(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109239251 A(43)申请公布日 2019.01.18
(21)申请号 201811134324.9(22)申请日 2018.09.27
(71)申请人 无锡济民可信山禾药业股份有限公
司
地址 214028 江苏省无锡市新区长江南路
12号
申请人 江西济民可信集团有限公司(72)发明人 甘国峰 李璐 於江华 (74)专利代理机构 北京华科联合专利事务所
(普通合伙) 11130
代理人 王为 孟旭(51)Int.Cl.
G01N 30/88(2006.01)G01N 30/86(2006.01)
权利要求书2页 说明书11页 附图2页
(54)发明名称
黄氏响声丸HPLC—ELSD指纹图谱的测定方法
(57)摘要
本发明涉及黄氏响声丸HPLC—ELSD指纹图谱的测定方法，其中所述测定方法，包括以下步骤：供试品溶液的制备、对照品溶液的制备、注入液相色谱仪(蒸发光散射检测器)进行测定，在标准指纹图谱的基础上，用上述测定方法得到的黄氏响声丸质量是否合格的数据，本发明方法简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用于黄氏响声丸样品的质量控制，能更加全面、客观、科学地评价黄氏响声丸的质量，保证该制剂的有效性。
CN 109239251 ACN 109239251 A
权 利 要 求 书
1/2页
1.一种黄氏响声丸HPLC-ELSD指纹图谱测定方法，其特征在于，步骤如下：(1)供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得；
(2)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入HPLC—ELSD色谱仪，测定，并记录色图谱；
(3)将所得色谱图和标准指纹图谱对照，相似度大于0.75为合格品，相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价；
其中，所述的色谱条件如下：
碳十八烷基为固定性的液相色谱柱；流动相：甲醇(A)-0.5％醋酸溶液(B)
流速0.8ml/min柱温30℃进样量20ulELSD条件：温度：80℃；气体流速：1.2L/min。
2.根据权利要求1所述的指纹图谱测定方法，其特征在于，供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
3.权利要求1所述的标准指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤如下：(1)供试品溶液的制备：取多批次黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得；
(2)参比对照品溶液的制备：取连翘苷对照品、大黄酚对照品、大黄酸对照品适量，加入甲醇制成对照品溶液；
(3)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入HPLC—ELSD色谱仪，测定，并记录色图谱；
(4)采用计算机将所得多批次合格的黄氏响声丸HPLC—ELSD色谱图拟合为一个标准指纹图谱；
其中，所述HPLC-ELSD色谱仪的色谱条件如下：碳十八烷基为固定性的液相色谱柱；
2
CN 109239251 A
权 利 要 求 书
2/2页
流动相：甲醇(A)-0.5％醋酸溶液(B)
流速0.8ml/min柱温30℃进样量20ulELSD条件：温度：80℃气体流速：1.2L/min。
3
CN 109239251 A
说 明 书
黄氏响声丸HPLC—ELSD指纹图谱的测定方法
1/11页
技术领域
[0001]本发明涉及中药指纹图谱分析方法，具体涉及黄氏响声丸制剂指纹图谱测定方法，及其所得到的黄氏响声丸制剂指纹图谱。技术背景
[0002]我国传统中药及复方制剂的组成十分复杂，因为其治疗作用是通过整体的协调进行的。因此在对其进行质量评价时应该将其作为一个整体进行。然而一般的质量标准是通过对中药或复方中的某个成分的含量高低来评价。这样难以控制其内在质量。因此为了提高并突出中药的整体性特征，建立符合中药特征的质量控制标准及评价模式。才能逐步符合中药及中药发展的要求，真正的做到“安全、有效、稳定、可控”。
[0003]黄氏响声丸是根据著名喉科老中医黄莘农主任医师奉献的九代祖传秘方研制而成，其主要用于急、慢性喉炎等证。其质量标准收载于《中国药典》2010版一部第1469页，其中鉴别试验包括大黄、川芎、甘草，含量测定检测浙贝母中的贝母素甲和贝母素乙。[0004]该制剂处方包括薄荷、浙贝母、连翘、蝉蜕、胖大海、酒大黄、川芎、儿茶、桔梗、诃子肉、甘草和薄荷脑十二种原材料中的有效成分。[0005]现有的检测方法有：《黄氏响声丸制剂指纹图谱的测定方法及其标准指纹图谱》(专利)，该方法是利用气相色谱仪建立气相色谱的指纹图谱检测方法，对黄氏响声丸中的挥发性成分进行测定分析。
