一种虾青素脂质体的制备方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112791001 A(43)申请公布日 2021.05.14

(21)申请号 202011505988.9(22)申请日 2020.12.18

(71)申请人 南京理工大学

地址 210014 江苏省南京市孝陵卫200号 申请人 点斗基因科技（南京）有限公司(72)发明人 樊燕蓉　冯娇燕　周奔　丁亦钦　

赵广义　徐根兴　(74)专利代理机构 南京智造力知识产权代理有

限公司 32382

代理人 陈佳佳(51)Int.Cl.

A61K 8/35(2006.01)A61K 8/14(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)A61Q 19/00(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图8页

(54)发明名称

一种虾青素脂质体的制备方法(57)摘要

本发明提供了一种虾青素脂质体的制备方法，利用脂质体成分与细胞膜相似的特性，将虾青素包裹于阴离子脂质体内，通过胞吞或膜融合将虾青素转入细胞内，制备得到的虾青素脂质体具有较好透皮效应。本发明所述虾青素脂质体的制备方法简单，制备原料容易获取，制得的虾青素脂质体始终带负电荷，安全、稳定，并且具有较好的抗氧化效应以及透皮效应，能够作为化妆品添加剂开发出具有作用性强、稳定性好、无毒无害不刺激的含虾青素活性物的化妆品，在具有抗氧化功能的化妆品领域具有很好的应用前景。

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权　利　要　求　书

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1.一种虾青素脂质体的制备方法，其特征是：包括如下步骤：将膜材以及虾青素溶于氯仿中,经减压蒸发去除氯仿，在圆底烧瓶中形成脂膜，加入ASX‑HPCD水溶液进行水化和冰浴超声后，得到脂质体混悬液，然后用滤膜过滤，得到虾青素脂质体；

所述脂质体磷脂双分子层中虾青素浓度为40μg/mL，水化液中虾青素浓度为30‑70μg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种虾青素脂质体的制备方法，其特征是：所述的膜材在脂质体混悬液的质量体积比为3.0mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种虾青素脂质体的制备方法，其特征是：所述的膜材由卵磷脂、胆固醇组成，其中卵磷脂：胆固醇的质量比为5:1。

