后减少的趋势（见表２．４）。当添加醋酸钠浓度为０．２５ｇ·Ｌ。１时，与对照组相比，细胞干重和虾青素含量的增幅较小；当醋酸钠浓度大于０．２５ｇ＇Ｌ。１时，细胞干重和虾青素含量均有较大幅度的提高。其中当醋酸钠浓度为１．０ｇ＇Ｌｏ时，细胞干重和虾青素的含量最高，分别为０．６２０－ｚ：０．０３０ｇ．Ｌｄ和２０．６６９－土：０．３０５ｍｇ·Ｌ～，是对照组的２．３５倍和２．８９倍。可见添加１ｇ·Ｌｄ的醋酸钠不仅对营养阶段细胞的生长促进作用最为显著，且能够明显提高生物量并促进后期虾青素的积累。亘竺堑壁蓬箜堕茎墨茎堑重耋塑塑墼：整窒丝塑些旦婴壅●＿＿＿●＿＿＿—●＿Ｉ＿＿＿●●●－—●＿－—●—●－－＿—－－———＿。—＿●——－－—－●＿＿＿———————＿——＿—。●●’—————。＿——Ｉ＿——＿———————————一一５０．０４５．０４０．０３５．０３０．Ｏ２５．０２０．Ｏ．毫．×越龆霉最１５．０１０．０５．ＯＯ．００ｌ２３４５６７时间（ｄ）０．４０Ｏ．３２＾０．２４３０．１６瓣０．０８翌ｏ．００赳．０．０８埘１｝．０．１６．０．２４．Ｏ．３２图２．１醋酸钠对雨生红球藻生长的影响Ｔａｂ．２．１ＥｆｆｅｃｔｓｏｆａｃｅｔａｔｅｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｕｎｄｅｒｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｅ表２．４醋酸钠对细胞干重和虾青素产率的影响Ｔａｂ．２．４ＥｆｆｅｃｔｓｏｆａｃｅｔａｔｅｏｎｂｉｏｍａｓｓａｎｄａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ醋酸钠浓度（ｇ。Ｌ。１）——葡藤再莲甄五丐—Ｊ—Ｉ：：１＂１１／Ｊ＂幂吾票声萃五万ｐｌｕｖｉａｌｉｓｕｎｄｅｒｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃ…●ｈ对照０．２５０．５１．０２．００．２６３＋０．０３８０．３１０士０．０１００．４１０士０．０３００．６２０－ａ：０．０３００．４９０－ａ：０．０３０７．１４２．ｊ：０．１２５８．６６９－ａ：１．０３７１５．８０２＿ａ：０．６２６２０．６６９－ａ：０．３０５１８．１７３士０．７８９二—●－ｌ——－●—－＿●●—－—’＿——＿——＿－－——＿＿－●●－●●＿＿＿＿＿＿＿—－———●●—－－●●－＿－＿———————————一一！：Ｑ２８一一二一第二章雨生红球藻的培养方式研究３．１．２丙二酸钠对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响不同丙二酸钠浓度下，雨生红球藻生长情况如图２．２所示。由图２．２可知，当丙二酸钠浓度大于２．０ｇ＇Ｌ～，细胞密度显著低于其它实验组（则．０５），其中当浓度为５ｇ·Ｌｄ时，与对照组相比，藻密度没有增加反而下降接近于０，平均生长速率为负值（见图２．２ｂ），表明高浓度的丙二酸钠对雨生红球藻有强烈的抑制作用。而当浓度为２．Ｏｇ·Ｌ以时，雨生红球藻生长没有受到抑制，但生长极其缓慢，７ｄ后的最终密度为７．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬｌ～，比初始密度（５．４ｘｌＯ％ｅｌｌｓ·ｍＬ。１）仅提高３８％，且平均生长速率（Ｏ．０５）远小于对照组（Ｏ．２６ｄ。１）；而当丙二酸钠浓度为０．２５ｇ。Ｌ‘１和０．５０ｇ‘Ｌｄ时，最终藻密度与对照组相当，没有显著差别（ｐ＞０．０５），表明低浓度的丙二酸钠对雨生红球藻的促进作用不大。当浓度为１．０ｇ＇Ｌ～，最终藻密度为４０．９ｘ１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ一，较初始密度提高６５７％，较对照组提高２３％，ｄ－１，表明１．０ｇ＇Ｌｄ丙二酸钠显著高于对照组（刚．０５），平均生长速率高达０．２９对雨生红球藻的生长具有明显的促进作用。此外，由表２．５可知，添加不同浓度丙二酸钠的细胞干重和虾青素含量比对照组均有所提高，但随着丙二酸钠浓度的升高，细胞干重和虾青素含量均呈先增加后减少的趋势。当添加丙二酸钠浓度为０．２５ｇ·Ｌ‘１时，细胞干重和虾青素含量与对照组相当，二者没有显著差别（矿０．０５），表明添加低浓度的丙二酸钠对细胞干重和虾青素含量的促进作用极弱；当丙二酸钠浓度大于Ｏ．２５ｇ·Ｌ以时，细胞干重和虾青素含量与对照组相比，均有较大幅度的提高，促进作用显著（脚．０５）。尤以醋酸钠浓度为１．０ｇ－Ｌ‘１时促进作用最为显著，细胞干重和虾青素的含量均最高，分别为０．４３７４０．０４７ｇ＇Ｌ。１和１６．３３９－ａ：０．５６９ｍｇ·Ｌ～，比对照组提高的６６％倍和１２８％。而丙二酸钠浓度为Ｏ．５ｇ·Ｌ。１和２．０ｇ．Ｌｄ对细胞干重的促进效果差异不显著（矿０．０５），而二者对虾青素的积累作用中，浓度为２．０ｇ·Ｌ。１明显高于０．５（∥０．０）。ｇ－Ｌｄ因此，以上实验结果表明添加ｌｇ－Ｌ‘１的丙二酸钠对营养阶段细胞的生长和虾青素的积累均最为有利。雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和成用研究４５．Ｏ４０．０３５．０３０．Ｏ２５。Ｏ２０．０１５．Ｏ１０．Ｏ５．ＯＯ。ＯＯｌ２３４５６７时阀（ｄ）０．３５Ｏ．２５３０．１５姗瑙０．０５业替．０．０５竣｝’．０．１５一Ｏ．２５图２．２丙二酸钠对雨生红球藻生长的影响Ｆｉｇ．２．２ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍａｌｏｎａｔｅｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｕｎｄｅｒｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃ表２．５丙二酸钠对细胞干重和虾青素含量的影响Ｔａｂ．２．５Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍａｌｏｎａｔｅｏｎｂｉｏｍａｓｓａｎｄａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆ丙二酸钠浓度（ｇ·Ｌ。１）—１丽鬲甄石ｒ—１鬲綦醑荪两指标丝堡竺丝些竖！坚里堡丝星！丝堕！垫竺翌坚竺！塑坚！！艘望塾！！第二章雨生红球藻的培养方式研究３．１．３两种碳源对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响比较不同碳源同等浓度条件下对雨生红球藻生长的影响如图２．３所示，当碳源浓度较低时（卯．５ｇ·Ｌ以），醋酸钠和丙二酸钠实验组的藻生长曲线基本均与对照组重合，表明低浓度的碳源对雨生红球藻的生长促进作用极弱（见图２．３ａ）。当碳源浓度为１．Ｏｇ·Ｌｏ时，添加碳源均促进了雨生红球藻的生长，其中醋酸钠的促进作用更加显著（见图２．３ｂ）；而当碳源浓度为２．０ｇ－Ｌ。时，以醋酸钠为碳源的实验组中最终藻细胞密度高于对照组；而以丙二酸钠为碳源的实验组中细胞密度反而大大降低。当碳源浓度为５．Ｏｇ·Ｌ．１时，添加碳源都抑制了雨生红球藻的生长（见图２．３ｅ），表明高浓度的碳源对雨生红球藻生长均有抑制作用，但醋酸钠的抑制作用小于丙二酸钠。此外，不同碳源各浓度下的细胞干重和虾青素含量如图２．４和图２．５所示，各浓度下，添加碳源后，二者较对照组均有提高，且以醋酸钠为碳源的实验组中细胞干重和虾青素含量均高于以丙二酸钠为碳源的实验组，且以ｌｇ·Ｌ－１浓度下最为显著。综上比较发现，添加充足的有机碳能明显的促进红球藻的生长和虾青素的积累（Ｂａｒｂｅｒａ，ｅｔａ１．，１９９３；Ｔｒｉｐａｔｈｉｅｔａ１．，２００２），因为有机碳源的加入为雨生红ｅｔ球藻细胞生长阶段提供了营养补充，从而促进生长（Ｊｅｏｎａｌ，２００６），而且在进入胁迫阶段后，额外的碳造成相对的氮缺乏，高碳氮比，与高光复合胁迫，从而引发细胞包囊化形成厚壁孢子，积累虾青素（Ｋａｋｉｚｏｎｏｅｔａ１．，１９９２；Ｔａｎ１９９５；Ｊｅｏｎｅｔｅｔａｌ，ａ１．，２００６）。两种碳源均在１．０ｇ－Ｌ。１时对雨生红球藻生长和虾青素的积累的促进效果最为显著，且醋酸钠的作用要优于丙二酸钠，可见醋酸钠是混合营养条件下适合微藻生长和虾青素积累的最佳碳源。庄惠如等（２０００）研究了雨生红球藻混合营养培养生长对碳源及碳源浓度的需求，结果表明醋酸钠是混合营养培养的最适碳源，最佳浓度为Ｏ．５～１ｇ·Ｌ～，与本研究结果相似；Ｊｅｏｎ等（２００６）研究了光强与醋酸钠的对雨生红球藻中虾青素诱导作用，表明醋酸钠的最佳浓度为３０ｍＭ，高于与本实验结果，可能与藻种和培养基的不同有关。另外Ｏｒｏｓａ等（２００１）研究则认为，丙二酸盐作为碳源的效果优于醋酸盐，且高浓度下对红球藻的抑制作用小于醋酸盐，与实验结果恰恰相反，原因仍有待于进一步研究证实。３ｌ雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和威用研究此外，研究还发现若加入过量的有机碳，红球藻的生长受到严重抑制，与Ｏｒｏｓａ等（２００１，２００５）研究相似，这是因为高浓度的碳会干扰光合作用的过程，抑制叶绿素的合成，从而抑制了细胞的生长（Ｊｅｏｎｅ童ａ１．，２００６）。值｛！孽注意的是，２．０ｇ．Ｌ。１的丙二酸钠在营养阶段抑制了雨生红球藻细胞的生长，但是在经高光胁迫后藻生物量和虾青素的含量却高于对照组，这可能是因为高浓度的丙二酸钠对黍生红球藻产生毒害作用（Ｏｍｓａｅｔａ１．，２００５），但不至于完全致死，因而细胞增殖缓慢，碳的低消耗使细胞内碳氮比维持在一个相对较高的水平，较早地触发了细胞内类胡萝卜素合成作用，从而促进细胞内虾青素的累积，具体的原因有待于进一步研究。＾≥６０．０４０．０２０．Ｏ０．００１２３４５６７０１２３４５６７ｔ／ｄ们。量“ｏｏ重）＾专。６０．０６０．０４０．０２０．ＯＯ。Ｏ（ｄ）２．０ｇ－Ｌ＂‘崔翟４鲫苫０．０耋毛２０·０６ＯＯ４ＯＯ－－４１－－－－醋酸钠釜星∞＿鼍。弋Ｈ２ＯＯ０Ｏｌ２３４５６７＋丙二酸钠＋对照８斑第二章雨生红球藻的培养方式研究④平均生长速率０．４００．３００．２０口添加醋酸钠■添加丙二酸钠．０．３０图２．３醋酸钠、丙二酸钠对雨生红球藻生长影响的比较Ｆｉｇ．２．３ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｃｅｔａｔｅａｎｄｍａｌｏｎａｔｅｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ：ｍａｃｅｔａｔｅ；ｔｍａｌｏｎａｔｅ；▲ｃｏｎｔｒｏｌ０．７００，、０．６００加醋酸钠加丙二酸钠■０．５００Ｖ０．４００ｂＤ州０．３００最０．１０００．０００生０．２００∞对照Ｏ．２５０．５１．０２．０碳源浓度（ｇＬ．１）图２．４醋酸钠、丙二酸钠对细胞干重的影响比较Ｆｉｇ．２．４ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｃｅｔａｔｅａｎｄｍａｌｏｎａｔｅｐｌｕｖｉａｌｉｓｏｎｂｉｏｍａｓｓｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ３３雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究２５０００＾ｐ２ＯＯ０Ｏ口添加醋酸钠添加丙二酸钠普１５００Ｏ１ＯＯ００－蜩Ｉ缸脶扯旨５ＯＯＯ０Ｏ０Ｏ一■■■０．５１．０２．０对照０．２５碳源浓度（ｇ·Ｌ－１）图２．５醋酸钠、丙二酸钠对虾青素积累的影响Ｆｉｇ．２．５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｃｅｔａｔｅａｎｄｍａｌｏｎａｔｅｏｎｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ３．２异养培养无光条件下，不同碳源对雨生红球藻生长的影响如图２．６所示。异养培养条件下，雨生红球藻的生长曲线与光合自养相似，只是指数生长期不明显，藻生长十分缓慢，所有实验组的最终藻密度均显著小于光合自养（刚．０５）；当有机碳源浓度为５．０ｇ·Ｌ．１，平均生长速率均为负值（见图２．６ｃ），表明无光条件下高浓度的碳源对雨生红球藻的生长有强烈抑制作用，其中丙二酸钠（．０．１６４ｄ。）的抑制作用大于醋酸钠（－０．１４４ｄ．１）；而当浓度小于５．Ｏｇ·Ｌ以时，各浓度下的平均生长速率虽为正值但均小于光合自养，表明添加低浓度的碳源对雨生红球藻生长具有一定的促进作用，但培养效果仍不如光合自养。以醋酸钠为碳源（见图２．６ａ），当浓度为２．０ｇ·Ｌ‘１时，最终藻密度为４．９８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ一，显著高于其它实验组（ｐ＜Ｏ．０５），较初始密度（２．１５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ。１）提高了１３２．７％，表明无光条件下添加２．０ｇ＇Ｌｏ醋酸钠能促进雨生红球藻的生长；当醋酸钠浓度为０．２５ｇ·Ｌ一，０．５ｇ·Ｌ～，１．０ｇ·Ｌ．１时，各组最终藻密度相当，没有显著差异（矿０．０５），表明三者对雨生红球藻的生长的第二章雨生红球藻的培养方式研究促进作用相同。因此以醋酸钠为碳源的异养培养条件下，醋酸钠的最佳浓度为２．０ｇ－Ｌ一。以丙二酸钠为碳源（见图２．６ｂ），当浓度小于２．０ｇ＇Ｌｄ时，最终藻密度均高于初始密度，且随着丙二酸钠浓度的增加而增加，但增幅不明显。统计分析可知当丙二酸钠浓度为０．２５ｇ·Ｌ～，０．５ｇ·Ｌ．１时，二者最终藻密度没有显著差别（ｐ＞０．０５）；当丙二酸钠浓度为１．０ｇ·Ｌ－１时，最终藻密度最高，为３．１８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ～，较初始密度（２．１５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ＂１）提高了４８．５％。与浓度２．０ｇ·Ｌ‘１的最终藻密度相当，没有显著差别（矿０．０５），因此以丙二酸钠为碳源的异养培养条件下，１．０ｇ－Ｌ。或２．０ｇ＇Ｌ。１丙二酸钠对雨生红球藻的生长最为有利。此外比较各浓度下的平均生长速率，醋酸钠实验组均显著高于丙二酸钠实验组（见图２．６ｅ）。因此与丙二酸钠相比，黑暗条件下添加醋酸钠作为碳源更有利于雨生红球藻的生长。综上，醋酸钠为异养条件下的合适碳源，其最佳浓度为２．０ｇ．Ｌ～。在碳源的选择上，本研究结果与庄惠如等（２０００）研究结果一致，均认为醋酸钠是异养化能的最佳碳源；但其作用浓度的研究结果稍有差异。庄惠如等（２０００）研究表明在黑暗条件下，维持雨生红球藻进行化能异养的适宜醋酸钠浓度范围为１．０－－－１．５ｇ·Ｌ一，略小于本研究结果。Ｈａｔａ等（２００１）研究表明醋酸盐浓度在１０－－３０ｍＭ之间时细胞生长速率无明显差异，与本研究结果相似，在０．５￣２ｇ·Ｌ一，细胞生长速率差异不显著。此外还发现，无光条件下，高浓度的醋酸钠对雨生红球藻的生长产生毒害，与已有研究结果相似（庄惠如等，２０００；Ｈａｍｅｔａ１．，２００１）。有人认为获得微藻的高密度培养方法之一是进行异养培养，原因在于异养培养方式避免了光自养培养过程中光抑制或光限制等问题，且降低了能耗，节约了成本，为工业化大规模高密度培养微藻奠定了基础（（；ｈｅｎＡ，１９９６）。目前已成功应用连续异养方法培养Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ获得了高蛋白产量（Ｏｇｂｏｎｎａｅｔａ１．，１９９７）及维生素Ｅ的生产（Ｏｇｂｏｎｎａｅｔａ１．，１９９９）．。借鉴其他微藻异养培养方法，Ｈａｔａ等（２００１）对连续异养的条件（温度、ｐＨ、醋酸钠浓度）进行优化，从而使细胞在游动细胞阶段保持较长时间，继而获得高密度。本实验中异养培养条件下获得的结果不佳，异养培养雨生红球藻的条件仍有待于进一步研究。雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究１２．ＯＯ１０．ＯＯ８．ＯＯ６．００４。ｏｏ２．００．黾Ⅱ譬×谜帮甓暴Ｏ．ＯＯＯ■ｌ２＾，、，）７，ｋｏｏ９●ｌＯ４时闻１２。００ｄ６＞１０．００８．００６．ＯＯ４．ＯＯ翟．≮避稍墓暴２．∞Ｏ。ＯＯＯ２，Ｊ７ｏｏ９ｔｌＯ４时问（６∞０．２２００．１７０，、Ｏ．１２０３０．０７００２００３００８０１３０鐾。必０娶。电ｏ．Ｏ．１８０图２．６异养条件下不同碳源对雨生红球藻生长的影响Ｆｉｇ．２．６ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｕｎｄｅｒｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ第二章雨生红球藻的培养方式研究３３三种营养方式的比较在上述实验基础上，选择醋酸钠浓度为１．０ｇ·Ｌ‘１和２．０ｇ－Ｌ。１分别作为雨生红球藻混合营养生长和异养生长的初始碳源浓度。三种不同营养型的生长曲线如图２．７所示，各生长指标测定结果见表２．６。结果表明在光照条件下，雨生红球藻的混合营养培养效果优于光合自养培养，其生长速率、生物量（细胞干重）和虾青素含量分别提高了３５．５％、２４．５％和２０．６％。在黑暗条件下，雨生红球藻能利用醋酸钠作为唯一的碳源和能源进行化能异养生长，其生长速率（Ｏ．１３６ｄ．１）远小于光合自养（Ｏ．２１４ｄ－１），但在生物量和虾青素含量上，与光合自养差别并不大。已有研究发现混养条件下，ｌ％的醋酸钠为碳源均能显著提高虾青素的积累，是对照组（光合自养）的３倍（Ｏｒｏｓａｅｔａｌ，２００１）。异养条件下，盐胁迫的雨生红球藻细胞内虾青素含量仅为对照组（光合自养）的四分之一（Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９７）。雨生红球藻利用重碳酸盐或Ｃ０２进行光合自养，虾青素的含量（７７．２ｍｇ·Ｌ‘１）是以醋酸钠为碳源异养培养条件下的４．４倍（Ｋａｎｇｅｔａ１．，２００５）。可见３种营养方式的培养效果顺序为混合营养＞光合自养＞异养培养，本实验结果基本证实了这一结论，混合营养培养条件下，虾青素的含量为２０．３０４＋０．７０５ｍｇ·Ｌ～，分别是光合自养和异养培养的１．２１倍和１．３６倍。庄惠如等（２０００）研究发现雨生红球藻的混合营养生长过程，光合作用与醋酸钠的氧化代谢同时并存，混合营养生长的生物量几乎是光合自养和异养培养的总和（Ｋｏｂａｙｓｓｈｉｅｔａ１．，１９９２），与本研究结果相似但稍有差异，其不同营养方式下的生物量及虾青素的含量均低于本实验研究结果，与本实验中的接种密度较高有关，由于有机碳源的加入容易带来细菌污染，相对较高的接种密度有利于培养过程中产生种群优势，抑制其他微生物的生长，从而获得较佳的培养效果。混合营养方式培养雨生红球藻是对光合自养传统培养方式的革新（ＳｔｅｉｎＪ．Ｒ，１９７５）。此外研究还发现，异养培养条件下的生长情况较差，但最终的生物量却几乎和光合自养接近（见表２．６），与庄惠如等（２０００）研究结果类似，这可能是因为异养培养避免了光合自养过程中的光抑制和光限制等问题（Ｃｈｅｎ，１９９６），且醋酸钠的存在除了作为异养生长的碳源和能源外，在某种程度上造成相对缺氮，从而诱导虾青素的积累，使得数目不多的藻细胞内虾青素显著增加。３７雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和威用研究１２．