[0006]《高效液相色谱法同时测定黄氏响声丸中5种蒽醌类成分含量》等文献中，新建的含量方法，利用高效液相色谱-UV检测器的手段，主要测定来源酒大黄的7种成分，包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、番泻苷A和番泻苷B。但药典上对于黄氏响声丸质量评价的检测方法是利用高效液相-ELSD检测器，测定贝母素甲，贝母素乙的含量，并无从整体去对该制剂进行评价，因此建立黄氏响声丸HPLC—ELSD指纹图谱方法，从整体上去评价此药。
发明内容
[0007]本发明的目的在于：提供一种黄氏响声丸HPLC—ELSD指纹图谱的测定方法[0008]本发明通过对黄氏响声丸HPLC—ELSD指纹图的研究，提供了一种快速评价该制剂中成分质量的方法，弥补了现有质量控制技术的不足的缺点，使黄氏响声丸制剂质量控制技术更为完善，也更为科学。[0009]为此，本发明提供一种黄氏响声丸气相色谱标准指纹图谱的建立以及使用该指纹图谱对生产和销售中的黄氏响声丸进行测定的方法。[0010]本发明所述的测定方法，其特征在于，步骤如下：[0011](1)供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加
4
CN 109239251 A
说 明 书
2/11页
甲醇稀释至刻度，摇匀即得。[0012](2)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入HPLC—ELSD色谱仪，测定，并记录色图谱。[0013](3)将所得色谱图和标准指纹图谱对照，相似度大于0.75为合格品，相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。[0014]其中，所述的色谱条件如下：
[0015]碳十八烷基为固定性的液相色谱柱；[0016]流动相：甲醇(A)-0.5％醋酸溶液(B)
[0017]
流速 0.8ml/min[0019]柱温 30℃[0020]进样量 20ul[0021]ELSD 条件：[0022]温度：80℃；气体流速：1.2L/min[0023]优选的，其中供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
[0024]本发明进一步提供标准指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤如下：[0025](1)供试品溶液的制备：取多批次黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。[0026](2)参比对照品溶液的制备：取连翘苷对照品、大黄酚对照品、大黄酸对照品适量，加入甲醇制成对照品溶液。[0027](3)测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl注入HPLC—ELSD色谱仪，测定，并记录色图谱。[0028](4)采用计算机将所得多批次合格的黄氏响声丸HPLC—ELSD色谱图拟合为一个标准指纹图谱；[0029]其中，所述HPLC—ELSD色谱仪的色谱条件如下：[0030]碳十八烷基为固定性的液相色谱柱；[0031]流动相：甲醇(A)-0.5％醋酸溶液(B)
[0018]
5
CN 109239251 A[0032]
说 明 书
3/11页
流速 0.8ml/min
[0034]柱温 30℃[0035]进样量 20ul[0036]ELSD 条件：[0037]温度：80℃[0038]气体流速：1.2L/min
[0039]本发明的技术方案是经过筛选获得的，筛选过程如下：[0040]1.仪器与试剂[0041]1.1仪器
[0042]十万分之一电子天平(METTLER TOLEDO)、安捷伦1260液相色谱仪、Alltech 3300ELSD、安捷伦Eclipse SB-C18 4.6*250mm 5um色谱柱。[0043]1.2试剂
[0044]连翘苷对照品、大黄酚对照品、大黄酸对照品、甲醇、乙酸乙酯[0045]2.气相色谱系统条件：
[0046]碳十八烷基为固定性的液相色谱柱；[0047]流动相：甲醇(A)-0.5％醋酸溶液(B)
[0048]
[0033]
流速 0.8ml/min[0050]柱温 30℃[0051]进样量 20ul[0052]ELSD 条件：[0053]温度：80℃[0054]气体流速：1.2L/min[0055]3.供试品溶液制备[0056]取黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
[0057]4.对照品溶液制备
6
[0049]
CN 109239251 A[0058]
说 明 书
4/11页
连翘苷对照品、大黄酚对照品、大黄酸对照品适量，加入甲醇制成对照品溶液。其
中连翘苷对照品浓度为0.3125mg/ml、大黄酚对照品浓度为0.4981mg/ml、大黄酸对照品浓度为0.5306mg/ml。[0059]5.方法学验证[0060]5.1提取时间考察[0061]平行称取本品3份，各4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，分别超声10min、20min、30min、1h、2h，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