4.根据权利要求1所述的一种虾青素脂质体的制备方法，其特征是：所述的氯仿中膜材浓度为9.0mg/mL。

5.根据权利要求1所述的一种虾青素脂质体的制备方法，其特征是：所述的水化和冰浴

300W冰浴超声2‑4min。超声的条件为：在50℃下水浴水化，

6.根据权利要求1所述的一种虾青素脂质体的制备方法，其特征是：所述的虾青素脂质体粒径135‑155nm、电位‑21～‑45mV，包封率60‑85％。

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一种虾青素脂质体的制备方法

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技术领域

[0001]本发明涉及生物化学或者化妆品技术领域，尤其是一种虾青素脂质体的制 备方法。

背景技术

[0002]脂质体(liposome)是一种微小的球面状囊泡，磷脂依靠自身的疏水缔合 作用和其他两性化合物如胆固醇等分散在水相时形成的一种分子有序结构，由 内水相和包裹内水相的一层或多层磷脂双分子层组成。最初是由Banghan和 Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察室发现的。脂质体具有生物膜的特性， 因此又称人工生物膜。一般来说，水溶性药物被包裹在脂质体的内水相中，脂 溶性药物则在磷脂双分子层中。[0003]虾青素(Astaxanthin，ASX)是暗紫棕色晶体，熔点为224℃。虾青素具 脂溶性,不溶于水,易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳等，微溶于大多数有机 溶剂。虾青素是一种非维生素A源的酮式类胡萝卜素，可不经修饰和转化直接 储存在组织中，使皮肤和肌肉呈现出健康艳丽的颜色。虾青素是一种萜烯类不 饱和化合物，化学名称为3,3‑二羟基‑4,4‑二酮基‑β,β‑胡萝卜素，分子式为 C40H52O4，相对分子质量为596.86。存在形态主要为游离态和酯化态，其分子结 构中特殊的长链共轭烯烃结构赋予其有效淬灭活性氧的功能，它是迄今为止自 然界中最强的天然抗氧化剂。但游离虾青素不稳定，容易被氧化，且虾青素为 脂溶性物质，水溶性差，直接使用透皮效果不好，生物利用度低，因此制备虾 青素脂质体解决这些应用难题。[0004]β‑环糊精(β‑cyclodextrin，β‑CD)是一种由七个葡萄糖残基通过α‑1， 4‑糖苷键连接的环式低聚糖。借助其疏水空腔可将亲油性客体分子动态包接， 形成复合物超分子体系。从而实现提高客体分子的水溶性、稳定性和抗氧化、 光分解能力，或达到缓释和立体分离效果等目的。但β‑环糊精存在水溶性差等 问题，而羟丙基‑β‑环糊精(hydroxypropyl‑β‑cyclodextrin，HPCD)是β‑环 糊精的醚化衍生物，羟丙基的引入部分打开了β‑环糊精的分子内氢键，水溶性 大大提高，并且经实验证实具有更高的安全性，被认为是很有潜力的母体环糊 精替代品。因此可采用沉淀法制备ASX‑HPCD复合物，提高虾青素水溶性以及稳 定性，以包合物水溶液作为水化液制备虾青素脂质体，使其包裹在脂质体内水 相中，更好地提高虾青素稳定性。

发明内容

[0005]本发明要解决的技术问题是：为了解决上述背景技术中存在的问题，提供 一种改进的虾青素脂质体的制备方法，从而克服虾青素应用的现有技术中存在 的水溶性问题以及稳定性差、生物利用度低的缺点。

[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种虾青素脂质体的制备方 法，包括如下步骤：将膜材以及虾青素溶于氯仿中,经减压蒸发去除氯仿，在圆 底烧瓶中形成脂膜，加入ASX‑HPCD水溶液进行水化和冰浴超声后，得到脂质 体混悬液，然后用滤膜过滤，得

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到虾青素脂质体；

[0007]所述脂质体膜材中虾青素浓度为40μg/mL，水化液中虾青素浓度为 30‑70μg/mL。[0008]所述的膜材在脂质体混悬液的质量体积比为3.0mg/mL。[0009]所述的膜材由卵磷脂、胆固醇组成，其中卵磷脂：胆固醇质量比为5:1。[0010]所述的氯仿中膜材浓度为9.0mg/mL。[0011]所述的水化和冰浴超声的条件为：在50℃下水浴水化，300W冰浴超声 2‑4min。[0012]所述的虾青素脂质体粒径135‑155nm、电位‑21～‑45mV，包封率60‑85％。[0013]本发明还提供了虾青素脂质体在日化产品中的应用，使其具有抗氧化功能； 优选的，将所述虾青素脂质体作为原料添加入延缓衰老的护肤品或化妆品中。[0014]本发明的有益效果是：[0015](1)本发明的一种虾青素脂质体的制备方法中虾青素脂质体的膜材主要成 分与生物膜相似，具有在体内无毒、无免疫原性、安全可靠的优点，该脂质体 可以提高虾青素的稳定性，解决水溶性问题，改进虾青素在皮肤的透皮效应,发 挥其抗氧化、延缓衰老的功效，能够作为化妆品添加剂开发出具有作用性强、 稳定性好、无毒无害不刺激的含虾青素活性物的化妆品，在化妆品领域具有很 好的应用前景；[0016](2)本发明中使用的虾青素可以淬灭单线态氧、清除自由基、抑制脂质的 过氧化，从而使机体免受伤害，甚至可以预防癌症，除此之外，虾青素还能促 进人体产生免疫球蛋白，使得人体具有更高的免疫调节活性。因此可以将虾青 素添加到化妆品中，通过虾青素降低脂质过氧化、清除自由基等功能，研制出 可以延缓衰老的功能性化妆品；[0017](2)本发明中使用的虾青素需要转入细胞内才能发挥其抗氧化功效，利用 脂质体成分与细胞膜相似的特性，将虾青素包裹于阴离子脂质体内，通过胞吞 或膜融合将虾青素转入细胞内，能有效解决虾青素水溶性差以及透皮滞留时间 短的难题，具有良好的缓释效应，大大提高了虾青素的作用时间，使其更加有 效地转入细胞内，同时提高了虾青素的稳定性、减小刺激性，进而提高了虾青 素的活性和应用广泛性。附图说明

