摘要：本文利用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）法分析松针高温水提物、乙醇提取物、己烷提取物、高温正己烷（HWH）提取物、高温乙醇（HWE）提取物的抗氧化活性。与其他提取物相比，松针高温水提取物具有较强的抗氧化能力。对于MC3TW-E1细胞活性氧（ROS）的产生，高温水提物也表现明显较强的抑制能力，细胞内ROS含量最低。各种提取物经过高效液相色谱法（HPLC）分析的结果显示，松针高温水提物中原花青素的含量最高，经过Sephadex LH-20 的纯化，测定了松针高温水提物的抗氧化活性。结果表明第7组分和第12组分含有的原花青素和儿茶素的含量最高，抗氧化能力最强。这些结果表明松针高温水提物的抗氧化能力与其所含有的高聚原花青素和单体儿茶素的含量成正相关。此外，松针高温水提物的抗氧化能力与常见的抗氧化剂，如维生素C类似，这表明，松针含有的原花青素和儿茶素可能用作另一种抗氧化剂。
关键词：DPPH；ROS；HPLC分析；原花青素；松针
1 前言
自由基和其他活性氧物质是机体在某些外源性化学物质入侵或内源性代谢过程中产生的。活性氧（ROS），包括超氧自由基（O2-）、羟自由基（OH-）、过氧化氢（H2O2），能与DNA、脂质和蛋白质迅速反应，造成细胞损伤。有研究表明，一些酶具有清除H2O2，保护细胞免受活性氧伤害的作用[1]，这些酶包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶[2]。酚类化合物能提供氢原子自由基，因此具有抗氧化能力。许多酚类化合物，特别是黄酮类化合物，具有广泛的生物学效应，包括抑菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、抗血栓、舒张血管等[3]。多酚是一种次生代谢产物，广泛存在在整个植物界。为了抑制ROS产生，为了生存，植物产生各种抗氧化的化合物。几乎所有可以食用的植物中都含有多酚类化合物。植物多酚是著名的天然抗氧化剂。据最近的研究报道称，食物中的茶多酚可以在老年疾病和预防癌症起到重要作用。
松树（赤松）是松科(Pinaceae)植物，在世界各地广泛种植。在东亚，如韩国和中国等国家，松树的各个部分，包括松针、松实、松树皮、松香，均可食用或制成保健品[4]。在亚洲，松针还被制成饮料，该松针饮料甚至可以作为普通治疗高血压等的药品[5]。此外，松针还能抑制白血病细胞的生长[6]和防止羟自由基的氧化作用导致的DNA损失和诱导细胞凋亡 [7]。和从类似的材料（如松树皮）的提取物一样，松针还具有其他的生物学效应，比如药理性的抗氧化、抗增殖、抗炎作用[8-10]。
原花青素，又称为缩合单宁，是最古老的植物次生代谢物。这些化合物在木本植物中广泛存在，但发现在草本植物中也含有一定的原花青素。随着茶和其他具有生物学效应的植物产品的出现，人们发现儿茶素和原花青素具有强抗氧化能
力[11,12]。红葡萄酒和葡萄籽的多酚类成分主要是原花青素，具有强效的抗氧化活性[13,14]。最近，大量的研究表明，除了抗肿瘤作用，原花青素还能增强化疗的作用，同时拮抗化疗药物对正常细胞的毒性[15,16]。原花青素是生物类的黄酮，天然的多酚化合物，以黄烷-3-醇为单位组成多羟基低聚物或高聚物，如（+）-儿茶素、（-）-表儿茶素[17]。
松树皮和葡萄籽中的原花青素的研究很多，而松针中原花青素的含量及其抗氧化活性的研究很少。在本文中，为了检验松针的抗氧化活性，我们用不同的溶剂提取松针中的原花青素，然后用DPPH法测定松针不同溶剂提取物的抗氧化活性。MC3T3-E1成骨细胞是可接受的研究多种病理状态下细胞调节氧化应激作用，包括成骨细胞骨的形成的一种体外成骨模式细胞[18]。因此，我们可以利用MC3T3-E1细胞比较松针不同的提取物清除ROS的抗氧化能力。此外，用高效液相色谱法（HPLC）测定各种提取物中的原花青素的含量，然后选择含量最高的提取物，用Sephadex LH-20分离其中的原花青素，之后测定其抗氧化活性。
2 材料与方法
2.1试剂：
2,2-二苯基-1-苦肼（DPPH），L（+）-抗坏血酸，（+）-儿茶素（最低98%）：Sigma（美国圣路易斯）；
Acetonitril HPLC ultra Gradient和methanol HPLC：JT Baker (美国新泽西州)； Sephadex LH-20：GE Healthcare (瑞典斯德哥尔摩)；