ＯＯ＾１０。∞毫８．００ｎｏ“Ｘ６．００Ｖ餐４．００翼熏２．００Ｏ．００ｌ２３４５６７８９１０ｌｌ时闻（ｄ）图２．７不同营养方式对雨生红球藻生长的影响Ｆｉｇ．２．７Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｏｐｈｉｃｍｏｄｅ０１１ｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ表２．６雨生红球藻在不同营养方式下的各指标比较Ｔａｂ．２．６ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅａｃｈｉｎｄｅｘｆｏｒＨ．ｐｌｕｖｉａｌｉｓｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｏｐｈｉｅｍｏｄｅ３．４半连续培养模式研究３．４．１不同更新率对营养阶段细胞生长的影响图２．８为半连续培养模式下的藻密度和日藻量随时间变化图，统计分析得各更耨率对雨生红球藻的生长的影响均有显著差别（／７＜０。０５）。由图２．８中可以看出，混合营养条件下，随着半连续培养的进行，ｌＯ％和４０％更新率的藻细胞密度几乎呈直线下降趋势，但最终藻密度（２４．６６ｘ１０４３Ｓｃｅｌｌｓ·ｍＬ～，７．３８ｘ１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ。１＞第二章雨生红球藻的培养方式研究高于初始接种密度（５．７３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ。１），但显著低于对照组（０％更新率，６．５８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ‘１）；而２０％和３０％更新率的细胞密度则先增加后减小，半连续培养至第４天，细胞密度均达到峰值，分别为６．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬｄ和７．１８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ～，是初始接种密度的１１倍和１２．５倍。２０％更新率组的峰值细胞数与一次培养模式下最终密度（６．５８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ＂１）相当，３０％峰值细胞数较一次培养模式最终密度提高１２％。半连续培养７ｄ后，不同更新率组最终藻密度大小顺序为３０％＞２０％＞１０％＞４０％。就日总藻量而言（见图２．８），随着半连续培养时间的延长，１０％更新率组日总藻量几乎没有增加，反而有小幅下降；４０％更新率组日总藻量只有小幅增加；２０％更新率组日总藻量在半连续培养前４ｄ平稳增加，此后基本持平；３０％更新率组日总藻量在半连续培养期间呈显著增加趋势，最终总藻量高达１８．１７ｘ１０７ｃｅｌｌｓ，分别较一次培养模式（８．４２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ），１０％更新率组（５．４４ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）、２０％更新率组（１１．８９ｘｉ０７ｃｅｌｌｓ）、４０％更新率组（８．２７ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）提高１１５％，２３４％、５３％、１２０％。半连续培养７ｄ后，不同更新率组最终总藻量大ｄ＇Ｊ颐序为３０％＞２０％＞４０％＞１０％。其中４０％更新率组虽然最终藻密度最低，但由于其更新率大，最终藻液体积远远大于一次培养和ｌＯ％更新率组，因此最终总藻量与一次培养相当，并高于１０％更新率组。综上可见在混合营养的半连续培养条件下，过低或过高的更新率均不利于雨生红球藻细胞的生长，半连续的更新率为３０％时，培养效果最佳，２０％次之，１０％和４０％较差。研究表明为使雨生红球藻的营养阶段获得高生物量，充足的营养盐浓度是必须的，为此一定的更新率对于营养盐浓度的维持是重要的（Ｆ￡ｉｂｒｅｇａｓｅｔａ１．，２００１）。随着培养的进行，营养盐逐渐消耗，过低的更新率（１０％）不足于补充其细胞生长所需的营养，导致营养盐限制，较早进入虾青素积累阶段，因此生长效果不佳；而过高的更新率（４０％）下，营养盐过剩，细胞来不得及利用便被转移至胁迫阶段，因此生长效果差。只有适中的更新率（２０％、３０％）下营养盐的补充和利用相对均衡，既不出现营养盐限制也不出现营养盐过剩，细胞生长情况较好，其中尤以３０％更新率下的培养效果最佳。Ｆｆｉｂｒｅｇａｓ等（２００１）研究了ｌＯ％，２０％，３０％，４０％更新率对生长的影响，结果表明２０％更新率下获得最大生物量，与３９雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和殿用研究本实验结果稍有差异，可能与营养方式的不同有关，前者是在光合自养条件下，而本实验中是在混合营养条件下，之前的研究表明混合营养方式优于光合自养，纲胞的快速生长导致营养盐的利用速率较快，唯有较高的更薪率才笼保证营养盐的供应，因此本实验中最佳培养效果对应的更新率较高。Ｏ５Ｏ５ＯＩ对照组总藻量（ｏ％更新率）控Ｏ¨Ｏ＋ｌｏ％更新率藻密度囫１０％更新率总藻量＋２嬲更额率藻密度２０％更薪率慧藻量目３０％更新率总藻量—卜３０％更新率藻密度４０％更新率总藻量—＇—４０％更新率藻密度憾０∞∞加８卜ｏ×５Ｏ５Ｏ５ＯＳ０嘲麟躜ｒｒＴ耱∞赡∞簦坩０＇２３４５６７一．【，廿巷一×一越龆繁５５Ｏ２５ｏＯ对照半连续培养时间（ｄ）图２．８混合营养半连续培养模式对雨生红球藻生长的影响Ｆｉｇ．２．８Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｅｍｉ－ｃｏｎｔｉｎｕｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｕｎｄｅｒｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃ３．４．２不简更新率对胁迫阶段各指标的影晌（１）细胞存活率无论更新率大小，所有半连续培养的实验组转入高光胁迫后细胞密度均没有明显降低。半连续培养模式下，藻缨胞的平均存活率均显著高于一次培养（见表２．７）。此外，不同更新率下的存活率没有显著差异（矿Ｏ。０５）。众多学者的研究表明，高光强可以诱导红球藻快速合成虾青素，但光强过高也会导致微藻的大量死亡（Ｂｏｕｓｓｉｂａｅｔａ１．，１９９２；Ｈａｒｋｃｒｃｌａ１．，１９９６ｂ）。时勇和应巧兰（２００２）对雨生红球藻７９７株的研究发现，雨生红球藻在强光下培养两天后的死亡率达８６．３％。本研究中一次培养的死亡率（７３％）与其相当，而半连续培养模式下的死亡率（１９～２３％）骧显降低，表明半连续培养模式下雨生红球藻对４０第二章雨生红球藻的培养方式研究高光胁迫的适应性更强，与齐安翔（２００６）研究结果相似。（２）藻粉总产量及产率半连续培养条件下的藻粉干重普遍高于一次培养，各更新率下（１０％，２０％，３０％，４０％）的藻粉干重分别较一次培养模式（８２．９４ｍｇ）提高１５１％，３３８％，４１８％，２７５％，可见半连续培养模式下均可以显著提高藻粉干重，其中以３０％更新率组的藻粉增重最为显著。但由于采取的模式不同，最终各组所得的藻液体积亦有不同，因此不能仅通过考察藻粉总重来判断两种模式的优劣，有必要对单位体积的藻粉产量进行比较。由表２．７可知，与一次培养模式下相比，所有更新率下的藻粉产率亦均显著高于一次培养（Ｏ．６５ｇ·Ｌ。１）（触．０５），表明了半连续培养模式较一次培养更有利于雨生红球藻生物量的累积。通过各更新率组两两之间的差异显著性分析发现１０％和３０％更新率组对藻粉产率的影响差异不显著（矿Ｏ．０５）。此外值得关注的是，在３０％更新率下藻粉总产量最高，而最高的藻粉产率则在２０％的更新率下获得。因此可以推断更新率与生物量之间的变化规律必然存在一个契合点，使得培养所得的藻粉总产量与单位体积藻粉产量同时达到更为理想的状态，但这个契合点所对应的更新率，有待通过细化更新率作进一步研究确定。（３）虾青素的积累情况由表２．７可以看出各更新率下的虾青素总产量均显著高于一次培养，且不同更新率下的虾青素总产量大４，Ｊ顿序为：３０％＞２０％＞４０％＞１０％。与营养阶段结束时最终总藻量变化是一致的。可见虾青素的积累在很大程度上取决于营养阶段获得的生物量大小，生物量越大，虾青素积累越多。２０％和３０％更新率条件下营养阶段的最终总藻量较高，分别为１１．８９ｘ１０７ｃｅｌｌｓ和１８．１７ｘ１０７ｃｅｌｌｓ，因此胁迫后的最终虾青素总产量亦较高，分别为５．８０ｍｇ，和８．４２ｍｇ，分别是一次培养（１．５９ｍｇ）的３．６５倍和５．３０倍。另外，虽然一次培养模式下最终总藻量（８．４２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）高于１０％更新率组（５．４４ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）和４０％更新率组（８．２７ｘ１０７ｃｅｌｌｓ），但由于其胁迫阶段的死亡率太高，因此实际生物量反而不高，从根本上导致虾青素总产量低下。除了营养阶段生物量的主导作用外，第二阶段的胁迫条件对虾青素的积累也十分关键。在营养阶段生物量较４０％更新率（８．２７ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）低的１０％更新率组（５．４４ｘ１０７ｃｅｌｌｓ），其虾青素产率（１８．３５ｍｇ·Ｌ０）反而显著高于４０％更新率组（１４．４８ｍｇ。Ｌ一）（∥０．０５）。可能是因为在胁迫光强和胁迫时间相同的情况下，虾４１雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和废用研究青素的生物合成更多是由营养盐缺乏诱导的。研究表明虾青素只有在细胞停止分裂和培养液中的氮耗尽时才积累（ＹｏｎｇａｎｄＬｅｅ，１９９１；Ｈａｇｅｎｅｔａ１．，１９９４）。因此更薪率越低，营养盐消耗越快，虾青素积累便越早，胁迫时闻显褥相对较长，因而产率相对较高。Ｆ反ｂｒｅｇａｓ等（２００１）研究表明胁迫时间的长短影响虾青素的产率，高更新率下（４０％）胁迫时间要长达１５ｄ以上，而本实验中仅胁迫７ｄ，因此４０％更新组的虾青素产率较低可能也与胁迫时闻不够有关。统计分析表明２０％和３０％对虾青素产率的影响差异不显著（矿Ｏ．０５），因此半连续模式下２０％或３０％更新率均有利于虾青素的积累。表２．８列出了国内井相关研究绐采，啦表２．８比较可知本实验半连续培养获德的虾青素含量普遍高于其他雨生红球藻～次培养的结果，表明与一次培养模式相比，半连续培养是更适合雨生红球藻培养的模式。理论上讲，混合营养培养效果优于光合自养，之前的实验也证实了这一点。丽本实验中混合营养方式下的半连续研究结果较Ｆｆｉｂｒｅｇａｓ等（２００１）研究结果偏低，且仅与齐安翔（２００６）研究结果相当。通过分析比较发现，实验过程中显著的差别在于胁迫时间，其分别为１４ｄ和１５ｄ，而本实验中的胁追时间仅为７ｄ，因此培养效果的不济可能是由胁迫时闻的不足导致的，有待于进～步探究。表２．７半连续模式下胁迫阶段各指标比较Ｔａｂ。２．７ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅａｃｈｉｎｄｅｘＦｏｒＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｕｎｄｅｒｓｅｒｅｉ－ｃｏｎｔｉｎｕｅｃｕｌｔｌｌｒｅｓ４２第二章雨生红球藻的培养方式研究表２．８虾青素含量测量值与国内外相关报道比较Ｔａｂ．２．８Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍｏｔｈｅｒｒｅｐｏｒｔｓｏｆｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄ培养模式营养方式虾青素产（ｍｇ·Ｌ。）出处３．５光生物反应器中雨生红球藻的培养３．５．１光生物反应器中雨生红球藻营养阶段的生长情况图２．９为不同培养容器中雨生红球藻培养的细胞生长曲线图；由图２．９可以看出，细胞生长曲线与培养箱中的小瓶（约１００ｍＬ）培养略有不同，细胞接种后藻密度迅速上升，没有经过停滞期而立即进入指数生长期，培养７ｄ后，藻液颜色显著加深（见图２．１３ａ，ｂ），细胞密度达３．０４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ＂ｌ，是初始密度（Ｏ．２３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ。１）的１５倍，是光照培养箱中（２．５４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬｄ）的１．２倍，平均生长速率为０．３７ｄ．１，与Ｋａｅｗｐｉｎｔｏｎｇ等（２００７）采用鼓泡塔式光生物反应器所得平均生长速率（０．３６ｄｄ）相当，显著高于利用太阳光进行室外大体积（１０Ｌ）培养的平均生长速率（Ｏ．１０ｄ－１）（李晓梦等，２００６）。可见雨生红球藻在该光生物反应器中能达到的快速生长的效果。光生物反应器中影响雨生红球藻在生长速度快慢的因素是多方面的，ｐＨ是影响红球藻生长速度快慢的关键因素之一。雨生红球藻生活的环境为淡水，对ｐＨ的缓冲能力比较弱，在培养过程中，随着营养盐的吸收利用和Ｃ０２的消耗，溶液的ｐＨ会逐渐升高（殷明焱等，１９９８；邱保胜等，１９９９）。如图２．１０所示，起始ｐＨ（６．９５）为近中性，开始培养ｌ￣２ｄ，ｐＨ缓慢升高，细胞密度缓慢增加，４３雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究当微藻生长进入指数生长期时，ｐＨ介于７．５２～８．６３范围；当细胞增长速度减缓并进入稳定期时，ｐＨ超过９．Ｏ。可见雨生红球藻培养过程中是逐渐产碱的。已有研究认为红球藻游动细胞可以耐受比较广的ｐＨ值范围，在ｐＨ为５．０－－１０．０之间可以存活并旺盛生长，相对而言，ｐＨ值为７～８时对细胞生长更有利一些（殷明焱等，１９９８），而当ｐＨ超过１０．Ｏ时，将严重抑制雨生红球藻的生长（Ｓａｒａｄａｅｔａ１．，２００２）。本试验中光生物反应器中的ｐＨ控制在偏碱性条件下（７．７５士Ｏ．１０），与对照组相比，红球藻的生长得到了明显的改善（见图２．９）。因此控制ｐＨ是解决雨生红球藻生长速度慢的重要途径之一。此外，雨生红球藻营养阶段虽然是游动绿藻，但随着培养的进行，细胞密度的增加，很容易引起贴壁和沉降现象，光生物反应器系统中的搅拌系统和充气系统可以在一定程度上大大缓解上述现象的发生。合适的搅拌速度和充气速率能使藻细胞在培养体系中分散均匀，使单位藻细胞接触的可利用营养盐相对均衡，从而使细胞均衡生长。搅拌速度过高容易产生细胞剪切力，损害细胞，不利于生长；而过低的搅拌速度则起不到搅拌效果；充气速率的高低对雨生红球藻的生长也十分重要，除了对细胞产生悬浮作用外，若培养体系中的溶氧过高，会抑制细胞生长（Ｈａｒｋｅｒｅｔａ１．，１９９６ｂ；Ｋｏｂａｙａｓｈｉｅｔａ１．，１９９３；Ｔｊａｈｊｏｎｏｅｔａ１．，１９９４；Ｈａｇｅｎｅｔａ１．，２００１）：因此对于搅拌速度，充气速率对雨生红球藻生长的影响有待于下一步研究。３５，、黾宣×３Ｏ２５２０ｌ５１０５０Ｏ１２３４５ｏｏｏ￥蜊翱璺器６７８时间（ｄ）图２．９不同培养容器中雨生红球藻的生长曲线Ｆｉｇ２．９ＴｈｅｇｒｏｗｃｕｒｖｅｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｉｃｅｓ４４第二章雨生红球藻的培养方式研究窒８叶ｏ×越翱塑思时间（ｄ）图２．１０ｐＨ随雨生红球藻生长的变化Ｆｉｇ．２．１０ＣｈａｎｇｅｏｆｐＨｄｕｒｉｎｇｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ３．５．２光生物反应器中雨生红球藻胁迫阶段的各指标变化‘－胁迫阶段的细胞密度变化和色素的积累情况如图２．１ｌ和图２．１２所示。由图２．１１可知，随着胁迫时间的延长，细胞密度呈明显下降趋势。胁迫开始的前４内，细胞密度呈直线下降，胁迫４ｄ后细胞密度降至７．４５ｘ１０４ｄｃｅｌｌｓ·ｍＬ一，降幅高达７５％，此后至胁迫结束，细胞密度继续减小但幅度不大，最终藻细胞密度为４．９５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬｄ（图２．１１）。同时，胁迫期间虾青素含量先增加后减小，总叶绿素含量则的平稳下降（见图２．１２）。胁迫第１天，虾青素含量便有明显积累，此后３ｄ内平稳上升，当胁迫至第４天时，虾青素含量即达峰值，为２．６３ｍｇ·Ｌ．１。高光胁迫会导致藻细胞部分死亡，并减缓剩余存活的藻细胞的分裂速度，使细胞逐渐失去鞭毛，呈不动状态，并在细胞内不断积累虾青素（殷明焱等，１９９８）。因此胁迫期间细胞密度和叶绿素含量逐渐下降，虾青素含量却逐渐增加。胁迫４ｄ虾青素含量便达到最大值，与对照组胁迫比较，胁迫周期大大缩短。但是胁迫的综合效果不如对照组的胁迫效果（见表２．９），胁迫后细胞存活率仅为１６．４％，只有对照组（３１．５％）的一半左右；藻粉产率为０．５１７ｇ·Ｌ～，和对照组相当；虾青素产率为３．７３ｍｇ·Ｌ一，只有对照组的４２．８％。这可能是由于光生物反应器的培养体积较大（１２．５Ｌ），是对照组的１２５倍，培养容器内径大，靠近光源的藻液能获得充足的光，而远离光源的藻液接收的光由于光程长，且投射进来的光受４５雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究藻细胞的阻挡，光强大大减弱，导致胁迫光强远远不足，从而使得反应器内部的细胞胁迫不完全，虾青素的积累量不高，镜检也发现藻细胞内并未完全充满虾青素（见图２．１３ｃ）。胁迫条件是雨生红球藻积累虾青素的关键环节，并在很大程度上决定了虾青素的产量和质量。目前主要的胁迫方式有高光、高温、高盐、营养盐缺乏等（Ｂｏｕｓｓｉｂａ，Ｓ．，ｅｔａ１．，１９９２：Ｈａｇｅｎ，Ｃ．，ｅｔａ１．，２００１；黄水英等，２００８）。高光虽然是一种很重要的胁迫方式，但鉴于本实验中的光生物反应器的构造，高光并不适合，因此可采用营养盐（Ｎ、Ｐ等）缺乏、盐胁迫、活性氧胁迫等单一或复合胁迫手段，可能更有利于提高该光生物反应器中培养的雨生红球藻细胞中虾青素的积累，有待于下一步研究。，、目蛊－＾Ｑｏｏ×蜊御粤最０ｌ２３４５６７８时间（ｄ）图２．１ｌ胁迫阶段的细胞密度变化Ｆｉｇ．２．１１Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｅｌｌｓｄｅｎｓｉｔｙｄｕｒｉｎｇｓｔｒｅｓｓｓｔａｇｅ５．００，、．１１４．００詈３．００帮２．００鉴１．００Ｏ．００ｌ２３４５６７胁迫时间（ｄ）图２．１２虾青素和总叶绿素含量的比较Ｆｉｇ．２．１２ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｔｏｔａｌｃｏｎｔｅｎｔｏｆＣｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｄｕｒｉｎｇｓｔｒｅｓｓｓｔａｇｅ４６第二常再生虹球藻的培养方册兜ｊ●ａ接神后的藻液颜色ｈ培养７ｄ后藻液的麒色圈２．１３藻液颤色的比较ｃ胁迫４ｄ后藻液的颇色Ｆｉｇ．