[0018]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

[0019]图1是本发明中实施例1中虾青素脂质体(编号1)的粒径分布图。[0020]图2是本发明中实施例1中虾青素脂质体(编号1)的DPPH自由基清除结 果。[0021]图3是本发明中实施例1中虾青素脂质体(编号1)的羟基自由基清除结果。[0022]图4是本发明中实施例1中虾青素脂质体(编号1)的超氧阴离子清除结果。[0023]图5是本发明中实施例2中虾青素脂质体(编号2)的粒径分布图。[0024]图6是本发明中实施例2中虾青素脂质体(编号2‑6)的DPPH自由基清除 结果。[0025]图7是本发明中实施例2中虾青素脂质体(编号2‑6)的羟基自由基清除结 果。[0026]图8是本发明中实施例2中虾青素脂质体(编号2‑6)的超氧阴离子清除结 果。[0027]图9是本发明中实施例3中虾青素脂质体(编号7)的粒径分布图。

[0028]图10是本发明中实施例3中虾青素脂质体(编号7‑8)的DPPH自由基清除 结果。[0029]图11是本发明中实施例3中虾青素脂质体(编号7‑8)的羟基自由基清除 结果。[0030]图12是本发明中实施例3中虾青素脂质体(编号7‑8)的超氧阴离子清除 结果。

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图13是本发明中实施例1中1号脂质体以及虾青素溶液的透皮实验结果。图14是本发明中实施例2、3中2号和7号脂质体的透皮实验结果。

具体实施方式

[0033]现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图， 仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。[0034]实施例1:ASX脂质体实验方案[0035]1.ASX脂质体的制备[0036]通过薄膜分散法，将大豆卵磷脂和胆固醇按照5:1的质量比溶于适量的氯 仿中，加入0.4mg虾青素，30℃经减压蒸发去除氯仿，在圆底烧瓶中形成脂膜， 50℃水化时加入10mL pH7.4的PBS溶液。300W(2s，2s)，2min冰浴超声后， 用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜依次过滤，得到虾青素脂质体(编号1)。 充入氮气，4℃避光保存。[0037]2.虾青素脂质体包封率测定：[0038](1)虾青素‑氯仿标准曲线的测定：

[0039]采用可见光分光光度计在波长为492nm下测定步骤(1)制备虾青素脂质体 中的虾青素含量。先配制8μg/mL虾青素氯仿溶液，并以氯仿进行梯度稀释， 在492nm下测定吸光值，得到虾青素浓度与吸光度值之间的比例关系，绘制标 准曲线。标准曲线的回归方程为y＝0.2164x‑0.0035，其中x为虾青素溶液 的浓度μg/mL，y为虾青素溶液在492nm处的吸光度值，回归系数0.9999。[0040](2)虾青素脂质体包封率测定采用石油醚萃取法：[0041]取0.5mL制备好的虾青素脂质体，加入5mL石油醚，在30℃下充分震荡搅 拌5min，静置30min，将上层液体转移至旋蒸瓶中，再加入5mL石油醚进行萃 取，重复两次。将上层液体在50℃下真空旋蒸，除去石油醚，使游离虾青素析 出。加入适量氯仿重新溶解，在虾青素最大吸收峰处测其吸光值。进行三次平 行实验，取平均值。[0042]包封率计算公式：

[0043][0044][0045]