α-MEM Hank's 平衡盐溶液(HBSS)，FBS：Gibco BRL (美国纽约格兰德岛)； 磷酸：JUNSEI (日本东京)；
DCF-DA：Invitrogen 公司(美国加利福尼亚)。 2.2 松针提取物的制备
根据以往的研究，用研钵将松针研磨成粉[19]。1Kg松针分别溶于2L蒸馏水、乙醇、己烷，80℃水浴加热12h，得到相应的提取物。然后收集水溶性馏分，分别用乙醇（HWE）和己烷（HWH）提取。12h后，用Whatman滤纸进行减压过滤，得到松针提取物滤液和固体残渣。将滤液至于-20℃备用。 2.3 DPPH（2,2-二苯基-1-苦肼）法分析松针提取物清除自由基的能力
根据Duan等人[20]研究的测定样品清除DPPH自由基的能力的方法，将各提取物稀释并溶于99%甲醇中，并配置一系列浓度为1,000μg/mL、500μg/mL、250 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL 、10 μg/mL的待测样品，置于96孔的微板上。准确量取100μL不同浓度的待测样品，分别置于试管中并依次加入2,900μL配置好的DPPH·溶液（120 μM），混合均匀，将试管置于室温下反应30 min，反应完成后用酶标仪在517 nm下测定吸光值。由下式计算各种松针提取物清除DPPH的能力：
DPPH清除率（%）=[(A0-A1)/ A0] ×100 A0-空白溶液的吸光度； A1-待测液的吸光度；
半抑制浓度指当清除率达50%时样品浓度记为IC50。以原花青素做为阳性对照，所有的测试重复三次。 2.4 清除细胞内ROS的活性
将MC3T3-E1成骨细胞接种在含有10%胎牛血清抗生素的α-MEM（Gibco BRL ，美国纽约格兰德岛），于5%CO2，37℃的培养箱中培养，培养液每周换两次。然后弃培养基，加入PBS清洗细胞两次，轻轻洗去培养基，得到单层细胞。将细胞移入离心管，1,100rpm离心3min。然后加入α-MEM Hank's 平衡盐溶液(HBSS)和DCF-DA，在37℃下反应2h得到细胞悬浮液。反应结束后，去除HBSS，加入PBS。将所得到的含有DCF-DA的MC3T3-E1成骨细胞接种在96孔微板上，加入50μg/mL的松针提取物（或10μg/mL原花青素标准物）和H2O2。采用多功能微孔板检测仪，以激发波长485nm，发射波长528nm，测量每个孔中的荧光强度。
2.5 赤松松针原花青素的高效液相色谱分析（HPLC-UV）
利用高效液相色谱分析法（HPLC）可以测定松针高温水提物、乙醇水提物、正己烷水提物、HWE提取物和HWH提取物中的原花青素的含量。首先将不同的提取物分别溶解在1 mL /mg的甲醇溶液中，然后用0.45μm的膜进行过滤，利用5mm的SupelcoSil LC-18 (内径为250 × 4.6 mm) 色谱柱，以乙腈（A）和0.3%磷酸（B）为二元流动相，流速0.7mL /min，UV280nm，反相分离提取物中的原花青素。从10%A到20%A的一个线性梯度洗脱，需要45min，之后在20min内到达60%。
2.6 高温水提物的柱层析分离
称取Sephadex LH-20（50g）粉末，用100%的高效液相甲醇试剂浸泡，缓慢装在层析柱（5×30cm的玻璃柱）上，将高温水提物（500mg）加到装好Sephadex LH-20的层析柱中，10mL为一组，收集30组，然后用Whatman2号试纸进行过滤。每组滤液用DPPH法直接确定其高效液相色谱中的抗氧化化合物。 2.7 统计分析
所用实验数据均测量三次，采用平均值±标准差（SD）表示。利用Duncan’s多重范围测试对统计的数据进行单向方差分析（ANOVA）。其中，P值小于0.05，表示结果理想。
3 结果
3.1 清除DPPH自由基的能力
DPPH法的实验原理是：DPPH在可供氢的抗氧化剂作用下转变为非自由基形式的DPPH-H，从而清除DPPH[21]。DPPH自由基是一种稳定的自由基，已被广泛应用于检测植物和水果提取物、食物材料内主要的抗氧化剂的抗氧化成分
[22]
。图1表示的是松针提取物清除DPPH自由基的能力。由图可知，清除能力