２．１３Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｏｌｏｒｏｆｔｈｅａｌｇａｌｉｑｕｏｒａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅ衰２．９胁迫阶段备指标比较Ｔａｂ．２．９Ｃｏｍｐａ—ｓｏｎｏｆｅａｃｈｉｎｄｅｘｆｏｒＨａｅｍａｔｏｅｏｃｃｓｔｓｐｌｕｖｉａｌｌｓｕｎｄｅｒ５ｔｔ－雌￥ｉｎｄｉｆｋｒｅｎｔｄｅｖｉｃｅ雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和威用研究３．５．３不同接种密度对雨生红球藻生长的影响图２．１４为接种密度分别为０．８４ｘ１０４ｃｅｌｌｓ·ｍＬ～，２．２６ｘ１０４ｃｅｌｌｓ－ｍＬ以光生物反应器中雨生红球藻的生长曲线图。由图２．１４中可以可看出，较高接种密度下的藻生长曲线周期为７ｄ，焉较低的接种密度，其生长益线的周期延长了，达１１藻接种后的第ｌ天，高低接种密度下的藻每日生长速率均很高，分别为０．６７ｄ。ｄ－１和０．６４矿１，差异不显著。这是因为接种初期，单位藻细胞均拥有十分充足的活动空间和营养，因此均能快速生长；随着培养的进行，细胞密度或多或少的增加，丽营养盐却逐渐消耗，因此单位藻细胞的活动空间和可利用营养盐分配减少，细胞日生长速率便受到影响。细胞密度与营养利用的相互牵制过程，使细胞每日生长速率呈现一定的变化。如图２。１５所示，高密度接种的实验组中，细胞每网生长速率总体呈先上升后下降的趋势。培养２—５ｄ期间，细胞每日生长速率比较稳定（０．４ｌｄ．１￣０．４６ｄ＿１），细胞密度相应平稳增加。此后培养的２ｄ内，细胞每目生长速率急剧下降，第７ｄ时藻密度达最离，为３．０４ｘ１０５ｃｅｌｌｓ—ｍＬ＂１。第８天，藻圈生长速率为负僮，可见此时系统内的营养盐已基本消耗完全，细胞不再生长。低密度接种实验组中，细胞每日生长速率呈现两次高潮，在第４天和第７天时，细胞每翻生长速率分剐为０。４８毒１和Ｏ。５ｌ童１，均高于高接种密度实验组中的最大细胞每尽生长速率（第４０．４６ｄ，ｄ．１），可见低密度接种密度条件下，细胞生长的后劲较足，培养１１ｄ后细胞最终密度可达３．５３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ·ｍＬ～，较高密度接种条件下提高１６％。就整个生长周期的细胞平均生长速率两言，低接种密度条件下为Ｏ。３４董１，与高密度接种密度下的细胞平均生长速率（Ｏ．３７ｄ．１）相当。影响光生物反应器中雨生红球藻生长有诸多因素，如温度、光强、ｐＨ等环境因子，健是恰当的接稀密度有剩于光生物反应器中营养盐剩餍与细脆生长维持在相对较佳的动态平衡，从而提高综合培养效果。从本实验结果来看，相对较低的接种密度有利于该光生物反应器中雨生红球藻的培养。４８第二章雨生红球藻的培养方式研究４０．００３５００鼍目３０００ｏｔＵ２５ＯＯｏ×２０００越１５００翎翟１０００最５．００Ｏ．ＯＯＯ２４６８１０１２１４时间（ｄ）图２．１４不同接种密度下的雨生红球藻生长曲线图Ｆｉｇ．２．１４Ｇｒｏｗｔｈｃｎｒｖｅ．３ｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｓｉｎｏｃｕｌｕｍｄｅｎｓｉｔｙＯ８０Ｏ６Ｏ０４０Ｏ２Ｏ０ＯＯ．褂缎半划壁最皿坩０２０时间（ｄ）图２．１５不同接种密度下的雨生红球藻生长的每日生长速率Ｆｉｇ．２．１５ＴｈｅｄａｉｌｙｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｓｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｓｉｎｏｃｕｌｕｍｄｅｎｓｉｔｙ４小结（１）混合营养培养和异养培养方式下，醋酸钠较丙二酸钠是更适于雨生红４９雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和廒用研究球藻生长和虾青素积累的碳源，其最佳初始浓度分别为１．０ｇ＇Ｌｄ和２．０ｇ＇Ｌ～；ｇ。Ｌ１１（２）比较了光合自养、异养培养（２．０ｇ＇Ｌ《醋酸钠）、混合营养（１．０醋酸钠）三种营养方式下雨生红球藻的生长和虾青素积累情况，结果表明混合营养的培养效果优于光合自养，光合自养的培养效果优于异养培养。即以１．Ｏ醋酸钠为碳源的混合营养方式是适合雨生红球藻培养的最佳营养方式；（３）开展了最佳营养方式结合半连续培养模式的研究，结果表明较～次培养，半连续培养模式下一定的更新率（２０％，３０％）能显著促进生长，使第一阶段的生物量增加２．２倍和３．７倍；胁迫条件下，各更新率下的细胞存活率显著ｇ·Ｌｄ高于一次培养，而不同更新率之间的细胞存活率没有显著差别（矿Ｏ．泌）；此外不同更新率下的藻粉总产量、藻粉产率、虾青素总产量及虾青索产率均显著高于一次培养，其中２０％更新率组的藻粉产率最高，达１．３２ｇ·Ｌ一；而３０％更新率组的虾青素产率最高，达２２．９４ｍｇ·¨１，与２０％更新率组差异不显著（矿Ｏ．０５）（４）利用光生物反应器培养蘑生红球藻，能使雨生红球藻细胞获｛！导快速生长，从而提高生物量，并缩短胁迫周期。但虾青素的产率并不高，这是因为光生物反应器培养体积大，削弱了胁迫光强，从而降低了高光胁迫的效果。此外还比较了不同初始密度对光生物反应器培养效果，发现较低的接种密度有刹于光生物反应器中营养盐利用与细胞生长维持在相对较佳的动态平衡，从而提高综合培养效果。第三章虾青素的Ｃ０２超临界萃取法第三章虾青素的Ｃ０２超临界萃取法研究表明超临界萃取由于其工艺简单，操作低温，无溶剂残留等特点而成为天然产物的新型工艺之一（廖传华等，２００７）。而目前虾青素主要的提取方法为传统的溶剂萃取法，不能实现批量样品处理，耗时费力，且易导致溶剂残留，既影响虾青素产品质量，也阻碍了虾青素的商业化进程。目前国内外在利用超临界萃取雨生红球藻的虾青素方面的研究报道甚少，国外仅有２篇报道，而国内研究尚属空白。本实验利用Ｃ０２超临界萃取技术提取雨生红球藻中的虾青素，考察萃取压力，萃取温度，Ｃ０２流速，萃取时间等４因素对雨生红球藻中虾青素提取效率的影响，通过响应面曲线法对提取参数进行优化，从而建立雨生红球藻中虾青素的Ｃ０２超临界最佳提取工艺。１材料１．１实验材料冷冻干燥后的雨生红球藻藻粉１．２实验药品及试剂氢氧化钠（分析纯），乙醇（分析纯），甲醇（分析纯，色谱纯），乙腈（色谱纯），Ｃ０２气体（工业级），超纯水，虾青素标准（美国Ｓｉｇｍａ公司，纯度＞９２％）。１．３实验仪器Ｃ０２超临界萃取仪（ＨＡ１２０．５０．０１（０２）（０５）型，江苏南通华安超临界流体萃取设备公司）；高效液相色谱仪系统（ＩｔＰ１１００型，美国安捷伦公司）；氮吹仪（ＢＦ２０００．Ａ型，北京八方试剂科技有限公司）；超纯水机（Ａｃａｄｅｍｉｃ．ＭｉｌｌｉＱ，密理博中国有限公司公司）；５ｌ雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究其他仪器见第二章。２方法Ｃ０２超临界萃取工艺流程２．１图３．１超临界Ｃ０２流体萃取系统流程图Ｆｉｇ３．１ＴｈｅｆｌｏｗｃｈａｒｔｏｆｔｈｅＣ０２－ＳｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌＦｌｕｉｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ准确称取２０ｇ雨生红球藻粉，装入萃取罐中，通入超临界状态下的Ｃ０２，以乙醇（流速约为１Ｌ．ｈ。１）作为夹带剂。改变不同的萃取压力，萃取温度，Ｃ０２流速、萃取时间，对雨生红球藻进行连续萃取，萃取物进入分离罐进行分离，Ｃ０２气化后循环使用，萃取得到的色素提取液从萃取１分离罐底部放出。色素提取液经皂化稀释后测定虾青素含量，计算虾青素的提取效率。２．２虾青素酯的皂化将浓缩后的色素提取液（５ｍＬ）加一定体积（１ｍＬ）新配的０．１ｔｏｏｌ·Ｌ。１的ＮａＯＨ甲醇溶液，所得混和液（６ｍＬ）在氮气吹扫下定容（５ＩｎＬ），通入氮气将空气排净，密封，在４℃黑暗条件下反应８ｈ，后于１０于．２０＂Ｃ冰箱中保存备分析。０００ｒ·ｍｉｎ＂１下低温离心１５ｒａｉｎ，上清液２．３游离虾青素的高效液相色谱法测定色谱柱：２５０ｎｕｎ＊４．６ｍｍＰｕｒｏｓｐｈｅｒＳＴＡＲＲＰ一１８ｅｎｄｃａｐｐ：５２第三章虾青素的Ｃ０２超ｌＩ缶界苯取法预柱：用至少２０倍柱体积的１００％甲醇，流速为１．０ｍＬ·ｍｉｎ以冲洗柱子，直至检测器稳定，再以２０倍柱体积的流动相平衡柱子；流动相：乙腈：甲醇：水＝７５：２５：１０（体积比），超声脱气；流速：１．０ｍＬ·ｍｉｎ一；检测波长：４７６进样量：１０ｉｌｒｌｌ；ｇＬ；柱温：室温。２．４Ｃ０２超临界萃取法提取工艺及其优化Ｃ０２超临界萃取过程中，选取萃取压力、萃取温度、Ｃ０２流速三个主要因素分别做单因素试验，然后通过响应面法对萃取工艺进行优化以获得最佳萃取条件；最后在优化条件的基础上进行虾青素提取一时间曲线实验，从而获得较适的萃取时间，最终获得Ｃ０２超临界萃取的最佳提取工艺。萃取压力的单因素试验：准确称取３份一定量的雨生红球藻，在萃取温度为５０℃，Ｃ０２流速为１０Ｌ－ｈ－１，分别在２０ＭＰａ、３０ＭＰａ、４０ＭＰａ的压力下萃取２．５ｈ。萃取温度的单因素试验：准确称取３份一定量的雨生红球藻，在萃取压力为４０ＭＰａ，Ｃ０２流速为１０Ｌ·ｈ一，分别在４０℃、５０℃、６０℃的压力下萃取２．５ｈ。Ｃ０２流速的单因素试验：准确称取３份一定量的雨生红球藻，在萃取压力为４０ＭＰａ，萃取温度为６０℃，分别在Ｃ０２流速为８ｈ。Ｌ·ｈ一、１０Ｌ·ｈ～、１２Ｌ·ｈ。１下萃取２．５２．５数据分析及处理虾青素提取率Ｙ＝皂化后虾青素的含量（ｍｇ·Ｌ。１）Ｘ萃取液的体积（Ｌ）／样品量（ｇ）×１００％利用ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ６．０软件采用响应面曲线法统计分析试验因素与响应指标（虾青素的提取效率）间的关系，逐步回归获得响应方程，建立模型，根据模型利用ｍａｔｌｂａｂ软件预测萃取最佳条件，再根据模型给出的最佳条件进行实验，比较实际值与模型预测值是否一致进行模型验证。雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和威用研究２结果与讨论２．１萃取压力对蔫生红球藻中虾青素提取效率的影响萃取压力对雨生红球藻中虾青素提取效率的影响见图３．２。从３．２图中可以看出，随着萃取压力的增大，虾青素提取效率呈上升趋势，说明压力越大对于雨生红球藻中虾青素的提取越有利。雨生红球藻细胞具厚壁，高压有利于细胞厚壁孢子的破碎，从蔼有利于色素的释放。本研究结果与已有研究结果相似，陈兴才等（２００７）研究利用高压（４０ＭＰａ）下循环三次均质处理雨生红球藻细胞，破壁率可达９１．４％；周湘池等（２００４）利用Ｃ０２超临界萃取虾壳中的虾青素，发现在４５ＭＰａ萃驭压力下虾青素提取率为２０ｍｇ·ｋｆ’；溜毅等（２００４）同样利用Ｃ０２超临界萃取虾壳巾的虾青素，结果表明萃取压力为４０ＭＰａ时提取率可达到８０．５％。Ｑ摹１．０００丫０。８００静较０．６００釜裂０．４００ｇ麟０。２００诬培０．０００１０２０３０４０５０萃取压力（Ⅷａ）图３．２萃取压力对虾青素提取效率的影响Ｆｉｇ３．２Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅｓｏｎｔｈｅａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｙｉｅｌｄ２。２萃取温度对雨生红球藻中虾青素提取效率的影响萃取温度对愿生红球藻中虾青素提取效率的影响见图３．３。从３＋３图中可以看出，随着温度的升高，雨生红球藻中虾青素提取效率基本呈线性上升。表明高温有利予虾青素提取效率的提高（屈毅等，２００４：周湘池等，２００４；Ｍａｃｈｍｕｄａｈｃ毫ａ１．，２００６１Ｎｏｂｒｅｅ￡ａｌ。，２００６；）。雨生红球藻中的虾青素主要以虾青素酯形式存在（Ｄｅｎｅｒｙｅｔａ１．，１９９６），且虾青素酯较游离虾青素耐高温，高温有利予虾青素酯的提取，经皂化变成游离虾青素，从而提高虾青素的提取效率。钳第三章虾青素的Ｃ０２超临界萃取法Ｓ６、Ｖ１．０００龉０．８００楚０．６００甾掣０．４００ｇ禚０．２００乓募堡０．０００１０２０３０４０５０６０７０萃取温度（℃）图３．３萃取温度对虾青素提取效率的影响Ｆｉｇ３．３ＥｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓＯｎｔｈｅａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｙｉｅｌｄ２．３Ｃ０２流速对雨生红球藻中虾青素提取效率的影响Ｃ０２流速对雨生红球藻中虾青素提取效率的影响见图３．４。由图３．４可知Ｃ０２流速越低，雨生红球藻中虾青素的提取效率越高。与Ｍａｃｈｍｕａｄａｈ等（２００６）报道相似，低Ｃ０２流速有利于雨生红球藻中（３ｍＬ·ｍｉｎｄ）对虾青素的提取。此外，萃取过程中添加了乙醇作为夹带剂，可增加Ｃ０２超临界流体的溶解能力，同时降低Ｃ０２流速可增加乙醇与目标物的接触，从而提高虾青素提取效率（Ｍａｃｈｍｕａｄａｈｅｔ为最适合流速。ａ１．，２００６；Ｎｏｂｒｅｅｔａ１．，２００６）。因此，在实验范围内，８Ｌ·ｈｄ＼√摹１．０００８００６００４００２００褂较铎赠懒雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究２．４虾青素超临界提取工艺的优化单因子试验得出雨生红球藻中虾青素的萃取压力为４０ＭＰａ，萃取温度为６０℃，Ｃ０２流速为８Ｌ·ｈ－１为宜。为此，在单因素试验的基础上，根据中心组合设计原理，戮虾青素提取率Ｙ为响应值，利用ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ６．０软件设计了三因素三水平的响应厦法试验，共有１５个试验点，其中１１个为析因点，５个为零点以估计误差。因素水平见表３．１，试验设计和结果见表３．２。表３．１因素水平袭Ｔａｂｌｅ３．１Ｔｈｅｆａｃｔｏｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓ袭３．２中心缀合设计方案及响应值结果Ｔａｂｌｅ３．２Ｄｅｓｉｇｎｏｆｃｅｎｔｒａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｅａｎｄｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｖａｌｕｅｓ第三章虾青素的Ｃ０２超临界萃取法２．４．１方差分析与显著性检验利用软件对试验结果进行方差分析和显著性检验，结果见表３．３。并进行二次多元回归拟合，得到模型的二次多项回归方程为Ｙ－－Ｏ．８３２８２３５２９４１１７７＋０．１５６５Ａ＋０．０９７Ｂ．０．０５２５Ｃ．０．０６８８５Ａ２－０．０４３３５８２＋Ｏ．００５１４７Ｃ２－０．０１９５ＡＢ＋０．０３７５ＡＣ＋０．０２１５ＢＣ表３．３方差分析与显著性检验Ｔａｂｌｅ３．３Ｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｔｅｓｔ注：Ｐ９．０００１，为高度显著，用｝＋表示：Ｐ９．０５，为显著，用·表示；Ｐ＞０．０５，显著性不明显由表３．３可知，失拟项不显著（矿０．０５），模型的Ｐ值＜０．０００１，表明模型极显著。此外还可以看出因素一次项（Ａ、Ｂ）对结果影响极显著（∥Ｏ．０００１），因素Ｃ对结果影响显著（正Ｏ．０５）；二次项Ａ２、Ｂ２、对结果影响是显著的（∥０．０５），二次项Ｃ２对结果影响不显著的（户０．０５）；交互项（ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ）对结果影响５７雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究显著（正０．０５）。２．４．２回归模型的建立及优化二次项Ｃ２对结果影响不显著的（少Ｏ．０５），因此采用手动优化的方法（去掉Ｃ２）对回归模型进行优化（见表３．４）。表３．４去掉平方项Ｃ２后的优化结果。Ｔａｂｌｅ３．４ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｃｌｕｄｉｎｇＣ２变翥来ｓｏｕｒｃｅ平方和自由度ＤＦ８１１ｌ１ｌ１ｌ１６均方．Ｍｅ趾ＳｑｕａｒｅＦ值ＦＶａｌｕｅＰ值Ｐｖａｌｕｅ显著性Ｓｉｇｎｉｆｉｃ锄ｃｅ¨··旦啪ｏｆｔＳｑｕａｒｅｓＭｏｄｅｌＡＢ０．１９６２９４６５４０．０４８９８４５０．０１８８１８０．００５５１２５Ｏ．０１３０７２６５４０．０２４５３６８３２０．０４８９８４５０．０１８８１８０．００５５１２５Ｏ．０１３０７２６５４０．００５０４０１５４０．０００５０７０．００１８７５０．０００６１６３３３５．９２２４４Ｅ．０５４１４．３０３０３６８２７．１００５５２３１７．７４０８８１９３．０７８２５５２２２２０．７３１０３１５８５．１０２７１６７４８．５６０６６６７３９３１．６５９２７０４８１０．４０６７５３９８＜０．０００１＜０．０００１＜０．０００１＜０．０００１＜０．０００１＜０．０００１０．０２６４０．００１３０．０１８０¨¨¨¨。ｃ小酽０．００５０４０１５４０．０００５０７０．００１８７５墟肥盼ＲｅｓｉｄｕａｌＬａｃｋｏｆ。０．０００６１６３３３０．０００３５５３４６。７．２１４６２Ｅ．０５ＦｉｔＰｕｒｅ０．０００２８３２ＥｒｒｏｒＣｏｒＴｏｔａｌ０．１９６６５２３．６０７３１Ｅ－０５０．５０９５０６７３６０．６３５２ｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ４０．００００７０８１４注：Ｐ９．０００１，为高度显著，用·事表示；Ｐ９．０５，为显著，用·表示；Ｐ＞０．０５，显著性不明显经手动优化后的回归方程为：Ｙ＝０．８３３６１５３８４６１５３９＋０．１５６５Ａ＋０．０９７Ｂ．０．０５２５Ｃ一０．０６７２６９２３１Ａ２．０．０４１７６９２３１第三章虾青素的Ｃ０２超ｌ临界萃取法Ｂ２０．０１９５ＡＢ＋０．０３７５ＡＣ＋０．０２１５ＢＣ由表３．４，失拟项不显著（Ｐ＝０．５８１８＞０．０５），而模型的Ｐ值＜０．０００１，表明模型高度显著；同时软件分析的复相关系数Ｒ２－－９９．８０％，校正后的ＲＡｄｊ２－－－－９９．４３％，表明在所选的因素水平范围内，该模型拟合程度很好，试验误差小，该模型是适合，可以用此模型对Ｃ０２超临界萃取雨生红球藻中的虾青素进行分析和预测。２．４．３响应面图形分析对经手动优化后的回归方程中的ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ交互项所做的响应曲面图见图３．５．３．７。由图３．５可知，当Ｃ０２流速一定时，虾青素提取率随着萃取压力增加和萃取温度的提高都是单调增加的。由图３．６可知当萃取温度一定时，虾青素提取率随着萃取压力的和Ｃ０２流速的提高而增加，但是当萃取压力和Ｃ０２流速提高到一定程度后便不再增加。由图３．７可知当萃取压力一定时，虾青素提取率随萃取温度和Ｃ０２流速的增加，先增加后减小，图形呈钟罩型，存在极高值点。因此说明萃取压力和萃取温度、萃取压力和Ｃ０２流速、萃取温度和Ｃ０２流速对虾青素的提取率的交互作用显著，这和表３．４方差分析的结果一致（交互项中的Ｐ值均小于０．０５）。Ｙ虾青素提取率（％）Ｂ萃取温度（℃）Ａ萃取压力（ＭＰａ）图３．