表1.虾青素脂质体结果

编号 粒径(nm) PDI 电位(mV) 包封率％ 1 135.7 0.253 ‑21.6 84.9±0.9

[0046]按照该条件进行虾青素脂质体制备并测量其包封率，得出包封率为84.9± 0.9％。对1号脂质体进行粒径电位测量，采用ZS90(英国Malvern)电位仪测量， 得出粒径为135.7nm(见图1)，电位为‑21.6mV，PDI值为0.253，说明该脂质 体粒径较为合适，电位较高，体系比较稳定，PDI值较小，颗粒较均一，呈正态 分布。[0047]3.抗氧化能力测定[0048](1)DPPH自由基清除能力测定[0049]利用DPPH‑无水乙醇溶液在517nm处有紫色团的特征吸收峰，以分光光度法 测定加入抗氧化剂后，在517nm处吸光值的下降表示其对DPPH自由基的清除能 力。[0050]以对应浓度ASX‑乙醇溶液和10μg/mL VC水溶液作对照，结果见图2。

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(2)羟基自由基清除能力的测定

[0052]采用水杨酸‑FeSO法测定用Fe2+和过氧化氢混合后反应产生高活性的羟基 自由4基，加入水杨酸后能捕捉羟基自由基产生有色产物且在510mm处有强吸收。 当加入受试物后会与水杨酸竞争结合羟基自由基从而减少有色物的生成并降低 吸光度。[0053]以对应浓度ASX‑乙醇和10μg/mL VC水溶液作对照，结果见图3。[0054](3)超氧阴离子清除能力的测定

[0055]采用邻苯三酚自氧化法测定受试样品对超氧阴离子自由基的清除率。邻苯 三酚在碱性条件下迅速自氧化，自氧化过程中产生的超氧阴离子自由基可加速 邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物且在325nm处有强吸收。加入受 试样品后会清除超氧阴离子，可抑制自氧化反应并阻止中间产物的产生，使溶 液在325nm处吸光值减小。以10μg/mL VC水溶液做对照，结果见图4。

[0056]与游离ASX和游离VC相比，ASX脂质体对自由基的清除效果更好，说明包 封未影响ASX对自由基的清除能力。[0057]实施例2：ASX‑HPCD脂质体制备方案[0058]1.ASX‑HPCD脂质体制备[0059](1)ASX‑HPCD脂质体的制备[0060]利用沉淀法制备ASX‑HPCD包合物,包合率为46.07％。通过薄膜分散法，将 大豆卵磷脂和胆固醇按照质量比5:1溶于适量的氯仿中，30℃经减压蒸发去除 氯仿，在圆底烧瓶

用孔中形成脂膜，50℃水化时加入10mL ASX‑HPCD水溶液。300W (2s，2s)，4min冰浴超声后，

径为0.45μm和0.22μm的滤膜依次过滤， 得到表4中编号2‑6的ASX‑HPCD脂质体(2号脂质体粒径图见图5)，并进行包 封率测定。

[0061]表4.ASX‑HPCD脂质体配方表及结果

[0062]

不同浓度ASX‑HPCD脂质体，其粒径、电位、包封率等因素有所差别。其中 粒径5号

最大、2号最小。PDI均较低，粒径比较均匀。电位4号最高、5号最 低，电位值数均大于35，说明体系比较稳定。包封率4号最高，6号最低，但 都保持在60％以上。[0064]2.ASX‑HPCD脂质体抗氧化性测定

[0065]DPPH自由基清除能力测定结果见图6；羟基自由基清除能力测定结果见图7； 超氧阴离子清除能力测定结果见图8。

[0066]对不同浓度ASX‑HPCD脂质体对三种自由基的清除情况进行分析，2号脂质 体DPPH

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自由基清除能力最高，其羟基自由基清除能力与超氧阴离子清除能力虽 不是最佳，但其他脂质体与其相比清除率涨幅不大。结合粒径、电位、包封率 结果综合考虑，编号2‑6脂质体中，2号脂质体最符合实用要求。[0067]实施例3：ASX双包裹脂质体的制备方案[0068]1.ASX双包裹脂质体的制备[0069]通过薄膜分散法，将大豆卵磷脂和胆固醇按照质量比5:1溶于适量的氯仿 中，加入0.4mg虾青素，30℃经减压蒸发去除氯仿，在圆底烧瓶中形成脂膜，50℃水化时加入10mL ASX‑HPCD水溶液。300W(2s，2s)，2min冰浴超声后，用 孔径为0.45μ和0.22μm的滤膜依次过滤，得到表5中编号7‑8的虾青素脂质 体(7号脂质体粒径图见图9)，并进行包封率测定。[0070]表5.ASX双包裹脂质体配方表及结果