最强的是松针高温水提取，其次是乙醇提取物、HWE提取物、正己烷提取物和HWH提取物。松针高温水提物对DPPH的清除能力与提取物浓度成正相关，且在水提物浓度达到250~500μg/mL时，清除能力达到最强，可清除超过82%的自由基。松针乙醇提取物的结果类似高温水提物，在浓度为1000μg/mL清除能力达到最高，是所研究松针提取物中提供电子能力第二强的。另一方面，松针正己烷提取物和HWH提取物提供电子的能力低于20%，是所研究松针提取物中提供电子能力最差的。此外，高温水提物的抗氧化能力与常见的抗氧化剂，如维生素C类似（表1）。
图1 松针提取物对DPPH的清除力
表1 浓度为500μg/mL的松针提取物对DPPH的清除能力（IC50）
注：
1） 2） 3）
IC50指清除50%DPPH时的样品浓度。
所用实验数据均测量三次，采用平均值±标准差（SD）表示。 利用Duncan’s多重范围测试对统计的数据进行显著差异分
析。其中，P值小于0.05，表示结果理想。
3.2 松针提取物对活性氧（ROS）的作用
为了研究松针提取物ROS清除活性，我们用松针提取物的馏分培养成骨细胞。以原花青素为阳性对照，分析松针提取物ROS清除能力。大多数的溶剂提取物对ROS的抑制研究通常是先用H2O2处理30min，产生100%ROS后才开始实验的。如图2所示，原花青素能抑制H2O2 刺激产生的ROS。此外，松针高温水提物能抑制H2O2 刺激产生的ROS，使其保持在原来水平。而HWE提取物能造成ROS的大量生成，ROS的浓度可以达到61.72%。这些结果表明，与其他溶剂的提取物相比，松针高温水提物具有ROS抑制能力。
图2 不同松针提取物对H2O2 诱导的活性氧的影响
注：将含有DCF-DA或没有松针提取物的MC3T3-E1成骨细胞移入定量比色皿，加入0.3mM的H2O2，使用多功能微孔板检测仪测量荧光强度，以表示MC3T3-E1成骨细胞中的ROS含量。
3.3 确定原花青素的HPLC分析法的改进
Federico Peterlongo[23] 用HPLC法确定原花青素聚合物，其结果显示该法不能出现一个单一的峰值，而且灵敏度较低，需要后期的分析，因此，需要改变原花青素HPLC分析中流动相的浓度以进一步分析原花青素。原先采用的方法是
（A）：乙腈为溶剂A，0.3%磷酸为溶剂B，从10%A到20%A，45min，之后在20min内到达60%。现采用方法事（B）：从10%A到20%A，35min，之后在20min内到达90%。如图3所示，（B）法使得分析原花青素的时间由60min变为47min，减少了约13min，而且这种方法能显示出一个单一的峰值，灵敏度较高。我们使用类似这样的HPLC法测定了原花青素的含量。
图3 新开发的（A）和Federico Peterlongo1999年（B）HPLC法分析原花青素标准物的
色谱图
3.4 HPLC法分析松针原花青素的含量
采用HPLC法测定松针提取物中原花青素的含量，结果如表2所示。松针高温水提物含有最高的原花青素含量，达到30.54mg/g，其次是松针的乙醇提取物，达到30.11mg/g。而松针正己烷提取物和HWH提取物中的原花青素的含量最低，分别为8.67mg/g和3.41mg/g。这些结果表明松针提取物中的原花青素可能是亲水性的。之后，具有最高原花青素含量的提取物，即松针高温水提物，经过Sephadex LH-20分离其中具有抗氧化活性的物质。
表2 HPLC法测定松针提取物中原花青素含量的结果
注：
1） 2）
所用实验数据均测量三次，采用平均值±标准差（SD）表示。 利用Duncan’s多重范围测试对统计的数据进行显著差异分
析。其中，P值小于0.05，表示结果理想。
3.5 高温水提物经Sephadex LH-20分离后的抗氧化活性
由于提取物中含有一些复杂的成分，人们很困难一一确定其中的每一种抗氧化成分[22]。从1974年至今，Sephadex LH-20作为一种较广泛测定原花青素的材料，可以按分子量大小分离物质，更重要的是可以较好地提纯物质[24]。具有最强抗氧化活性的松针高温水提物经过Sephadex LH-20色谱层析法精制后，使用DPPH法测定了抗氧化活性。结果如图4表示，用Sephadex LH-20法分离的第6组到第21组物质的抗氧化活性在50%以上，第7组的抗氧化活性最高，其次是第12组。之后，通过HPLC法分析引起第7组和第12组抗氧化活性高的物质。
图4 高温水提物不同组分清除DPPH自由基能力