５萃取压力Ａ与萃取温度Ｂ对虾青素提取率Ｙ的影响Ｆｉ９３．５Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅ（Ａ）ａｎｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）ｏｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｙｉｅｌｄＹ雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究哳青素提取率（％）Ｃ二氧化碳流速（Ｌ．ｈ－１）Ａ萃取压力（ＭＰａ）图３．６萃取压力Ａ与Ｃ０２流速Ｃ对虾青素提取率Ｙ的影响Ｆｉｇ．３．６Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｅｓｓｕｒｅ（Ａ）ａｎｄｆｌｏｗｒａｔｅｏｆｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅ（Ｃ）ＯｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｙｉｅｌｄＹＹ虾青素提取率（％）Ｃ二氧化碳流速（Ｌ．ｈ－１）Ｂ萃取温度（℃）图３．７萃取温度Ｂ与Ｃ０２流速Ｃ对虾青素提取率Ｙ的影响Ｆｉｇ．３．７Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｂ）ａｎｄｆｌｏｗｏｎｒａｔｅｏｆｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅ（Ｃ）ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｙｉｅｌｄＹ２．４．４最佳萃取条件的预测及模型验证通过ｄｅｓｉｇｎ件的预测。ｅｘｐｅｒｔ６．０软件对经手动优化后的回归方程求解进行最佳萃取条第三章虾青素的Ｃ０２超临界萃取法模型：３（－－０．８３３６１５３８４６１５３９＋０．１５６５Ａ＋０．０９７Ｂ．０．０５２５Ｃ．０．０６７２６９２３１Ａ．０．０４１７６９２３１Ｂ２．０．０１９５ＡＢ＋０．０３７５ＡＣ＋０．０２１５ＢＣ实验因素水平范围：Ａ是萃取压力：３５＂－＇４５ＭＰａ；Ｂ萃取温度：５５＂－＇６５℃；Ｃ为Ｃ０２流速：６＂１０Ｌ·ｈ．１；根据高等数学求极值的方法：函数ｆ（ｘ）在点Ｘｏ处具有导数，且在）（ｏ处取得极值，则函数在Ｘ０处导数为零。对变量Ａ进行一阶偏导：Ｏ．１５６５．２ｘＡｘ０．０６７２６９２３１．Ｏ．０１９５Ｂ＋Ｏ．０３７５Ｃ＝０（１）对变量Ｂ进行一阶偏导：０．０９７．２ｘＢｘ０．０４１７６９２３１－０．０１９５Ａ＋０．０２１５Ｃ＝Ｏ（２）对变量Ｃ进行一阶偏导：．０．０５２５＋０．０３７５Ａ＋Ｏ．０２１５Ｂ＝０（３）由方程（１），（２），（３）我们分别求得Ａ＝０．９２１５Ｂ＝Ｏ．８３４５Ｃ＝．０．４３３２转换后得到实验因素的实际条件为：萃取压力＝４４．６０７５ＭＰａ；萃取温度＝６４．１７２５℃；Ｃ０２流速＝７．１３３６Ｌ·ｈ．１；在此条件下理论预测利用Ｃ０２超临界萃取雨生红球藻中虾青素的提取效率的极值为０．９５７５％。通过与边界点的响应值比较，表明在实验范围内此极值为极大值。为了验证Ｃ０２超临界萃取模型的有效性，在萃取压力，萃取温度，Ｃ０２流速的实验水平范围内，选择３个组合及预测的最佳条件（稍作修正）进行实验验证，６１雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和成用研究结果见表３．５。表３。５模型验证结果Ｔａｂｌｅ３．５Ｖｅｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｏｄｅｌｓ由表３。５可知，模型预测值与实测值吻合极好，相对误差极小，因此用此模型指导实践具有可行性，且效果十允显著。２．４．５萃取时间对虾青素提取率的影响通过以上对萃取压力、萃取温度、Ｃ０２流速进行优化后，获锝最佳萃取条件是：萃取压力＝４４．６ＭＰａ；萃取温度＝６４．２℃；Ｃ０２流速一７．１Ｌ－ｈ一；在此条件下进行虾青素的提取一时闻益线实验进行萃取时闯的优化，结果翔图：２５０＾量、／∞ＯＯ５０ＯＯ５０Ｏ００。５ｌ王．５２２．５３３．５４４．５５５．５咖钿懈怛蚩时间（ｈ）图３．８虾青素提取一时间曲线Ｆｉｇ．３．８Ｃｏｎｔｅｎｔ－ｔｉｍｅｃｕｒｖｅｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ鸵第三章虾青素的Ｃ０２超临界萃取法由图３．８可知，随着萃取时间的延长，虾青素含量呈上升趋势，但上升幅度逐渐降低。在萃取的前１．５ｈ，虾青素的含量几乎呈线性增加，单位时间内提取的虾青素高达１０２．５３ｍｇ；此后的２ｈ内，虾青素增幅减小，萃取３．５ｈ后虾青素含量达２０５．６ｍｇ，此时虾青素的提取率为１．０２８％，此后随着时间的延长，虾青素含量基本稳定，只有小幅增加。萃取５ｈ后，虾青素的含量为２０８．２ｍｇ，虾青素提取率为１．０４１％，与萃取３．５ｈ相比，只提高了０．０１３％。提取时间越长固然能获得更多的虾青素，但是时间过长会增加耗材，浪费机时，增大成本，造成单位时间内的提取效率不高。因此萃取３．５ｈ较适，此时溶出的虾青素较多，且消耗的时间也相对不会太长，从而降低消耗成本，有利于商业化生产。３小结本实验以虾青素提取率为指标，通过考察萃取压力、萃取温度、Ｃ０２萃取流速三因素对该指标的影响，对Ｃ０２超临界萃取工艺进行了初步摸索，应用了响应面分析法，通过对实验结果的统计分析比较，确定了最佳工艺条件为：萃取压力４４．６ＭＰａ，萃取温度６４．２℃，Ｃ０２流速７．１Ｌ·ｈ－ｏ，萃取时间３．５ｈ，在此条件下获得的虾青素提取率可达１．０２８％。与常规的溶剂提取法相比，本实验中的虾青素提取率偏低。大量研究表明用有机溶剂提取虾青素的提取率可达１．６５％艺．７％（Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａａｎｄ１９９２；ＣｈｏｕｒｂｅｒｔＢｏｎｅｔａ１．，Ｌｉａａｅｎ．Ｊｅｎｓｅｎ，１９９６；ａｎｄＨｃｉｎｒｉｃｈ，１９９３；Ｃａｌｏｅｔａ１．，１９９５；Ｈａｒｋｅｒｃｔａ１．，ｅｔ１９９７；Ｐａｒａｊｏａ１．，１９９８），然而有机溶剂易挥发，提取过程要消耗大量的有机溶剂，成本大，且溶剂易残留，影响虾青素产品的品质，尽管提取效率相对较高但不是提取虾青素的最好方法。另外，有研究报道利用微波萃取法提取雨生红球藻中虾青素的提取效率可达１．０２０％（王灵昭等，２００７），与本实验结果相当，但是此法仍无法避免有毒有机溶剂的使用，且微波容易发生危险，因此也不是理想的提取方法。Ｃ０２超临界萃取仪进样量大，工艺流程简便，且该方法不会引入溶剂污染，萃取所使用的Ｃ０２气体和乙醇均可回收利用，消耗低，十分环保。若进一步开发研究，提高虾青素的提取效率，将有望成为规模化虾青素生产提取设备。雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究第四章雨生红球藻来源的虾青素的稳定性及其应用初探开展各因素对雨生红球藻来源虾青素的稳定性以及其生理功能研究，不仅可以为雨生红球藻来源的虾青素的保存及虾青素酯的皂化条件提供参考，还可以为其应用提供指导。本实验探讨温度、光照等环境嚣子、碱浓度、还原剂对雨生红球藻来源的虾青素的稳定性以及其对观赏鱼着色能力和抗氧化能力的影响，以期为虾青紊迸一步开发利用奠定基础。１材料１．１实验材料雨生红球藻粉：本实验室制得的雨生红球藻藻粉基础饲料：配方见表４．１表４．１基础饲料配方Ｔａｂ．４．１Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｂａｓｉｃｄｉｅｔ实验用鱼：盘鹦鹉（Ｃｉｃｈｌａｓｏｍａｃｉｔｒｉｎｅｌｌｕｍｘ￡ｓｙｎｓｐｉｌｕｍ），是由父本红魔鬼和母本紫红山口杂交而成的观赏鱼，购自厦门鱼市，幼鱼全体黑色，平均大小约５。４９ｃｍ，平均重量约４．８４ｇ，共１２０条。１．２试剂及其他耗材虾青素（美国Ｓｉｇｍａ公司，纯度≥９２％），二丁基羟基甲苯（简称ＢＨＴ，分析纯），丙酮（分析纯），高锰酸钾（分析纯），生理盐水（Ｏ．８５％∞．９％，４℃保存），Ｔｒｉｓ－蔗糖缓冲液（Ｏ．０１ｔｏｏｌ·Ｌ～Ｔｒｉｓ＋０．２５ｍｏｌ·Ｌ。１蔗糖均．１ｍｍｏｌ蕾。１第四章雨生红球藻来源的虾青素的稳定性及其应用初探ＥＤＴＡ，ｐＨ＝７．５，４℃保存），冰水混合物，ＳＯＤ测试盒，ＣＡＴ测试盒，ＭＤＡ测试盒，ＴＡＣ测试盒鱼缸（规格，６个），塑料离心管（１．５ｍＬ，１８０个），烧杯（１０ｍＬ，５个），医用解剖器具（２副），筛绢（０．９ｒａｉｎ，１．２ｍｍ），滤纸，称量纸，铝箔。１．３实验仪器组织匀浆机（Ｔ１８，中国ＩＫＡ公司）磁力搅拌器（ＭＳＣｑ００，德国ＷｉｇｇｅｎＨａｕＳｅｒ公司）恒温水浴箱（ＤＫ．Ｓ２４型，上海精密实验设备公司）超低温冰箱（立式，美国ＴＨＥＲＭＯ公司）多功能酶标仪（ＴＥＣＡＮＧＥＮＩＯＳ，ＴＥＣＡＮ奥地利公司）其他仪器见第二章２方法２．１环境因子等对雨生红球藻来源虾青素的稳定性的影响２．１．１温度对雨生红球藻来源虾青素的稳定性的影响将色素提取液分别置于２０℃，３０℃，４０℃，５０℃，６０℃的水浴锅中保温及４℃冷藏，定时Ｏ．５ｈ，１．０ｈ，１．５ｈ，２．０ｈ，２．５ｈ，３．０ｈ，３．５ｈ，４．０ｈ测定其在４７４ｎｌＴｌ处的吸光值，并分析不同温度对色素稳定性的影响。２．１．２光照对雨生红球藻来源虾青素的稳定性的影响将色素提取液分别置于暗室（光强为０ｌｘ）、室内散射光（６００Ｉｘ＜光强＜１２００Ｉｘ）、室外太阳光（光强＞１４０００Ｉｘ）下，定时测定其在４７４ｎｍ处的吸光值，并分析不同光照对色素稳定性的影响。２．１．３碱浓度对雨生红球藻来源虾青素的稳定性的影响配制５ｇ＇Ｌ～，１０ｇ＇Ｌ一，２０ｇ＇Ｌ～，４０ｇ＇Ｌ～，６０ｇ＇Ｌ～，８０ｇ＇Ｌ。１浓度的ＫＯＨ－甲醇皂化液，将一定浓度的游离虾青素标准样品在１５℃、磁力搅拌的情况下分别雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和殿用研究皂化１０ｍｉｎ，利用ＨＰＬＣ测定游离虾青素的残余量，以此来研究游离虾青素对碱的稳定性情况。２．１．４还原剂对焉生红球藻来源虾青素的稳定性的影响将浓度为Ｏ．２％还原剂ＢＨＴ的丙酮溶液加入到色素提取液中，于室内暗室中放置，分别定时０ｄ，０．５ｄ，ｌｄ，２ｄ，４ｄ，８ｄ后，在４７４ｎｍ处测定其吸光值，并对比分析添加与不添加还原剂对色素稳定性的影响。２．２雨生红球藻来源的虾青素的应用初探２。２。１实骏前的准备（１）用具的消毒将鱼缸，鱼网，橡皮管、充气石，加热棒，水过滤系统等实验用具先用清水洗净，再用１００ｐｐｍ离锰酸钾溶液浸泡１２ｈ，用清水冲洗干净晾干备用。（２）各水在消毒过的两个大玻璃缸里注满水，暴晒３ｄ，除去水中的氯气，过滤系统过滤掉水中的杂质，备用。（３）鱼的暂养将鱼用充入氧气的塑料袋运回实验室，连同塑料袋～起泡在备好的水中约ｌｈ，使袋内外水温一致后，解开塑料袋随机将鱼捞入已做好标记的鱼缸中，用加热棒将水温度控制在２６－，２８℃；气泵充气，溶解氧维持在纠ｐｐｍ．暂养５ｄ，不喂食。（４）饲料的配制自制添加虾青素的饲料（虾青素含量为４００ｍｇ·ｋｇ＂’）：准确称取２４．６９ｇ雨生红球藻粉（禽虾青素ｌ。６２％）添加到９７５．３１ｇ的基础饲料（见材料），置于干净的塑料袋中，手摇混匀；然后转移到搅拌器中，加少量黏合剂和蒸馏水，不断搅拌直至饲料成小颗粒，置于托盘中，晾干。待晾干后经筛绢筛（Ｏ．９ｍｍ，１．２ｍｍ）选获得粒径为Ｏ．９￣ｌ。２ｒｎｒｎ的饲料颗粒，于．２０℃冰箱保存，防止虾青素氧化。第四章雨生红球藻来源的虾青素的稳定性及其应用初探２．２．２实验设计及日常管理设置对照组和实验组，每组２个重复，每个重复３０条鱼。分别喂食不含虾青素和添加雨生红球藻藻粉的饲料（虾青素含量为４００ｍｇ·ｋｇ＂１饲料），每天上午９：３０和下午５：３０各喂一次，投饵量为鱼体平均体重的３％：下午投饵完毕待鱼吃完饵料后半小时，用橡皮管虹吸缸中鱼体排出的粪便，同时补入相应的水量；每１０ｄ取一次样，每次取４条鱼，样品拍照，并于．８０℃冰箱冷藏备分析。喂食５０ｄ后，统一只投喂不含虾青素的饲料，观察鱼的褪色情况，持续２０ｄ，实验结束。２．２．３前处理鱼鳞及鱼皮将鱼体解冻，刮下鳞片，取下皮肤，分别置于称量纸或铝箔中进行冷冻干燥，然后于干燥器中避光低温保存。肌肉取下鱼鳞和皮肤后，将鱼活体解剖，弃去内脏，用冰生理盐水清洗其中血液，滤纸吸干，称重，记录；然后置于小烧杯（冰浴），加入冰冷的Ｔｒｉｓ．蔗糖缓冲液，体积为１０：１（Ｖ／ｗ），用匀浆器匀浆。完毕后将匀浆液于４℃，１００００ｒ·ｍｉｎ以下离心１５ｒｅ＿ｉｎ，取上清液置于４个１．５ｍＬ小离心管中，并于．８０℃冰箱内保存。２．２．４鱼体色素的提取及测定用丙酮浸取，丙酮浸取液加０．０１ｍｏｌ·Ｌ．１ＫＯＨ甲醇溶液在４℃下在氦气保护下皂化８ｈ，氮气挥干，置换溶剂为流动相乙腈：丙酮（７５／２５，ｖ／Ｖ），ＨＰＬＣ测定虾青素含量。２．２．５鱼体抗氧化酶活性测定采用南京建成生物研究所生产的试剂盒，具体测定方法参考试剂盒说明书。２．３数据分析用ＳＰＳＳ１３．０统计软件对各项数据进行方差分析和显著性检验。６７雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究３结果与讨论３．１温度对雨生红球藻来源虾青素的稳定性研究图４．１为温度对露生红球藻来源虾青素酌稳定性的影响的变化麴线。由图４。ｌ可知，虾青素对温度的稳定性良好，在４０℃以下随时间的延长吸光值变化不大，说明雨生红球藻来源的虾青素在４０℃以下比较稳定；当温度为５０℃和６０℃时，随着时间的延长，溶液的吸光值呈下降趋势，可见温度高予４０℃可影响色素的稳定性。由于虾青素是一种脂溶性色素，且极性较弱，只能溶解于极性较弱的有机溶剂（如丙酮，乙醇），而有机溶剂大多数易挥发，随着溢度的升高会造成有机溶剂的损失，从面使色素的浓度增加，导致吸光值增大。因此为减少实验误差，实验操作大多控制在相对低温条件下（４０℃以下），以减少溶剂挥发。Ｏ７２Ｏ６９Ｏ６６Ｏ６３＋４℃＋２０℃＋３０℃一÷卜４０℃卅卜５０℃《趔果签Ｌ６Ｏ５７Ｏ５４ＯＯ．５ｌ１．５２２．５３３．５４—卜６０℃时间（魏）图４．１温度对雨生红球藻来源虾青素的稳定性的影响Ｆｉｇ．４．１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｏｎｓｔａｂｌｉｔｙｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍ，ｌｕｖｉａｌｉｓｐｌｕｖｉａｌｉｓＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ３．２光照对羲生红球藻来源的虾青素的稳定性研究光照对雨生红球藻来源虾青素的稳定性的影响如图４．２所示。由图４．２可知，第四章雨生红球藻来源的虾青素的稳定性及其应用初探雨生红球藻来源的虾青素光稳定性较差。经方差分析，光照显著影响虾青素的稳定性（∥０．０５），特别是太阳光。随着光照时间的延长，其吸光值大幅度下降；太阳光照射５ｈ左右，虾青素的吸光值减小至接近于０。室内自然光条件下，２４ｈ后测定虾青素的残存率为７５％；避光保存时，虾青素的吸光值基本不变。可见光照可导致虾青素的降解，故虾青素的处理、保存，应尽可能避光操作。Ｏ．９０．８０．７《０．６＋室外光一室内光＋避光趔０．５就０．２０．１０Ｏ０．５１１．５２．５５ｌＯ２４时间（ｈ）图４．２光照对红球藻虾青素稳定性的影响Ｆｉｇ．４．２ＥｆｆｅｃｔｏｆｌｉｇｈｔｏｎｔｈｅｓｔａｂｌｉｔｙｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍｐｌｕｖｉａｌｉｓＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ３．３碱浓度对雨生红球藻来源虾青素的稳定性研究图４．３为碱浓度对雨生红球藻来源的虾青素的稳定性影响的变化曲线。由４．３图可知，随着碱浓度增大，游离虾青素含量呈明显下降趋势，表明游离虾青素对碱不稳定，碱浓度越大，游离虾青素降解越严重。因此在利用不同碱浓度对虾青素进行皂化反应时，要考虑碱对皂化产物即游离虾青素的降解的动态平衡，控制好皂化反应的条件，选择合适的碱浓度，合适的温度和时间，即可以完全将虾青素酯皂化成游离虾青素，减小碱浓度对游离虾青素的降解作用。雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究Ｊｂｏ吕咖｜钿窖懒扯旨趁越０１０２０４０６０８０碱浓度（ｇ·Ｌ一１）图４．３不同碱浓度对游离虾青素稳定性的影响Ｆｉｇ．４．３Ｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｌｋａｌｉｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｏｎｔｈｅｓｔａｂｌｉｔｙｏｆｆｒｅｅ３．４还原剂对雨生红球藻色素来源虾青素的稳定性研究还原剂对雨生红球藻色素来源虾青素稳定性的影响如图４．４所示。由图４．４中可知，同样避光条件下，在前２ｄ添加还原剂和未添加还原剂的色素提取液中虾青素含量变化不大，特别是添加还原剂组虾青素的吸光值变化不明显（ｐ＞Ｏ．０５）。但随着放置时间延长，未添加还原剂组虾青素的吸光值４ｄ后急剧下降，从４ｄ前的０．６１８下降至０．４８８，降幅高达２１％。而添加还原剂组的虾青素吸光值变化极小，可见还原剂对虾青素有较好的保护作用。０９Ｏ８Ｏ７《０６０５Ｏ４Ｏ３０２０ｌ００Ｏ．５ｌ２４８趔米督时间ｆｄ）图４．４还原剂对虾青素稳定性的影响Ｆｉｇ．４．４Ｅｆｆｅｃｔｏｆｒｅｄｕｃｉｎｇａｇｅｎｔｓｏｎｔｈｅｓｔａｂｌｉｔｙｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍ且ｐｌｕｖｉａｌｉｓ第四章雨生红球藻来源的虾青素的稳定性及其应用初探３．５雨生红球藻来源的虾青素的生理功能初探３．５．１雨生红球藻来源的虾青素对血鹦鹉生长的影响雨生红球藻来源的虾青素对血鹦鹉生长的影响见表４．３。从表４．３中可知，饲养试验进行到５０ｄ后，对照组和实验组的鱼体增重率分别为２００％和３００％，且实验组鱼的增重率显著高于对照组（则．０５）。可见，喂食添加雨生红球藻粉饲料对血鹦鹉的生长具有促进作用，这与虾青素可大大提高Ｒｈｏｄｅｕｓｕｙｅｋｉｉ的生长（硒ｍｅｔａ１．，１９９９）以及虾青素可显著提高大西洋鲑鱼的生长（Ｃｈｄｓｔｉａｎｓｃｎｃｔａ１．，１９９５ｂ）的结果相似。然而目前有关虾青素对鱼类生长影响的绝大多数研究结果迥异。大西洋鲑（８ａｌｍｏｓａｌａｒ）和大西洋鳕（Ｇａｄｕｓｍｏｒｈｕａ）腹腔注射虾青素后的剂量反应研究发现，高剂量虾青素对其生长有副作用，大西洋鲑的种群生长率（ＳＧＲ）与注射量负相关，而大西洋鳕所有注射组的ＳＧＲ为０；增加剂量，不会使鱼致死，但其生长减慢（Ｙｔｒｅｓｔｏｙｌｅｔａ１．，２００７）。有研究表明，鱼体生长参数如增重量，可持续生长率，饲料利用率等均不受饲料中虾青素的影响（Ｇｏｕｖｅｉａｅｔａ１．，２００３）。喂食添加虾青素、ｐ．胡萝卜素，虾青素和ｐ．胡萝卜素１：１混合饲料与对照组（不添加色素）对Ｈｙｐｈｅｓｓｏｂｒｙｃｏｎｃａｌｌｉｓｔｕｓ的生长差别不显著（Ｗａｎｇｅｔａ１．，２００６）。这表明在饲料中添加虾青素对鱼生长的影响因品种而异。此外，影响生长的显著与否可能与鱼类对饲料利用率有关。