[0071]

2.包合物脂质体抗氧化性测定

[0073]DPPH自由基清除能力测定结果见图10；羟基自由基清除能力测定结果见图 11；超氧阴离子清除能力测定结果见图12。[0074]综合粒径、电位、包封率、抗氧化能力等指标进行分析，与8号脂质体相 比，7号脂质体粒径较低，电位较高，稳定性更好，且包封率以及抗氧化能力相 差不大，7号脂质体经济效益更佳。

[0075]实施例4：虾青素脂质体透皮效果研究[0076](1)小鼠皮肤处理：

[0077]以spf级ICR小鼠(购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场)离体皮肤为皮肤 模型。将6只健康的spf级雄性ICR小鼠颈椎脱臼处死，用脱毛剂将小鼠腹部 皮肤进行脱毛处理，

剥下小鼠腹 部皮肤，用镊子刮净离体皮肤内再用生理盐水洗净残留在小鼠腹部的脱毛剂，

侧的组织，用10mM，pH7.4的PBS浸泡离体皮 肤备用。[0078](2)体外透皮实验：[0079]用TP‑6透皮扩散仪进行体外透皮实验，考察并比较了实施例1、2、3中制 备的编号1、2、7的虾青素脂质体和虾青素溶液的透皮效果。Franz扩散池由上 下两个杯状磨口玻璃

释药面积为1.13cm2， 接收池体积为15mL。实验时将小容器组件供给室和接收池对合而成，

鼠皮肤夹在供给室与接收池之间，腹部外侧皮 肤朝向供给室，内侧朝向接收池，接收池中加入15mL 8％DMSO‑PBS溶液作为接 收液，加入磁性转子，排除皮下气泡，用不锈钢夹固定。供给室加入1mL虾青 素脂质体，在(37±1)℃条件下，磁力搅拌器350rpm搅拌，每间隔三小时从接 收池的取样口取样0.5mL，然后用0.5mL接收液补足体积(注意皮下不能有气 泡)，24或48小时后终止实验。对照组用等体积虾青素溶液代替实验组中脂质 体，其余操作均相同。

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透皮率计算公式如下，实验结果如图13、14。

从图13中可以看出，1号脂质体以及虾青素溶液透皮率均在24h内达到最 高点，随

后逐渐降低。1号脂质体在18h处达到最高点，透皮率最高为29.32％， 而虾青素溶液的透皮率最高点为15h，此时透皮率为25.74％。这说明与虾青素 溶液相比，1号脂质体有一定的缓释作用，且能够提高虾青素的透皮率，促进虾 青素的透皮吸收。[0083]从图14可以看出，2号和7号脂质体透皮率最高点为24h左右，随后逐渐 降低，因此测量48h透皮率曲线。结合图13、14可以看出，2号脂质体和7号 脂质体均在24h时透皮率达到最高点，且与1号脂质体以及虾青素溶液相比，2 号和7号脂质体均具有更好的缓释作用，

透皮能帮助虾青素在皮肤中缓慢发挥作用。 同时，24h时7号脂质体透皮率大于2号脂质体，

率达32.98％，说明7号 脂质体的促进虾青素透皮吸收的效果更佳。综合来看，7号脂质体能促进更多的 虾青素透过皮肤，且在皮肤中维持作用时间更长，因此将其应用到化妆品中更 易持续稳定的发挥作用。

[0084]以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作 人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。 本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围 来确定其技术性范围。

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