3.6 HPLC法分析水提物组分中原花青素的结构
原花青素是以黄烷-3-醇为单位组成的低聚物或高聚物，最常见如儿茶素、表儿茶素、和/或没食子酸酯[25]。
为了研究抗氧化剂的抗氧化组分，本实验采用HPLC法分析原花青素。经过与标准的化合物的检测和验证，确定了两种原花青素：儿茶素和原花青素（图5）。经过HPLC法分析组分7吸收峰最高，为原花青素；组分12含有最多的儿茶素。这些结果表明，高温水提物的强抗氧化能力可能是由于其含有原花青素和儿茶素组分。因此，这表明亲水性多酚，如儿茶素和原花青素的存在，能够使松针高温水提物具有较强的抗氧化作用。
图5 高温水提物第7组和第12组成分的HPLC分析
4 讨论
原花青素，又称为缩合单宁，是最古老的植物次生代谢物。这些化合物在木本植物中广泛存在，但发现在草本植物中也含有一定的原花青素。随着茶和其他具有生物学效应的植物产品的出现，人们发现儿茶素和原花青素具有强抗氧化能力。从松树中提取的生物类黄酮被证实能够清除小鼠巨噬细胞形成的自由基，表现出较强的清除活性氧的作用[26]。在细胞水平上，用DPPH法比较松针不同溶剂提取物的抗氧化活性来研究提取溶剂对松针提取物抗氧化活性的影响。结果表明，松针高温水提物表现出最强的清除DPPH自由基能力，而松针HWH提取物清除DPPH自由基最弱，该结果与Jeong等人[7]的研究结果高度相似。而根据现有研究，松针提取物清除DPPH自由基的能力归因于松针提取物是亲水性的化合物。在本实验中，猜测松针抗氧化成分是水溶性的，而任何能溶解在脂溶性溶剂，如己烷等的成分都不能表现出活跃的抗氧化活性。
机体抗氧化防御机制与体内活性氧（ROS）之间的平衡失调导致的氧化应激反应与很多疾病有关，如动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等[27]。活性氧（ROS），包括过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH-）、过氧化亚硝酸盐（ONOO-），是线粒体呼吸作用的副产物，或是某些酶，比如尼古丁腺嘌呤二磷酸 (NADPH) 氧化酶、黄嘌呤氧化酶（XO），和花生四烯酸氧化酶的代谢产物[28]。为了研究松针提取物清除ROS的活性，用松针不同溶剂的提取物培养成骨细胞（MC3T3-E1），以原花青素为阳性对照，比较松针不同溶剂提取物对ROS的作用。大多数的溶剂提取物对ROS的抑制研究通常是先用H2O2处理30min，产生100%ROS，然后开始实验的。实验表明，原花青素能抑制H2O2 刺激产生的ROS。此外，松针高温水提物能抑制H2O2 刺激产生的ROS，使其保持在原来水平。而HWE提取
物能造成ROS最大量的生成。这些结果表明，与其他溶剂的提取物相比，高温水提物具有ROS抑制能力。在本实验中，松针水溶性成分在表现抗氧化作用方面表现出积极的作用。
我们系统地比较了提取原花青素的方法。Ku等人[29]用水、丙酮和正己烷提取马尾松树皮中的原花青素。Souquet等人[30]使用凝胶体积排阻色谱的正相高效液相色谱法纯化葡萄皮中的六聚原花青素，但是这个程序太复杂，太昂贵，不适合大众商业生产使用。Federico Peterlongo[23] 用HPLC法确定原花青素聚合物的方法不能出现一个单一的峰值，而且灵敏度较低，需要后期的分析，因此，需要新的HPLC测量原花青素含量的方法。图4显示的是松针提取物在反相高效液相色谱法中的结果，该结果表明与松针其他溶剂的提取物相比，松针高温水提物中的原花青素含量最高，而松针HWH提取物中的原花青素的含量最低。这些结果表示，与脂溶性的溶剂相比，水溶性的溶剂更能从松针中提取原花青素，且原花青素的含量多，较集中。
与以正己烷为溶剂的提取方法相比，高温水提物对人体无害，似乎更适合作为功能性食品。此外，以甲醇和丙酮作为提取溶剂的食品是禁止在韩国口服使用的。在本研究中，松针提取物的抗氧化活性与其中原花青素的含量有关，松针高温水提物的强抗氧化能力是其中原花青素和儿茶素协同作用的复杂结果。
因此，综合考虑提取物中原花青素的含量和抗氧化能力，使用高温水提的方法提取松针中的原花青素最佳。高温水提物的抗氧化能力经过验证后，可能发展成为功能性食品。 参考文献
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