迄今，有关饲料中添加虾青素促进鱼体生长的原因尚无定论，有待进一步研究。表４．３添加虾青素对血鹦鹉生长的影响Ｔａｂ．４．３ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｆｅｅｄｉｎｇａｓｔａｘａｎｔｈｉｎＯｎｇｒｏｗｔｈｏｆＣｉｃｈｌａｓｏｍａｃｉｔｒｉｎｅｌｌｕｍＸＣｓｙｎｓｐｉｌｕｍ７ｌ雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和成用研究３．５．２雨生红球藻来源的虾青素对血鹦鹉的着色影响在饲养ｌＯｄ，２０ｄ，３０ｄ，４０ｄ，５０ｄ，６０ｄ，７０ｄ时分别测量鱼鳞中虾青素和总类胡萝卜素的含量，见表４．４；在饲养的７０ｄ内，对照组鱼鳞中虾青素和总类胡萝卜素含量差异不显著（舢．０５）；两添加虾青素的实验组在开始饲养的５０ｄ里虾青素含量和总类胡萝卜素含量基本呈上升趋势，第２０－４０天，增幅十分明显；第５０ｄ时，实验组鱼鳞片中虾青素和总类胡萝卜素的含量均显著高予对照组（ｐ＜ｏ。０５）。此后的２０ｄ内，实验组停食添加虾青素的饲料，改投和对照维一样的基础饲料，发现鳞片中的虾青素和总类胡萝卜素含量均有小幅下降，但差异不显著（ｐ＞０．０５）。表４。４添加虾青素对鱼鳞片中虾青素和总类胡萝卜素含量的影响Ｔａｂ．４．４Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｆｅｅｄｉｎｇａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｏｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｎｄｔｏｔａｌｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｃｏｎｔｅｎｔｏｆｓｃａｌｅｓ在饲养１０ｄ，２０ｄ，３０ｄ，４０ｄ，５０ｄ，６６ｄ，７０ｄ时分别测量皮肤中虾青素和总类胡萝卜素的含量，见表４。５；在饲养的７０ｄ内，对照组鱼虾青素和总类胡萝卜素含量显著下降（ｐ＞Ｏ．０５），而实验组鱼皮肤中的虾青素含量和总类胡萝卜素含量基本呈上升趋势，即使在后来停食添加虾青素的饲料的２０ｄ内，虾青素和总类胡萝卜素含量没有下降，反两有小蜷上井，最终鳞片中虾青素和总类胡萝卜素含量均显著高于对照组（ｐ＜０．０５）。第州章爵生“球藻采潭的土Ｆ青蠡的话２忭＆ｊ‘Ｊ＊用衲捌表４．５暴加虾青素对鱼皮肤中虾青鬃和总类胡萝ｐ羹古量的彤晌Ｔａｂ．４．５ＥｆｆｅｃｔｏｆｆｅｅｄｉｎｇａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｏＲａｓｔａｘａｎｔｂｉｎａｎｄ协协ｌｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｃｏｎｔｅｎｔｏｆｓｋｉｎａ实验前鱼体色ｂ时照组７０ｄ后鱼体色ｃ实验组５０ｄ后鱼体色ｄ实验组７０ｄ后鱼体色圈４．５雨生红球蕞来潭的虾青素对血薅薅的着色兢果Ｆｉｇ．４．５ＰｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＣｉｃｂｌａｓｏｍａｃｉｔｒｉｎｅｌｌｕｍｊＣｓｙｎｓｐｉｌｕｍｗｉｔｈａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ从本实验结果束看．饲料中添加４００ｍｇｋ９１的虾青索能使血鹦鹉鳞片、皮鬻垒氛球藻戆培养及其虾青索煞提取、稳定性鞍庭用研究肤中的虾青素、总类胡萝卜素含量增加，随着时间的延长，与对照组相比，着色效果十分显著（觅图４．Ｓ＞。在关于虾青素的着色效果方面研究，菌内矫学者研究结果较为～致。匈枭等（２０００）开展了啜食添赧虾青素酶饲料对花玛蘸鱼酌着色研巍，绪榘发现隧着时闻的延长花玛丽鱼鱼体总类胡萝｝、素的含量是逐渐增加。Ｇｏｕｖｅｉａ等（２００３）研究表明喂食添加蘑生红球藻的饲糕能使金鱼获褥最佳的红色色度，与本研究结果期议。ＳｔａｖｒｏｓＣｈａｔｚｉｆｏｔｉｓ等（２００５）研究了虾青素，多．胡萝卜素以及番茄红素对改善红色棘鬃鱼肤色的功效，结果显示只有虾青素能够增加鱼背部皮肤中类胡萝卜索含量，而ｐ．胡萝｝、素和番茄红素均无此效果。Ｙｉ－ＪｕａｎＷａｎｇ等（２００６）研究了类嘏萝｝素蠲料露热带鼹赏鱼精缝（Ｈｙｐｈｅｓｓｏｂｒｙｃｏｎｃａｌｌｉｓｔｕｓ）的着色效果，结果表明与§．葫萝｝、素相比，喂食虾青素和虾青素与§．胡萝卜素混合物饲料的鱼体内虾青素含量较离。总嚣畜之，虾青素具有较强的着色散力，通过喂食添加虾青素的饵辩，可使水产动物呈现鲜艳的体色。另外，从对照组的试验结果来看，喂食不添加虾青素的饲料，鱼体黑色素逐渐褪去（如蓬４．５ｃ），随着个体的增大，体重及体表面积酶增加，瘦出现一定的稀释效应（ＭｅｙｅｒｓａｎｄＬａｔｓｅｈａ，１９９７），色素水乎应有掰下降，但鱼磷孛虾毒素和类胡萝卜素却仍保持在一定水平（冤表霹。４）。可晃在其代谢途径中存在某种机制麓将某些营养物质懿虾青素酶翦体物矮等转化菇虾青素，放霜傻鳞片串懿色素水平维持在特定水平。本试验还观察到血鹦鹉的腮部最早出现着色效果，其次是鳙条（尾鳍、背鳍），再是鳞片，毽是在时间上差别不大。试验１０ｄ詹，喂食添加虾青素的实验组中鱼体皮肤、鳞片串虾青素、类稿萝卜含量便有夺幅增加；实验结束瞬皮默、鳞片中虾青素、类胡萝｝、含量分别是实验前含量的１７４％，１８４％和２０７％，２５６％。由此可觅，色素沉积速搴是缀快酶，基虾青素在鱼鳞中酶沉积速度较皮肤要更快一些。这正好解释７对照组中皮肤的色素含量随镯养进行逐渐下降的现象。囊予色素在皮肤中的沉积速率较低，色素的沉积速率小于鱼体重及体表丽积增大的稀释作用，因此，色素水平逐渐降低（见表４．５）。此外，韩学哲（２００１）研究发现，只有饲喽到一定时闻，鱼俸表总类耪萝｝、素静含量才会增加，试验过程孛出现一个平台期，即在开始的～段时间内（２０ｄ以上）体表总类胡萝卜素的含量处一个７４第四章雨生红球藻来源的虾青素的稳定性及其应用初探比较稳定的水平，没有沉积或沉积速率较低，与本研究结果稍有差异，这可能与鱼的种类不同有关。不同鱼对类胡萝卜素沉积途径和效率不同，目前对鱼类色素的代谢途径还不十分清楚（陈斌等，２００４），可能类胡萝卜素被吸收后先沉积在其他部位，然后再转运到体表，因此体表中的类胡萝卜素含量只有到一定时间才会增加。在停食添加虾青素的饲料２０ｄ，实验组的虾青素和类胡萝卜素含量均没有显著变化，可见雨生红球藻来源的虾青素具有较强的色素保持力。综上，在饲料中添加适量的雨生红球藻来源的虾青素能显著提高血鹦鹉的生长和着色。３．５．３雨生红球藻来源的虾青素对血鹦鹉的机体抗氧化能力研究血鹦鹉肌肉中总抗氧化能力（ＴＡＣ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）及丙二醛（加Ａ）等指标随时间的变化见图４．１。从图中可以看出，随着时间的延长，实验组血鹦鹉肌肉中ＴＡＣ均显著高于对照组，与此相反，实验组血鹦鹉肌肉中的ＳＯＤ与ＣＡＴ活性以及ＭＤＡ含量均显著低于对照组。１６ｌ４ｌ２ｌＯ０８０６０４Ｏ２Ｏ０富旦曼动曼售８∞７５雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究著呈曹岩善舌饲养时间（ｄ）图４．８对照组和实验组血鹦鹉肌肉中ＴＡＣ，ＳＯＤ，ＣＡＴ和ＭＤＡ的比较Ｆｉｇ．４．８ＴＡＣ，ＳＯＤ，ＣＡＴａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｎｄＭＤＡｃｏｎｔｅｎｔｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ—ｆｅｄ（ＡＸ）ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｆｉｓｈａｔｅａｃｈｓｐｅｃｉｆｉｃｔｉｍｅｐｏｉｎｔ注：＿，ｂ，ｃ表示组内不同时间点值的差异性；ｘ，ｙ表示组间同一时间点的差异性。机体在氧化代谢过程中会产生大量有害的自由基，主要包括活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ），如０２，Ｈ２０２，ＯＨ‘，１０２。这些自由基均具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应，通常在正常的生理条件下，机体有一道特殊抗氧化防线来阻止或减少自由基对机体的氧化损伤作用。作为高等脊椎动物之一，鱼类具有两个主要抗氧化体系，包括非酶体系（维生素Ｃ、维生素Ｅ、还原型谷胱甘肽、Ｂ．胡萝卜素和硒等抗氧化剂）和酶体系。ＴＡＣ作为机体对抗活性氧损伤的总抗氧化能力的表征系数，显示酶系统和非酶系统的抗氧化能力总和，二者在机体内处于一个动态平衡过程，ＴＡＣ值越大，机体总抗氧化能力越强。７６第四章雨生红球藻来源的虾青素的稳定性及其应用初探酶体系包括过氧化氢酶（ＣＡＴ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＰｘ）等（ＨａｌｌｉｗｅｌｌａｎｄＧｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，１９８６；ＷｉｎｓｔｏｎａｎｄＤｉＧｉｕｌｉｏ，１９９１）。ＣＡＴ是过氧化物酶体的标志酶，其作用是促使过氧化氢还原成水和０２，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受Ｈ２０２的毒害；ＳＯＤ催化超氧化物阴离子自由基歧化为过氧化氢与氧气，过氧化氢又在ＣＡＴ的作用下和氢离子反应，最终生成了一种对人体无害的物质一水。ＣＡＴ和ＳＯＤ活性高低体现了酶体系对总抗氧化能力的贡献大小；ＭＤＡ表征机体内的脂质过氧化产物的含量，ＭＤＡ含量越低，表明机体抗氧化能力越强（Ｗｉｎｓｔｏｎ１９９８：Ｃｈｉｅｎｅｔａ１．，２００３；ＲｏｓｓｅｔａｎｄＤｉＧｉｕｌｉｏ，１９９１；Ａｎｄｅｒｓｅｎｅｔａ１．，ａ１．，２００１）。因此，与对照组相比，实验组具有较低ＭＤＡ值和较高ＴＡＣ值，表明喂食虾青素添加饲料的鱼具有更强的抗氧化能力，而实验组中ＳＯＤ和ＣＡＴ活性显著低于对照组，表明酶体系对ＴＡＣ贡献小，由此可推断实验组中ＴＡＣ的增加是来自非酶体系抗氧化能力的增强，虾青素属于非酶系统，其独特的的分子结构决定了其具有活泼的电子效应，能向自由基提供电子或吸引自由基的未配对电子而清除自由基，从而起到抗氧化作用（Ｓｔａｒｔｌｅｒｅｔａ１．，１９７１；陈宇炜等，２０００）。综上，在饲料中添加适量的雨生红球藻，能促进血鹦鹉的生长，并明显提高鱼体的体色和机体抗氧化能力。机体抗氧化能力的提高能保护组织免受氧化损伤，增强体质，提高抗病能力，增强食欲，促进吸收，从而也有利于鱼体的生长和着色。血鹦鹉是目前市面上一种较为高档的观赏鱼，由于其属于杂交种类，因而遗传性质不稳定，从而表现出易褪色的特点，严重影响市场价值。而且幼鱼全体黑色，外源色素的摄取对于其体色的转变有重要意义，因此本研究结果为血鹦鹉的饲养提供一定的科学参考。４小结本实验开展了雨生红球藻来源的虾青素对温度、光照、碱浓度以及还原剂的稳定性研究，同时探讨了雨生红球藻来源的虾青素对血鹦鹉鱼生长、着色及抗氧化能力的影响。结果表明：（１）温度高于４０℃可影响色素的稳定性，因此为防止色素的降解，虾青素应保存在低于４０℃的条件下：雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究（２）光照可导致虾青素的降解。不同光照对虾青素稳定性影响作用的大小顺序为避光＜室内光＜室外光。故虾青素的处理、保存，应尽可能避光操作；（３）虾青素对碱不稳定，碱浓度越大，游离虾青素降解越严重；因此虾青素酯皂化过程中应选择合适的碱浓度和皂化时间，以减小碱对虾青素的降解作用；（４）添加一定量的还原剂对虾青素有较好的保护作用，可使虾青素保存一周时间内含量基本没有变化；（５）与对照组相比，喂食添加雨生红球藻饲料的鱼在生长、着色以及机体抗氧化能力均有显著提高。第五章结语第五章结语１主要研究成果１．１培养方式的研究本文首先开展了混合营养和异养培养方式下的最佳碳源及其浓度研究，并在此基础上比较了光合自养、异养培养和混合营养培养三种营养方式对雨生红球藻的生长和虾青素积累的影响，继而在最佳营养方式的条件下开展半连续培养模式研究，主要结论如下：（１）混合营养和异养培养条件下，醋酸钠均是较丙二酸钠更适于雨生红球藻生长和虾青素积累的碳源，其最佳初始浓度分别为１．０ｇ‘Ｌ．１和２．０ｇ。Ｌ．１，其细胞平均生长速率分别为０．２９ｄ。１和Ｏ．１３６ｄ一；胁迫７ｄ后细胞干重和虾青素含量分别为０．９８７＋０．１０ｌｇ‘Ｌ－１，２０．３０４＋０．７０５ｍｇ。Ｌ－１和０．７６３＋０．０５１ｇ‘Ｌ－１，１４．９２８４－０．５１８了。因此结果表明以１．０ｇ＇Ｌ。醋酸钠为碳源的混合营养方式是适合雨生红球藻培养的最佳营养方式。（２）开展了最佳营养方式下的半连续培养模式研究，结果表明较一次培养，半连续培养模式下一定的更新率（２０％，３０％）能显著促进生长，使第一阶段的生物量增加２．２倍和３．７倍；胁迫条件下，各更新率下的细胞存活率显著高于一次培养（庐Ｏ．０５），而不同更新率之间的细胞存活率没有显著差别（矿０．０５）；此外不同更新率下的藻粉总产量、藻粉产率、虾青素总产量及虾青素产率均显著高于一次培养，其中２０％更新率组的藻粉产率最高，达１．３２ｇ·Ｌ．１；而３０％更新率组的虾青素产率最高，达２２．９４ｍｇ·Ｌ～，与２０％更新率组差异不显著（矿０．０５）。（３）利用光生物反应器培养雨生红球藻，能使雨生红球藻细胞获得快速生长，提高生物量，并缩短胁迫周期。但虾青素的产率并不高，这是因为光生物反应器培养体积大，削弱了胁迫光强，从而降低了高光胁迫的效果。同时比较了不同初始密度对光生物反应器培养效果，发现较低的接种密度有利于光生物反应器中营养盐利用与细胞生长维持在相对较佳的动态平衡，从而提高综合培养效果。ｍｇ·Ｌ一，混合营养较对照组（光合自养）提高２５％和２１％，而异养培养则下降雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究１．２雨生红球藻中虾青素的Ｃ０２超临界萃取工艺研究本实验以虾青素提取率为指标，通过考察萃取压力、萃取温度、Ｃ０２萃取流速三因素对该指标的影响，对Ｃ０２超临界萃取工艺进行了初步摸索，应用中心组合实验设计原则和响应面法分析，确定了最佳工艺条件为：萃取压力４４．６ＭＰａ，萃取温度６４．２℃，Ｃ０２流速７．１Ｌ·ｈ．１，萃取时间３．５ｈ，在此条件下获得的虾青素提取率可达１．０２８％。与常规的溶剂提取法相比，虽然此法的虾青素提取率偏低。但是该法进样量大，工艺流程简便，且该方法不会引入溶剂污染，萃取所使用的Ｃ０２气体和乙醇均可回收利用，消耗低，十分环保。若进一步研究改进，提高其虾青素的提取效率，将有望成为规模化生产虾青素的提取设备。１．３雨生红球藻来源的虾青素的稳定性及其应用的初步研究本实验开展了雨生红球藻来源的虾青素对温度、光照、碱浓度以及还原剂的稳定性研究，同时探讨了雨生红球藻来源的虾青素对血鹦鹉鱼生长、着色及抗氧化能力的影响。主要结论如下：（１）温度高于４０℃可影响色素的稳定性，因此为防止色素的降解，虾青素应保存在低于４０℃的条件下；（２）光照可导致虾青素的降解。不同光照对虾青素稳定性影响作用的大小顺序为避光＜室内光＜室外光。故虾青素的处理、保存，应尽可能避光操作；（３）虾青素对碱不稳定，碱浓度越大，游离虾青素降解越严重；因此虾青素酯皂化过程中应选择合适的碱浓度和皂化时间，以减小碱对虾青素的降解作用；（４）添加一定量（０．２％）的ＢＨＴ还原剂对虾青素有较好的保护作用，可使虾青素保存一周时间内含量基本没有变化；（５）与对照组相比，喂食添加虾青素饲料的鱼在生长、着色以及机体抗氧化能力均有显著提高。喂食添加虾青素饲料实验组鱼体增重３００％，较对照组提高５０％；鱼皮肤、鳞片中虾青素、类胡萝卜含量分别是实验前含量的１７４％，１８４％和２０７％，２５６％；实验过程中，鱼肌肉中的ＴＡＣ活性始终显著高于对照组，ＳＯＤ活性、ＣＡＴ活性、ＭＤＡ含量较对照组均下降了，可见喂食添加虾青素柏第五章结语饲料的实验组鱼机体的总抗氧化能力提高了，而来自酶体系的抗氧化能力下降了，可以推断作为非酶体系的虾青素在抗氧化过程中发挥了重要作用。２主要创新点与特色（１）本文由营养方式结合培养模式对雨生红球藻的培养方式进行较为系统的研究，提出了以１ｇ·Ｌ４醋酸钠作为混合营养碳源在半连续更新率为２０％或３０％的培养方式，可有效促进雨生红球藻生长和虾青素的积累；（２）在国内首次开展了利用Ｃ０２超临界萃取雨生红球藻中虾青素的工艺研究，利用中心组合设计实验与响应面分析方法，建立了最佳工艺条件为：萃取压力４４．６ＭＰａ，萃取温度６４．２℃，Ｃ０２流速７．１Ｌ·ｈ．１，萃取时间３．５ｈ；（３）率先开展了雨生红球藻来源的虾青素对血鹦鹉观赏鱼的应用研究。３存在的不足与展望本文培养方式的研究中缺少对胁迫阶段孢子比例的观测，以及培养过程中营养盐消耗的监测，因而无法非常确切的讨论培养方式的变革对虾青素含量提高的机理，对结果多数处于比较、描述阶段；光生物反应器的高密度培养效果不显著，其培养参数如溶氧、ｐＨ、搅拌速率等有待于进一步探索；雨生红球藻来源虾青素的应用研究中未设定浓度梯度，无法获得最佳效果的作用浓度，此外未测定肌肉中虾青素的含量以及色素在血鹦鹉鱼体中的沉积形式，从而无法探讨虾青素在该类鱼体中的迁移转化规律。今后将在以上几方面进一步研究。雨生红球藻作为天然虾青素的最佳生物来源之一无疑具有广阔的发展前景。目前国外已经已有少数几家公司实现了天然虾青素的微藻生产，在生产技术上形成了垄断，导致天然虾青素的市场价格居高不下，而国内至今仍未具备规模生产的相关技术。纵观国内，近年来关于利用雨生红球藻生产天然虾青素的实验室研究已经十分充分，因此进一步开展培养方式的优化，新型光生物反应器的研发，虾青素的提取工艺及纯化技术的改进等，使雨生红球藻生产虾青素的技术尽快从“室内”走向“室外”，实现雨生红球藻室外开放式的大规模生产，将是今后的努力的方向。８１雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究—————。———————————————————————————————————————————————～一：＝：：：：——一．参考文献Ａｂｄｏｌｍａｊｉｄ，Ｋａｚｕｍｉｃｈｉ，Ｋｅｉｓｈｉｅｔａ１．Ｆｅｄ·Ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｂｙｂｌｕｅｌｉｇｈｔｅｍｉｔｔｉｎｇｄｉｏｄｅｄ（ＬＥＤｓ）ｆｏｒａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００５，３：３３９－３４２．ＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＡｋｏＨ·ａｎｄＴａｍａｒｕＣ。Ｓ．Ａｒｅｆｅｅｄｓｆｏｒｆｏｏｄｆｉｓｈｐｒａｃｔｉｃａｌｆｏｒａｑｕａｒｉｕｍ１９９９，２：３０．．３６．ＢａｒＥ·，Ｒｉｓｅｕｐｏｎｌｉｇｈｔｆｉｓｈ明．Ｉｎｔｌ．ＡｑｕａＦｅｅｄｓ，Ｍ·，ＶｉｓｈｋａｕｔｓａｎＭ．，ｅｔａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎａ１．ＰｉｇｍｅｎｔａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎＣｈｌｏｒｅｉｌａｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９５，１４６：５２７．