[0062]通过比较实验结果发现超声1h效果较好。因此，选择超声1h作为提取时间。[0063]5.2精密度试验
[0064]取同一份供试品溶液，连续重复进样6针，考察精密度。结果表明，共有峰相对保留时间RSD均小于0.29％，相对峰面积RSD均不大于3.48％，重复进样6针间的相似度均为1.000，精密度良好。表1、表2为精密度考察结果。[0065]表1精密度试验结果(相对保留时间)
[0066]
[0067]
表2精密度试验结果(相对峰面积)
7
CN 109239251 A[0068]
说 明 书
5/11页
5.3重复性
[0070]称取同一批供试品6份，按照供试品溶液制备方法，平行操作，考察重复性。结果表明，共有峰相对保留时间RSD均小于0.26％，相对峰面积RSD均不大于3.38％，6份样品间的相似度均为0.999，重复性良好。表3、表4为重复性考察结果。[0071]表3重复性试验结果(相对保留时间)
[0072]
[0069]
8
CN 109239251 A[0073]
说 明 书
6/11页
[0074][0075]
表4重复性试验结果(相对峰面积)
[0076]
5.4稳定性考察
9
CN 109239251 A[0077]
说 明 书
7/11页
取同一供试品溶液，分别于0h,2h,4h,6h,8h,16h，24h注入液相色谱仪。结果表明，
共有峰相对保留时间RSD均小于0.28％，相对峰面积RSD均小于3.38％，相似度为0.999供试品溶液在24h内稳定。表5、表6为重复性考察结果。[0078]表5稳定性试验结果(相对保留时间)
[0079]
[0080][0081]
表6稳定性试验结果(相对峰面积)
10
CN 109239251 A[0082]
说 明 书
8/11页
5.5样品测定
[0084]将10批黄氏响声丸按供试品提取方法提取，并按该指纹图谱测定方法进行测定，记录各色谱图。[0085]6.数据分析
[0086]按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，获得每10个批次相似度值。样品相似度在0.75～0.99。[0087]与现有技术相比，本发明的改进点在于：[0088]1、指纹图谱分析方法针对黄氏响声丸多药材、多组分的特点，从整体上进行分析，保证了该药的安全、有效、可控。[0089]2、使用高效液相-蒸发光散射检测器进行检测，是对《中国药典》2015年版黄氏响声丸质量分析方法的补充，同时也是针对该品种现有分析方法的补充。[0090]与现有技术相比，本发明具有以下优点：[0091]1、本发明采用HPLC-ELSD法，建立的黄氏响声丸指纹图谱中共有峰总结15个，能有效的表征黄氏响声丸各成分的质量。[0092]2、指纹图谱注重各个构成指纹特征峰的相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因测定个别化学成分而造成的整体质量片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明方法所得黄氏响声丸指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠。[0093]3、本方法具有精密度、稳定性、重复性好的优点，且简便、快捷、准确、稳定、可靠，可用于黄氏响声丸质量控制。[0094]4、该方法可快速、准确地鉴别产品的真伪优劣。[0095]下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
11
[0083]
CN 109239251 A
说 明 书
9/11页
附图说明
[0096]图1黄氏响声丸标准指纹图谱[0097]图2黄氏响声丸对照品图谱[0098]图3黄氏响声丸提取比较图谱[0099]图4黄氏响声丸10批指纹图谱
具体实施方式
[0100]以下结合实施例对本发明作进一步地说明，以便对本发明作更详细的了解。[0101]实施例1
[0102]步骤(1)供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
[0103]步骤(2)对照品溶液制备浓度分别为：其中连翘苷对照品浓度为0.3125mg/ml、大黄酚对照品浓度为0.4981mg/ml、大黄酸对照品浓度为0.5306mg/ml。[0104]步骤(3)将供试品溶液，对照品溶液注入色谱仪，得到色谱图。[0105]液相色谱仪的色谱条件如下：
[0106]碳十八烷基为固定性的液相色谱柱；[0107]流动相：甲醇(A)-0.5％醋酸溶液(B)
[0108]
[0109]
流速0.8ml/min，柱温30℃，进样量20ul[0111]ELSD条件：温度：80℃，气体流速：1.2L/min[0112]按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较标准指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度，相似度在0.75～0.99为合格，低于0.75为不合格。