５３４．ｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＢｅｌｌＪ．，ＭｃＥｖｏｙＪ．，ＴｏｃｈｅｒＤ．Ｒ，ｅｔａ１．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎｏｆｕ－ｔｏｅｏｐｈｅｒｏｌａｎｄａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｉｎＡｔｌａｎｔｉｃｓａｌｍｏｎ（Ｓａｌｍｏｓａｌａｒ）ａｆｆｅｃｔｓ１３０：１８００．１８０８．Ｂｏｒｏｗｉｔｚｋａａｕｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｄｅｆｅｎｓｅａｎｄｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．Ｊ．Ｎｕｔｒ，２０００，Ｍ·，ＨｕｉｓｍａｎＪ．Ｍ．ａｎｄＯｓｂｏｍＡ．ＣｕｌｔｕｒｅＰｌｕｖｉａｌｉｓ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｎｕｔｒｉｅｎｔｓｏｎｏｆｔｈｅａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ—ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｇｒｅｅｎａｌｇａｌＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，１９９ＢｏｕｓｓｉｂａＳ．，Ｆａｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｃｅｌｌｓｔｙｐｅ［Ｊ］．Ｊ．ｏｆＡｐｐｌｉｅｄ１，３（４）：２９５·３０４．ＶｏｎｓｈａｋＬ．ａｎｄＡ．ＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｇｒｅｅｎａｌｇａｅＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９９２，２１３：３８６．３９１．ａｎｄｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｅｏｃｃｕｓＣｈｅｎＥ，ＣｈｅｎＨ．，ｅｔａ１．Ｍｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌｂｅｈａｖｉｏｕｒｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓ１９－２４．ＣｈｏｕｂｅｒｔＩ∞ｕｓｔｒｉｓ勰ｄ９９７，６２（１－２）：ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１Ｇ．ａｎｄＨｅｉｎｒｉｃｈＯ．ＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｐｉｇｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｇｒｅｅｎａｌｇａＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｂⅣｔ越ｉＳ：ｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｓｓａｙ０１１ｒａｉｎｂｏｗｔｒｏｕ乞Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓａｎｄｍｙｋｉｓｓ，ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ【Ｊ】．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９３，１１２：２１７．２２６．ａｎｄｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎｗａｔｅｒｉｎＣｈｏｕｂｅｒｔＧ，ＳｔｏｒｅｂａｋｋｅｎｔａｎｄＦａｕｃｏｒｍｅａｕＢ．Ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｒａｉｎｂｏｗｔｒｏｕｔａｓａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｄｉｅｔａｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｆｅｅｄｉｎｇｒａｔｅａｎｄｓａｌｉｎｉｔｙ［Ｊ］．Ａｎｎ．Ｚｏｏｔｅｃｈ，１９９６，４５：４４５－４５３．ＣｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎＰ．，ＧｌｅｔｔｅＪ．，Ｌｉｅ０．，ｅｔａ１．ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓｔａｔｉｓａｎｄｉｍｍｕｎｉｔｙｉｎＡｔｌａｎｔｉｃＳａｌｍｏｒｔ，ＳａＩｍｏｓａｌａｒＬ·，ｆｅｄｓｅｍｉ。ｐｕｒｉｆｉｅｄｄｉｅｔｓｗｉｔｈＤｉｓｅａｓｅｓ，１９９５，１０２：３３３．３３６．Ｒ２ａｎｄｗｉｔｈｏｍａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ【Ｊ】．ＪＦｉｓｈ参考文献Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ－ＢｏｃａｎｅｇｒａＡ．１Ｌ，ＧｕｅｒｒｅｒｏＬｅｇａｒｒｅｔａＩ．，ＭａｒｔｉｎｅｚＪｅｒｏｎｉｍｏＦ．，ｅｔａ１．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌａｎｄｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ【Ｊ】．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，９２：２０９－２１４．ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｂｙＦｆｉｂｒｅｇａｓＪ．，ＤｏｍｉｎｇｕｅｚＡ．，ＡｌｖａｒｅｚＤ．Ｇ，ｅｔａ１．ＩｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎａｎｄｍａｇｎｅｓｉｕｍｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓｉｎＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，２０（６）：６２３－６２６．ＦｆｉｂｒｅｇａｓＪａｉｍｅ，ＯｔｅｒｏＡｎａ，ＭａｓｅｄａＡ鸭ｅｔａ１．Ｔｗｏ－ｓｔａｇｅｃｕｌｔｕｒｅｓｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍＨａｅｍａｔｏｃｏｅｅｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，８９：６５－７１．ＦａｎＬ．，ＶｏｎｓｈａｋＡ．ａｎｄＢｏｕｓｓｉｂａＳ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｉｒｒａｄｉａｎｃｅｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）［Ｊ］．ＪＰｈｙｃｏｌ，１９９４，３０：８２９—８３３．ＦｅｎｇＣｈｅｒｔ，ＣｈｅｎＨｕｉ，ｅｔａ１．ＭｉｘｏｔｒｏｐｈｉｃａｎｄｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｅｅｕｓｌａｅｕｓｔｒｉｓａｎｄｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ１９．２４．ｂｅｈａｖｉｏｕｒｏｆｔｈｅｃｅｌｌｓｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，６２（１－２）：Ｇｏｎｇ，Ｘ．ａｎｄＣｈｅｒｔＥＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，３３（４）：３８５—３９１．ＧｒａｄｅｌｅｔＳ．，ＢｕｎＡＭ．Ｌ．，ＢｅｒｇｅｓａｎｄＤＮＡＲ．，ｅｔａ１．ＤｉｅｔａｒｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｉｎｈｉｂｉｔａｆｌａｔｏｘｉｎＢＩ－ｉｎｄｕｃｅｄｌｉｖｅｒｄａｍａｇｅｉｎｔｈｅｒａｔ：ｒｏｌｅｏｆｔｈｅｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｔｉｃｆｏｃｉｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，１９９８，１９（３）：４０３．ＧｒｕｎｇＭ．，Ｄ’ＳｏｕｚａＦ．Ｍ．Ｌ．，ＢｏｒｏｗｉｔｚｌｏＭ．，ｅｔａ１．Ａｌｇａｌｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ５１．Ｓｅｃｏｎｄａｒｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ２．ｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓａｐｌａｎｏｓｐｏｒｅｓＡｐｐｌｉｅｄＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，１９９２，４：１６５—１７１．ＨａｇｅｎＣ．，Ｇｒｕｎｅｗａｌｄａｓａｓｏｕｒｃｅｏｆ（３Ｓ，３’Ｓ）－ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｅｓｔｅｒｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌＫ．，ＸｙｌａｎｄｅｒＭ．，ｅｔａ１．ＥｆｆｅｃｔｆｌａｇｅｌｌａｔｅｄｏｆｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｉｇｍｅｎｔｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｃｅｌｌｓｓｏｆＨａｅｍａｔｏｅｏｃｅｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．ＪＡｐｐｌＰｈｙｅｏｌ，２００１，１３：７９—８３．ＨａｉｌａａｎｄＫ．Ｍ．，ＮｉｅｌｓｅｎｔｏｌｕｅｎｅａｔＢ．Ｒ．，ＨｅｉｎｉｎｅｔＭ．，ｅｔａ１．Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｘｙｇｅｎｐａｒｔｉａｌｐｒｅｓｓｕｒｅｓ．ＡｎＥＳＲｓｐｉｎ－ｔｒａｐｐｉｎｇａｃｅｒｏｎｅｓｔｕｄｙｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙＨａｒｋｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ［Ｊ］．ＺｅｉｔＦｕｅｒＬｅｂｅｎ－ＵｎｔｅｒｓＦｏｒｓｃｈ，１９９７，２０１（２）．８１－８６．Ｍ．ａｎｄＹｏｕｎｇＡ．Ｊ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｔｈｅｇｒｅｅｎａｌｇｅ，ＨａｅｍａｔｏｃｏｃｅｕｓＪｏｕｒｎａｌＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＨａｒｋｅｒｏｆＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，１９９５，３０（３）：１７９－１８７．Ａ．Ｊ．Ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｇｒｏｗｔｈ８３Ｍ．，ＴｓａｖａｌｏｓＡ．Ｊ．，Ｙｏｕｎｇａｎｄｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究ＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓｉｎａ３０ｌｉｔｅｒａｉｒ－ｌｉＲｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｅｔｏｒ［Ｊ１．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９６，８２：１１３—１１８．Ｈａｒｋｅｒ溉，ＴｓａｖａｌｓＡ。Ｊ。ａｎｄＹｏｕｎｇＡ，工ＦａｃｔｏｒｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＣｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｅｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，５５（３）：２０７－２１４．ＨａｒｋｅｒＭ．。ＴｓａｖａｌｓＡ．Ｊ．ａｎｄＹｏｕｎｇＡ．Ｊ．Ｕｓｅｏｆｒｅｓｐｏｎｓｅ－ｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｃａｔｏｔｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｔｈｅｍｉｃｒｏａｌｇａＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ只鼯藏露基阴。Ｊ。ｏｆＡｐｐｌｉｅｄＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，１９９５，７（４）：３９９－４０６．ＨａｔａＮ．，ＯｇｂｏｎｎａＪ＿Ｃ．，ＨａｓｅｇａｗａＹ＝，ｃｔａ１．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｂｙＨａｅｍａｔｏｃｏｃｅｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓｉｎａｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ－ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｃｕｌｔｕｒｅ囝。Ｊ。ｏｆＡｐｐｌ。Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，２００１，１３（５）：３９５－４０２．ＨｅＥ，ＤｕｎｃａｎＪ．，ｅｔａ１．ＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｇｒｅｅｎａｌｇａＨａｅｍａｔｏｃｏｃｅｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓ［Ｊ］．ＪＯＵｌＴｌａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２００７，毒９（笱：４４７－４５１。ＩｎＳｏｏＳｕｂ，ＪｏｏＨｙｕｎ－Ｎａ，ｅｔａｌ。Ａｎｏｖｅｌｄｏｕｂｌｅ—ｌａｙｅｒｅｄｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｆｏｒｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓｃｅｌｌｓｇｒｏｗｔｈａｎｄａｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，１２５（４）：５４０—５４６。ｌｐｐＥａｎｄＣｈｅｎＲＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｂｙｔｈｅｇｒｅｅｎｍｉｃｒｏａｌｇａＣｈｌｏｒｅｌｌａｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓｉｎｔｈｅｄａｒｋ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，４０（２）：７３３－７３８．ＪｏｈｎｓｏｎＥ．Ａ．ａｎｄＡｎＱＨ。Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｏｕｒｃｅｓ嘲．ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，１１：２９７－３２６。ＪｙｏｎｏｕｃｈｉＨ．，ＳｕｎＳ．，ＭｉｚｏｋａｍｉＭ．，ｅｔａ１．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓＴ－ｈｅｌｐｅｒｃｅｌｌｓａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．ＮｕｔｒＣａｎｃｅｒ’１９９６，２６（３）：３１３－３２１．ＫａｅｗｐｉｎｔｏｎｇＫ．，ＳｈｏｔｉｐｒｕｋＡ。，或ａｌ。Ｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｅｅｌｌｓｓｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｅｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ２８８．２９Ｓ．ＫａｎｇＣ。Ｄ．，Ｌｅｅｊ。Ｓ．，ｅｌａｌ。Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｏｎｃｌｏｎｅｄ，ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｓｔａｇｅｉｎａｉｒｌｉＲｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃ圯Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，９８（２）：ａｎｄｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂＹＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，６８（２）：２３７—２４１．ＫａｎｇＣ。Ｄ．，Ｌｅｅｊ。Ｓ．，ｅｌ：ａ１．ＰｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｅｎｃｙｓｔｍｅｎｔｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓｂｙｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇａｓｐｅｃｉｆｉｃｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｒａｔｅｉｎｐｈｏｔｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｉｎｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｌｆｆｎａｌｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，ｌ２（５）：７４５－７４８．