[0113]实施例2
[0114]对黄氏响声丸170801批次进行指纹图谱测定，具体步骤如下：[0115]步骤(1)供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
[0116]步骤(2)对照品溶液制备浓度分别为：其中连翘苷对照品浓度为0.3125mg/ml、大黄酚对照品浓度为0.4981mg/ml、大黄酸对照品浓度为0.5306mg/ml。
[0110]
12
CN 109239251 A[0117][0118][0119][0120][0121]
说 明 书
10/11页
步骤(3)将供试品溶液，对照品溶液注入色谱仪，得到色谱图。液相色谱仪的色谱条件如下：
碳十八烷基为固定性的液相色谱柱；流动相：甲醇(A)-0.5％醋酸溶液(B)
[0122]
流速0.8ml/min，柱温30℃，进样量20ul
[0123]ELSD条件：温度：80℃，气体流速：1.2L/min[0124]按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较标准指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度。[0125]试验结果：170801批次黄氏响声丸与标准图谱比较，相似度为0.86，符合不低于0.75的要求。[0126]实施例3
[0127]对黄氏响声丸171003批次进行指纹图谱测定，具体步骤如下：[0128]步骤(1)供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
[0129]步骤(2)对照品溶液制备浓度分别为：其中连翘苷对照品浓度为0.3125mg/ml、大黄酚对照品浓度为0.4981mg/ml、大黄酸对照品浓度为0.5306mg/ml。[0130]步骤(3)将供试品溶液，对照品溶液注入色谱仪，得到色谱图。[0131]液相色谱仪的色谱条件如下：
[0132]碳十八烷基为固定性的液相色谱柱；[0133]流动相：甲醇(A)-0.5％醋酸溶液(B)
[0134]
[0135]
流速0.8ml/min，柱温30℃，进样量20ul[0136]ELSD条件：温度：80℃，气体流速：1.2L/min[0137]按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较标准指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度。[0138]试验结果：171003批次黄氏响声丸与标准图谱比较，相似度为0.81，符合不低于0.75的要求。
13
CN 109239251 A[0139]
说 明 书
11/11页
实施例4
[0140]对黄氏响声丸171007批次进行指纹图谱测定，具体步骤如下：[0141]步骤(1)供试品溶液的制备：取黄氏响声丸，粉碎，取约4g，精密称定，置锥形瓶中，加入85％甲醇50ml，超声1小时，放冷，过滤，蒸干，用25ml水溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取3次，每次25ml，合并乙酸乙酯萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。
[0142]步骤(2)对照品溶液制备浓度分别为：其中连翘苷对照品浓度为0.3125mg/ml、大黄酚对照品浓度为0.4981mg/ml、大黄酸对照品浓度为0.5306mg/ml。[0143]步骤(3)将供试品溶液，对照品溶液注入色谱仪，得到色谱图。[0144]液相色谱仪的色谱条件如下：
[0145]碳十八烷基为固定性的液相色谱柱；[0146]流动相：甲醇(A)-0.5％醋酸溶液(B)
[0147]
流速0.8ml/min，柱温30℃，进样量20ul[0149]ELSD条件：温度：80℃，气体流速：1.2L/min[0150]按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较标准指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度。[0151]试验结果：171007批次黄氏响声丸与标准图谱比较，相似度为0.88，符合不低于0.75的要求。
[0152]使用HPLC-ELSD方法的优点:[0153](1)使用蒸发光散射检测器能够检测出没有紫外吸收的物质，能够最大程度把黄氏响声丸的物质很好的分离体现出来。[0154](2)药典上黄氏响声丸的含量测定方法是用HPLC-ELSD来测定贝母素甲、贝母素乙。该指纹图谱也运用ELSD检测器，在一定程度上补充的药典上检测方法的不足。同时多成分的检测能更好的保证产品的质量。
[0148]
14
CN 109239251 A
说 明 书 附 图
1/2页
图1
图2
15
CN 109239251 A
说 明 书 附 图
2/2页
图3
图4
16
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容