鼬参考文献ＫｏｂａｙａｓｈｉＭ．，ＫｌｌｋｉｚｏｎｏＴ．ａｎｄＮａｇａｉＳ．Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙａｇｒｅｅｎａｌｇａ，ＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄｗｉｔｈｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎａｃｃｔａｔｅ７１：３３５．３３９．ｍｅｄｉａ［Ｊ］．Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ，１９９１，ＫｏｂａｙａｓｈｉＭ．，ＫａｋｉｚｏｎｏＴ．ａｎｄＮａｇａｉＳ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙｏｘｉｄａｔｉｖｅａｃｅｔａｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｓｔｃｅｌｌｓｓｏｆａｓｔｒｅｓｓｉｎｇｒｅｅｎｕｎｉｃｅｌｌｓｕｌａｒａｌｇａ，ＨａｅｍａｔｏｅｏｅｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，５９（３）：８６７－８７３．ａｎｄＫｏｂａｙａｓｈｉＭ．，ＫｕｒｉｍｕｒａＹＴｓｕｊｉＹＬｉｇｈｔ·ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｔｈｅｇｒｅｅｎｍｉｃｒｏａｌｇａＨａｅｍａｔｏｅｏｅｅｕｓＰｌｕｖｉａｌｉａｕｎｄｅｒｓａｌｔＬｅｅＨ．Ｓ．，Ｓｅｏｓｔｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ，１９９７，ｌ９（Ｄ：５０７－５０９．Ｍ．Ｗ：，ｅｔａ１．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅｂｅｓｔｓｐｅｃｉｆｉｃｌｉｇｈｔｕｐｔａｋｅｒａｔｅｓｆｏｒｔｈｅｌｕｍｏｓｔａｔｉｃｃｕｌｔｕｒｅｓｉｎｂｕｂｂｌｅｃｏｌｕｍｎ４４７－４５２．Ｌｅｅｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，３９（３）：Ｓ．Ｈ．，ＣｈｅｄＷ．Ｅ，ＷｏｎｇＳ．Ｒ，ｅｔａ１．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｂｅｎｚｏ（ａ）ｐｙｒｅｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｍＯＵＳｅＣｈｅｍＢｉｏｌｅｃｈｎｏｌ，１９９７，ｆｏｒｅｓｔｏｍａｃｈ４０（６）：４９０．ＬｉＨｕａ－Ｂｉｎｍｉｃｒｏａｌｇａｎｅｏｐｌａｓｉａｂｙａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｅｇｇｙｏｌｌｃｓ唧．ＡｇｒｉｃａｎｄＣｈｅｎＦｅｎｇＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍｔｈｅｏｆＣｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍｓｐ．ｂｙｈｉｇｈ·ｓｐｅｅｄｃｏｕｎｔｅｒ－ｃｕｒｒｅｎｔｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＡ，２００１（９２５）：１３３－１３７．ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｏｕｔｄｏｏｒｃｕｌｔｕｒｅｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｏｆＬｏｐｅｚＭ．，ＳａｎｃｈｅｚＥ．Ｄ．，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｐｌｕｖｉａｌｉｓｉｎｔｕｂｕｌａｒａｎｄｂｕｂｂｌｅｃｏｌｕｍｎｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，１２３（３）：３２９－３４２．Ｌｏｒｅｎｚ＆Ｔ．ａｎｄｓｏｕｒｃｅＣｙｓｅｗｓｋｉＧＲＣｏｍｍｅｒｃｉａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒＨａｅｍａｔｏｅｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓａｓａｎａｔｕｒａｌｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ［Ｊ］．Ｔｉｂｔｅｃｈ，２０００，１８：１６０—１６７．Ａ．ａｎｄＢｏｕｓｓｉｂａＳ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｉｒｒａｄｉａｎｃｅｏｎＬｕＦ．，ＶｏｎｓｈａｋｇｒｏｗｔｈｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ．（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）【Ｊ】．Ｊ．ｏｆＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，１９９４，３０（５）：８２９—８３３．ＭａｃｈｍｕｄａｈＳ．，ＳｈｏｔｉｐｒｕｋＡ．，ｅｔａ１．ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓｕｓｉｎｇｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｃ０２ａｎｄｅｔｈａｎｏｌａｓｅｎｔｒａｉｎｅｒ［Ｊ］．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ＆ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＣｈｅｍｉｓｔｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ，２００６，４５（１０）：３６５２－３６５７．ＭａｒｔｉｎＧｕｅｆｉｎ，ＭａｒｋＥ．ＨｕｎｔｌｅｙａｎｄＭｉｇｕｅｌＯｌａｉｚｏｌａ．Ｈａｅｍａｔｏｅｏｃｃｕｓａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｆｏｒｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈａｎｄｎｕｔｒｉｔｉｏｎ［Ｊ］．ＴＲＥＮＤＳＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，２１（５）：２１０—２１６ａｎｄＭｅｎｄｅｓＲ．Ｌ．，ＦｅｍａｎｄｅｓＨ．Ｌ．，ＣｏｅｌｈｏＪ．Ｐ．，ｅｔａ１．ＳｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌＣ０２ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和成用研究ｏｔｈｅｒｉｉｐｉｄｓｆｒｏｍＣｈｌｏｒｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ【Ｊ】．ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，５３：９９—１０３．Ｍｉｋｅ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓ１４１－１４６。ａｎｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｎｉｍａｌｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ［Ｊ］．ＰｕｒｅＡｐｐｌｅ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，６３：ＭｏｒｔｅｎｓｅｎＡ．，ＳｋｉｂｓｔｅｄＬ．Ｈ．，ＳａｍｐｓｏｎＪ．，ｅｔａ１．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｒａｔｅｓｏｆｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｂｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，１９９７，４１８：９１－９７．ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍＨａｅｍａｔｏｃｏｅｅｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓＳｏｃｉｅｔｙ，２００３，８０（１０）：９７５－９８１．Ｎａｇａｏｔ，Ｆｕｋａｍｉ鼍，ｅｔａｌ。Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆｃｅｌｌｓｅｘｔｒａｃｔｓ［ｆ１．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＯｉｌＣｈｅｍｉｓｔｓＮａｇｕｉｂＹＭＡ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｎｄｒｅｌａｔｅｄｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ［Ｊ］．ＪＡｇｄｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２０００，４８：１１５０．ＮｉｓｈｉｋａｗａＹ．，ＭｉｎｅｎａｋａＹ．ａｎｄＩｃｈｉｍｕｒａＭ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ０ａｅｔａ－ｅａｒｏｔｅｎｅａｎｄａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ）ｏｎｒａｔｔＪ］．ＫａｓｈｉｅｎＤａｉｇｋｕＫｉｙｏ，１９９７，２５：１９．ＮｏｂｒｅＢ。，ＭａｒｃｅｌｏＥ，露ａｌ。ＳｕｐｅｒｃｒｉｔｉｅａｌｃａｒｂｏｎｄｉｏｘｉｄｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｎｄｏｔｈｅｒｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｆｒｏｍｔｈｅｍｉｃｒｏａｌｇａＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，２２３（６）：７８７－７９０．ＯｋａｉＹａｎｄＨｉｇａｓｈｉ－ＯｋａｉＫ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｉｎｖｉｔｒｏｃｅｉｌｓｃｕｌｔｕｒｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｉ黔ｔＪｌｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９６，１８（１２）：７５３·７５９。ＯｒｏｓａＭ．，ＦｒａｎｑｕｅｉｒａＤ．，ＣｉｄＡ．，ｅｔａ１．ＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］。ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，９６：３７３－３７８．ＯｒｏｓａＭ。。ＦｒａｎｑｕｅｉｒａＤ．，ＣｉｄＡ。，ｅｔａｌ。ＣａｒｏｔｅｎｏｉｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓｉｌｌｍｉｘｏ仃ｏｐｈｉｃｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．，２００１，２３（Ｓ）：３７３—３７８．ＯｒｏｓａＭ．，ＶａｌｅｒｏＪ。Ｅ，ｅｔａ１．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｏｔｈｅｒｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｉｎＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｕｎｄｅｒＮ－ｓｔａｒｖａｔｉｏｎＦｌｕｖｉａｌｉｓａｎｄｇｒｅｅｎｍｉｃｒｏａｌｇａｅａｎｄｈｉｇｈｌｉｇｈｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ啊．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２００１，２３（１３）：１０７９－１０８５．ＲａｎｊｂａｒＲｅｚａ，ＳａｔｏｓｈｉＹｏｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｌｉｇｈｔｆｏｒａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ酚Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ２００６，１０２（２）：９７—１０１．ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ［Ｊ］，ＲｉｓｅＭ．，ＣｏｈｅｎＥ．，ＶｉｓｈｋａｕｔｓａｎＭ．，ｅｔａ１．ＡｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓｉｎＣｈｌｏｒｅｌｌａｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ［Ｊ］。ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１９９４，１４４：２８７－２９２。ＳａｒａｄａＲ．。ＴｒｉｐａｔｈｉＵ。ａｎｄＲａｖｉｓｈａｎｋａｒＱＡ．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｓｔｒｅｓｓｏｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉＩｌＨａｅｍａｔｏｅｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓｇｒｏｗｎｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ】．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８６参考文献２００２，３７：６２３－６２７．Ｓａｒａｄａ＆，Ｖｉｄｈｙａｖａｔｈｉ１Ｌ，墩ａ１．ＡｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｆｒｏｍｇｒｅｅｎａｌｇａＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕａＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］。ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｔｔｒａｌａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，５４（２０）：７５８５－７５８８．ＳｈｉｎｉｄｚｕＫａｎｄＧｏｒｏＭ。ＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｓＦｉｓｈｅｒｉｅｓａｓｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎｑｕｅｎｃｈｅｒｓｉｎｍａｒｉｎｅｏｒｇａｎｉｓｍ圈．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，耽￡ｌ≥１３１。Ｈ．－Ｎ．，ｅｔａｌ。ＡＳｕｂＩ．Ｓ．，ＪｏｏＨａｅｍａｔｏｃｏｅｅｕｓｎｏｖｅｌｄｏｕｂｌｅ－ｌａｙｅｒｅｄｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｏｆＰｌｕｖｉａｌｉｓｃｅｌｌｓａｓｔａｘａｎｔｈｉｎａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，１２５（４）：５４０－５４６。ＴａｎＳ．，ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍＦ．Ｘ．，ＹｏｕｍａｎｓＭ．，战ａ１．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ－ｆｌｏｓｓｉｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ－ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｒｃｄ－ｃｅｌｌｓｓｏｆＨａｅｍａｔｏｅｏｅｅｕａＰｌｕｖｉａｌｉｓ。（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓａｎｄｔｈｙｌａｋｏｉｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｌｏｙｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎｒｅｄａｎｄｇｒｅｅｎｃｅｌｌｓｓ［Ｊ］＋Ｊ．ｏｆＰｈｙｃｏｌｏｇｙ，１９９５，３ｌ翰：￥９％９０５．ＴｊａｈｏｎｏＡ。Ｅ．，ＨａｙａｍａＹ。，Ｋａｋｉｚｏｎｏｔ，ｅｌａｔａ１．Ｈｙｐｅｒａｃｃｕｍｌａｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｉｎａｇｒｅｅｎ－ａｌｇａＨａｅｍａｔｏｃｏｅｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ１３３－１３８．Ｔｏｍｏｈｉｓａｂｙｅｌｅｖａｔｅｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ［Ｊ］。ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅＲｅｒｓ，１９９４，３０：Ｋａｔｓｕｄａ，ＡｂｄｏｌｍａｊｉｄＬａｂａｂｐｏｕｒ，ＫａｚｕｍｉｃｈｉＳｈｉｍａｈａｒａ，ｅｔａ１．ＡｓｔａｘａｎｔｈｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎＨａｅｍａｔｏｃｏｃｅｕａＰｌｕｖｉａｌｉｓｔｍｄｅｒｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ弼馕ＬＥＤｓ踢。ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，３５：８１－８６．ＴｒｉｐａｔｈｉＵ。，ＳａｒａｄａＲ。ａｎｄＲａｖｉｓｈａｎｋｅｒＧＡ。Ｅｆｆｅｃｔｏｆｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｇｒｏｗｔｈｏｆｇｒｅｅｎａｌｇａ－ＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕａＰｌｕｖｉａｌｉｓａｎｄａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］。Ａｃｔａｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅｐｌａｎｔａｒｕｍ，２００２，２４（３）：３２３－３２９．ＴｒｉｐａｔｈｉＵ．，ＳａｒａｄａＲ．，ＲａｏＲ．，ｅｔａ１．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｉｎＨａｅｍａｔｏｃｏｃｅｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓｃｕｌｔｕｒｅｉｎｖａｒｉｏｕｓｍｅｄｉａｉｎａｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ阚．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，６８：１９７－１９９．Ｖｅｇａ－Ｅｓｔｒａｄａ重，Ｍｏｎｔｅｓ－ＨｏｒｃａｓｉＴＡＣＭ。Ｃ．，ｅｔａｌ。ＨａｅｍａｔｏｃｏｃｅｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｓｐｌｉｔ－ｃｙｌｉｎｄｅｒｉｎｔｅｒｎａｌ—ｌｏｏｐａｌｆｌｉＲｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｕｎｄｅｒａｅｒａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｖｏｉｄｉｎｇｃｅｌｌｓｄａｍａｇｅ［Ｊ］。ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，６８《１）：３１－３５．ＸｉａｎｄｉＧｏｎｇａｎｄＣｈｅｌａＦｅｎｇ．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｎａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，３３（４）：３８５·３９１．ｔｈｅｇｒｅｅｎａｌｇａＨａｅｍａｔｏｃｏｅｅｕｓｌａｃｕｓｔｒｉｓＸｙｌａｎｄｅｒＭ．ａｎｄＢｒａｕｎｅＷ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｎｉｃｋｅｌ８７ｏｎ雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究ｒｏｓｔａｆｍｓｋｉｉｎｐｈａｓｅｓｏｆｉｔｓｌｉｆｅＹｕａｎＪ．ＥａｎｄＣｈｅｎｃｙｃｌｅ叨．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１４４：８６－９３．ｆｒｏｍａＥ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓ－ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄｉｎｇａｓｔａｘａｎｔｈｉｎｅｓｔｅｒ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｌ＇ａｉｌｌｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏａｌｇａＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ４４３－４４８．Ｃｈｅｍｉｓｔｒ．２０００，６８（４）：蔡明刚，王杉霖．利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展们．台湾海峡，２００３，２２（４）：５３７－５４４．曹学丽．高效逆流色谱分离技术与应用【Ｍ】．化学化工出版社，２００５．陈虹，张承红．超临界流体萃取及其在我国的研究应用进展［Ｊ】．化工进展，１９９９，１８（３）：２２７．２３４．陈晓明，徐学明，金征宇．法夫酵母色素的组成与性质【Ｊ】．无锡轻工业大学学报，２００１，２０（２）：１６９．１７３．陈兴才，黄伟光，欧阳琴．雨生红球藻培养及虾青素累积条件探讨【Ｊ】．中国食品学报，２００６，６（０４）：４１－４５．陈兴才，欧阳琴，黄亚治．雨生红球藻物理破壁法提取虾青素研究【Ｊ】．中国食品学报，２００７，７（０２）：４８—５２．程伟，陈兴才．雨生红球藻ｆａｃｈｂ．７１２快速繁殖生长的适宜条件叨．福建医科大学学报，２００７，４１（０１）：７５－８０．耿予欢，魏东，李国基等．极地雪衣藻的研究进展【Ｊ】．天然产物研究与开发，２００７，１９：１７５．７９．胡章立，吴玉荷，罗杏桃．雨生红球藻细胞类型转化影响因子的协同作用叨．深圳大学学报（理工版），２００２，１９（０３）：８·１２．黄水英，齐安翔，李哲等．几种胁迫方式对雨生红球藻积累虾青素影响的初步研究ｆＪ】．海洋科学集刊，２００８（待刊）．蒋霞敏，柳敏海，任凯来．化学因子对雨生红球藻诱变株虾青素积累的调控田．宁波大学学报（理工版），２００５，ｌ８（３）：３０６－３１２．金传荫，宋立荣，刘永定等．红球藻水生７４８株（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＨＢ７４８）培养基的选择与对维生素Ｂ１２的需求【Ｊ】．应用与环境生物学报，１９９７，３（２）：１７７－１７９．金竹萍．超临界流体萃取技术的应用及研究进展【Ｊ】．山西化工，２００７，２７（２）：４２－４６．廖传华，黄振仁．超ｌ临界Ｃ０２流体萃取技术一工艺开发及其应用［Ｍ】．北京：化学钩过农业出版社，２００４．刘均玲，缪锦来，王全富等．南极酵母Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｓｐ．ＮＪ·２９８产虾青素的初步研究【Ｊ】．中国参考文献海洋药物，２００６，２５（０２）：１７—２１．刘伟，刘建国，王伟等．雨生红球藻规模化培养工艺的构建与应用【Ｊ】．饲料工业，２００６，２７（１２）：１２·１７．孟春晓，高政权．外源赤霉素对雨生红球藻中虾青素积累的影响叨．水产科学，２００７，２６（０５）：２４９－２５４．欧阳琴，陈兴才，黄亚治．雨生红球藻提取虾青素不同机械破壁方法的研究【Ｊ】．福州大学学报（自然科学版），２００５，３３（０１）：１１１一１１５．齐安翔．雨生红球藻高产虾青素培养基及培养模式的若干研究【Ｄ】．厦门：厦门大学海洋与环境学院，２００６．邱保胜，刘其芳．红球藻研究进展叨．水生生物学报，２０００，２似５）：５４６－５５４．邱保胜，刘其芳．雨生红球藻（ＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ．６Ｂ）培养条件研究【Ｊ】．华中师范大学学报（自然科学版），１９９９，３３（１）：１１２一１１８．屈健．虾青素的开发与应用【Ｊ】．中国饲料，２００２，（１８）：１９－２１．施安辉，贾朋辉，张治国等．酵母菌发酵虾青素研究的进展【Ｊ】．中国酿造，２００４，１３７（０８）：ｌ一３．施安辉和萧海杰．目前国内外虾青素研究的进展【Ｊ】．生物工程进展，１９９９，１９（０１）：２９－３１．唐仕荣．超临界Ｃ０２萃取技术及其在天然产物提取中的应用【Ｊ】．化工时刊，２００７，２ｌ（７）：７１－７４．汪洪涛．虾青素的性质与开发【Ｊ】．食品工程，２００６（４）：１８－３４．王劲，段舜山．活性氧对雨生红球藻生长及虾青素含量的影响【Ｊ】．生态科学，２００６，２５（０３）：２１３－２１５．王进波．虾青素的开发与应用【Ｊ】．饲料研究，２０００（０８）：１５－１７．王灵昭，邓家权．微波法提取雨生红球藻中虾青素的工艺研究阴．食品研究与开发，２００７，１２８（１２）：９６－１００．魏东，小君．天然虾青素的超级抗氧化活性及其应用【Ｊ】．中国海洋药物，２００１，８２：４５－５０．魏东，臧晓南．大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状阴．中国海洋药物，２００１，８３（０５）：４．８。魏东，臧晓南．大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状【Ｊ】．中国海洋药物，２００１，８３（０５）：４－８．吴彩娟．天然虾青素提取和纯化工艺研究【Ｄ】．浙江：浙江大学材料与化学学院，２００３．吴江，刘子贻，朱寿民．烷化剂ＮＴＧ诱变虾青素产生菌红法夫酵母的研究【Ｊ】．微生物学通报，８９雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和废用研究２００１，２８（０２）：３３－３７．吴霞，康瑞娟，越威等。转光膜在雨生红球藻养殖上的应用闭。过程工程学报，２００６，６（６）：９６９－９７２。向文洲，吴华莲，谢科等．一种绿球藻的极端适应特性与虾青素高效诱导忉．热带海洋学报，２００７，２６（０１）：５０—５４．时勇，应巧兰。用气升式光生物反应器大量培养蕊生红球藻７９７株的初步研究潮．饲料王业，２００３，２４（０５）：１１－１３．殷明焱，划建国，张京浦等．雨生红球藻和虾青素研究评述田．海洋湖沼通报，１９９８（２）：５３－６２。翟兴文，蒋霞敏，陆开形．雨生红球藻的优化培养研究【Ｊ】．水利渔业，２００２，（５）：１６－１８．张宝玉，李夜光，李中奎等．温度、光照强度和ｐＨ对雨生红球藻光合作用和生长速率的影响翻。海洋与潮灞，２００３，３４（０５）：５５８·５６５。张镜澄。超临界流体萃取ｔＭ］。北京：化学工业出版社，２０００．张亮，朱湘民．一株产虾青素的黄杆菌Ｃ㈨的研究．微生物学通报，１９９９，２６（５）：３３２．３３５张先华，金青，缪锦来等．虾青素制备薪方法研究闭。化王生产舄技术，２００５，１２（０６）：１４－１８。张英，蔡明刚，齐安翔等。维生素Ｂｌ、Ｂ１２在雨生红球藻不同培养阶段的作用研究【Ｊ】．厦门大学学报（自然科学版），２００４，４３（Ｓ１）：１４２—１４６．赵立艳，辕芳，廖小军等．影响雨生红球溱孛虾脊素的挺取条件的研究湃．食最科学，２００６，２７（０３）：１１０－１１４。周湘池，刘必谦，曾庆国等．雨生红球藻（ＨａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓＰｌｕｖｉａｌｉｓ）破壁方法对虾青素提取率的影响闭．海洋与湖潜，２００６，３７（０５）：４２４－４２９．庄惠如，施巧琴，卢海声等．营养胁追对藕生红球藻虫下青素累积的影响明。永生生物学报，２０００，２４（３）：２０８—２１２。庄惠如，陈必链，芏明兹等。雨生红球藻混合营养与异养培养研究田．微生物学通报，２０００，２７（０３）：１９８—２０１．庄惠如，陈文列，卢海生等．雨生红球藻不同形态细胞的超微结构研究【Ｊ】．应用与环境生物学报，２００１，７（５）：４２８－４３３．庄惠絮，卢海声，陈必链莓．薅生红球藻营养细胞的虾青素累积圈。承生生物学报，２００１，２５“）：３７６－３８０．研究生期间工作总结附录参与的科研项目：１．厦门市重点科技项目：利用雨生红球藻生产天然虾青素及其模式研究（２００３．２００６）；２．福建省科技项目：鱼类废弃物加工鱼蛋白调味品技术研究（２００６—２００７）；３．新加坡厦大校友会基金会：天然虾青素的微藻培育及生产新技术研究（２００７——２００９）；４．厦门大学大学生创新计划：天然虾青素的雨生红球藻高产藻株选育及其培养调控因子改良技术研究（２００７．２００８）；５．国家自然科学基金：珠江口及南海北部ＰＡＨｓ的输出动力学研究（２００３．２００６）；６．厦门湾及九龙江口多环芳烃的地球化学行为研究（２００５．２００７）；７．福建闽江口航道疏浚工程海洋环境影响评价（２００５）；８．福建罗源湾航道增深工程海洋环境影响评价（２００６）；９．福州港福清湾深水航道工程海洋环境影响报告书（２００８）；１０．泉州湾综合整治环境影响评价（２００８）。、参加的学术会议：１．２００７年中国海洋湖沼学术年会（上海）；２．２００７年中国科学院海洋所首届海洋研究生论坛（青岛）。９１雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究发表论文及摘要：ｌ，黄水英，齐安翔，李哲，李晓梦，王蕴，蔡骢刚。．几种胁迫方式对褥生红球藻积累虾青素影响的初步研究田．海洋科学集刊，２００８，４９．２．李晓梦，齐安翔，蔡明刚。，庞卫文，张英，黄水英．雨生红球藻室外大体积培养及虾青素积累的初步研究四．厦门大学学报（皇然科学版），２００６，４５（增刊）：２４５．２４９．３．郭建青，钱碧华，党爱翠，庄宏儒，陈登辉，孙炯辉，王蕴，黄水英，齐安翔，刘晓艳，丘灿荣，蔡明刚’．厦门九龙辽ｉ霹墨区海水中溶解和颗粒态Ｃｕ、Ｐｂ、Ｃｄ的地球化学行为阴．厦门大学学报（自然科学版），２００７，４６（增刊）：５４．６１。４．钱碧华，孙炯辉，粱榕源，黄水英，蔡明刚‘．ＩＣＰ．ＭＳ法测定中国北部湾海水中的Ｐｂ［Ｊ］．绿色财富论坛文选（上卷）．北京：中国环境科学出版社，２００７：２６１。５．黄水英，蔡明刚‘，齐安翔，吴锐，张英，陆晓霞，石荣贵．稀土元素（Ｌａ，Ｃｅ）对雨生红球藻生长及虾青素积累的影响．中国海洋与湖沼年会２００７年．６．蔡明刚‘，齐安翔，黄水英，张英．ＣＢＢＭ培养基：居于高产虾青素的雨生红球藻ＢＢＭ培养基的优化改良。中豳海洋与潮沼年会２００７年．７．ＣａｉａｎｄＭＧＷａｎｇＸＨ，Ｑｉｕｓｏｕｒｃｅｓｃ心Ｇｕｏ坦，ＨｕａｎｇＳＹ，ＨｏｎｇｏｒｇａｎｏｃｈｌｏｒｉｎｅＬＹ．Ｌｅｖｅｌｓ，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓｏｆｐａｒｉｃｕｌａｔｅｐｅｓｔｉｄｅｓｉｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｓｅａｗａｔｅｒｆｒｏｍｔｈｅＳｏｕｔｈｅｒｎＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＳｅａ．２７斑ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｓｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＨａｌｏｇｅｎａｔｅｄＰｅｒｓｉｓｔｅｎｔＯｒｇａｎｉｃＰｏｌｌｕｔａｎｔｓ，２００７．８．ＣａｉＭｉｎｇｇａｎｇ，ＧｕｏＪｉａｎｑｉｎｇ，ＱｉＡｎｘｉａｎｇ，ＨｕａｎｇＳｈｕｉｙｉｎｇ，ＳｕｎＪｉｏｎｇｈｕｉ，ＬｉｕＸｉａｏｙａｎ，ＱｉｕＣａｎｒｏｎｇ，ＷａｎｇＹｕｎ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｓｏｕｒｃｅｓａｎｄｓｅａｓｏｎａｌｔｒｅｎｄｏｆｄｉｓｓｏｌｖｅｄａｎｄｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃａｒｏｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓｆｒｏｍＪｉｕｌｏｎｇＷｅｓｔＨａｒｂｏｒａｎｄｅｓｔｕａｒｙ，Ｘｉａｍｅｎ，Ｃｈｉｎａ．１铲ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌａＥｓｔｕａｒｉｎｅＢｉｏｇｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＳｙｍｐｏｓｉｕｍ（Ｅｓｔｕａｒｉｅｓｉｎｃｈａｎｇｉｎｇｗｏｒｌｄ），２００８．致谢致谢论文完稿，首先感谢我尊敬的导师蔡明刚副教授。从论文选题、设计、实施到完稿，点点滴滴无不凝聚着导师的心血。在此，我衷心感谢蔡老师三年来在学习上、生活上给予我耐心的帮助及悉心的关怀。蔡老师开阔的视野，严谨拼搏靛科研风格以及高效的工作效率深深地感染和激励着我。再次向远在北极的蔡老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！感谢艾春香老师、陈军老师在论文修改过程孛给予建设性的指导和耐心的素助，论文中每个细节都离不开你们精心的推敲，你们严谨细致、一丝不苟的作风令我钦佩，你们的谆谆教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪！感谢李文权教授、郑爱结教授、王宪教授、邓永智副教授、郑雪红老师、陈丁老师、刘誊兰老师在学习和科研上给予的帮助和指导。感谢海洋与环境学院教学实验中心的刘瑞华老师、李育芳老师、庄敏老师为实验提供了微藻培养和观测所需的仪器设备。感谢海洋三所林建云老师提供了基础饲料的成分参数。在此，谨向所有给予过关心和帮助的老师致以最诚挚的谢意！感谢师弟石荣贵、沈渊，师妹陆晓霞、李哲在实验方面给予的大力支持和帮助ｌ感谢同组同学钱碧华、刘晓艳、王蕴、孙炯辉、丘灿荣、林静，谢谢你们对我工作上的支持和生活中给予的关怀与照顾，忘不了一起走过的岁月，愿我们的友谊长存！感谢一起学习和生活过的同学郑盛华师兄、金贵娥师姐、梁燕茹师姐、林芳、周伶云、林培梅、张刚强、童金炉、李娜、田春雨、马志凯、连忠廉等同学平时给予的支持和照顾，同窗之情，此生难忘！最后要感谢我的父母，及关心我的家人和朋友，感谢你们给予我信心和勇气，使我战胜困难，不断前进ｌ愿你们永远健康快乐！雨生红球藻的培养及其虾青素的提取、稳定性和应用研究
作者：
学位授予单位：
黄水英厦门大学
1.期刊论文 庄惠如.陈必链.王明兹.卢海声.施巧琴.ZHUANG Hui-Ru.CHEN Bi-Lian.WANG Ming-Zi.LU Hai-Sheng.SHI Qiao-Qin 雨生红球藻混合营养与异养培养研究 -微生物学通报2000,27(3)
研究雨生红球藻混合营养生长与异养生长对碳源及碳源浓度的需求,并对两种生长型进行比较.结果表明,乙酸钠较葡萄糖等其他碳源更能维持红球藻进行混合营养生长与异养生长.红球藻混合营养型生长与异养型生长的适宜乙酸钠浓度范围分别是0.5～1.0g/L和1～1.5g/L.混合营养型及异养型的平均生长速率分别是0.72d-1和0.53d-1,培养8d的细胞干重分别是0.65g/L和0.32g/L.与光养型(对照)相比,混养型的各种生长指标均明显提高,异养型则下降.
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1443393.aspx
下载时间：2010年6月27日
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