ＭＥＡＴＩＮＤＵＳＴＲＹ
２０１９年第１１期总第４６３期
高效液相色谱法检测动物性产品中３种
氟喹诺酮类药物残留的研究
１.双汇集团 河南漯河 ４６２３００方永卫１ 师永华２ 郭向阳１
２.漯河市动物卫生监督所 河南漯河 ４６２３００
摘 要 麻保沙星、环丙沙星和恩诺沙星被大量用于预防和治疗动物性疾病ꎬ但由于氟喹诺酮类药物的耐药性问题和潜伏致癌性ꎬ故亟需建立氟喹诺酮类药物的多残留检测方法ꎮ采用高效液相色谱法对动物性产品中麻保沙星、环丙沙星和恩诺沙星残留进行检测ꎬ建立三种目标物的高效液相检测方法ꎬ并对奶样和肉品进行添加回收试验ꎮ
关键词 高效液相色谱法 氟喹诺酮类药物 奶样 肉品
Ｓｔｕｄｙｏｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ
ｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎａｎｉｍａｌｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙＨＰＬＣ
ＦＡＮＧＹｏｎｇｗｅｉꎬＳＨＩＹｏｎｇｈｕａꎬＧＵＯＸｉａｎｇｙａｎｇ
ａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｎｉｍａｌｄｉｓｅａｓｅｓꎬｂｕｔｄｕｅｔｏｔｈｅｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｌａｔｅｎｔｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓꎬａｍｕｌｔｉｒｅｓｉｄｕｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓｓｈｏｕｌｄｂｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｑｕｉｃｋｌｙ.Ｔｈｅｒｅｓｉｄｕｅｓｏｆｍａｂｏｆｌｏｘａｃｉｎꎬｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎａｎｄｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎｉｎａｎｉｍａｌｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ(ＨＰＬＣ).ＴｈｅＨＰＬＣｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｔａｒｇｅｔｓｕｂｓｔａｎｃｅｓｗｅｒｅｅｓｔａｂ￣ｌｉｓｈｅｄꎬａｎｄｔｈｅｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓａｎｄｍｅａｔｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅａｄｄｅｄａｎｄｒｅｃｏｖｅｒｅｄ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ＨＰＬＣꎻｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓꎻｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓꎻｍｅａｔｐｒｏｄｕｃｔｓ 环丙沙星、恩诺沙星和麻保沙星均属于氟喹诺酮类抗菌药物ꎬ因其具有抗菌谱广[１]、吸收率高、组到动物性疾病的防治中ꎮ目前国内兽用喹诺酮类药物药物的使用量已经接近５００ｔ/年[２]ꎮ
但是集约化养殖ꎬ养殖环境比较差ꎬ动物容易织穿透力强和价格低廉的优点ꎬ很快就被普遍应用
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅｍａｒｂｏｆｌｏｘａｃｉｎꎬｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎａｎｄｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎｗｅｒｅｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ
品中氟喹诺酮类药物残留的各种检测方法ꎬ以利于相关执法人员对动物性产品抗菌药残留的检查更加方便、快速和准确ꎬ以确保人们能够食用健康安全的动物性产品ꎮ本实验尝试建立高效液相色谱法ꎬ测定动物性产品中３种氟喹诺酮类药物含量水平的方法ꎮ主要包括:(１)通过紫外线扫描ꎬ确定这三种氟喹诺酮类药物物质的吸收波长范围ꎬ然后选择适宜的吸收波长进行检测ꎻ(２)流动相和检测条件优化ꎬ包括对流动相的组成成分及比例ꎬ还有检测采用固相还是梯度洗脱及洗脱条件ꎬ进样量和流速等条件进行一一优化ꎻ(３)配制一系列不同浓度标准品工作液ꎬ按照优化好的色谱条件进行上样检测ꎬ整理实验结果ꎬ建立三种目标物的标准曲线ꎬ
感染疾病ꎬ还有为寻求快速的商业回报利益ꎬ很多养殖户滥用氟喹诺酮类药物或者违禁添加抗菌药ꎬ这导致了动物性产品中氟喹诺酮类药物含量的超标ꎮ我国和世界卫生组织、欧盟、日本等国家和组织ꎬ也都已经将喹诺酮类药物列入了限制使用的兽药名单中[３]ꎮ所以ꎬ我们不仅要在源头预防ꎬ加强对养殖户的监管ꎻ同时ꎬ还要致力于研究动物性食
４４
２０１９年第１１期总第４６３期
ＭＥＡＴＩＮＤＵＳＴＲＹ
肉品安全与检测
并确定其对应检测限ꎻ(４)采用最优提取方案ꎬ进行奶样和肉样的添加回收试验ꎬ并测定这三种氟喹诺酮类的添加回收率ꎮ
氮吹仪ꎬ青岛国胜焊割设备有限公司ꎮ１.２ 试验方法
１.２.１ 目标物最大吸收波长的确定
对环丙沙星溶液、恩诺沙星溶液和麻保沙星浓
１ 材料与方法
１.１ 试剂与仪器１.１.１ 试剂
度均为２５μｇ/ｍＬ的单标溶液进行扫描ꎬ麻保沙星吸收波长在２９８~２９９ｎｍꎬ恩诺沙星吸收波长２７８~１８０ｎｍꎬ环丙沙星吸收峰也在２７８ｎｍ左右ꎮ综合实验检测结果和干扰因素考虑ꎬ选择麻保沙星吸收波长为２９９ｎｍꎬ设置环丙沙星和恩诺沙星的吸收波长为２７８ｎｍꎮ
１.２.２ 流动相和检测条件的优化
配制三种目标物的混合目标物溶液:准确称量
麻保沙星药品ꎬ杭州创世纪医药科技有限公司ꎻ环丙沙星药品ꎬ杭州创世纪医药科技有限公司ꎻ恩诺沙星药品ꎬ杭州创世纪医药科技有限公司ꎻ氢氧化钠ꎬ天津市德恩化学试剂有限公司ꎻ无水硫酸钠ꎬ天津市德恩化学试剂有限公司ꎻ乙酸ꎬ江苏强盛功能化学股份有限公司ꎻ三乙胺ꎬ天津市德恩化学试剂有限公司ꎻ磷酸ꎬ开封开化(集团)有限公司ꎻ正己烷ꎬ天津市德恩化学试剂有限公司ꎻ异丙醇ꎬ天津市德恩化学试剂有限公司ꎻ无水乙醇ꎬ天津市德恩化学试剂有限公司ꎻ甲醇(色谱纯)ꎬ西陇化工股份有限公司ꎻ乙睛(色谱纯)ꎬ西陇化工股份有限公司ꎻ纯净水ꎬ杭州娃哈哈集团有限公司ꎻ注:以上无特殊标注的试剂均为分析纯ꎮ
三种标准品各３.５ｍｇꎬ放于同一玻璃瓶中ꎬ加入０３ｍＬ的０.５ｍｏＬ/ｍＬ的氢氧化钠助溶ꎬ再加入３２ｍＬ的色谱甲醇ꎬ配成１ｍｇ/ｍＬ的混合标准品溶液ꎬ混匀ꎮ再取其中混匀后溶液０.５ｍＬꎬ加入４.５ｍＬ的乙睛进行稀释成１００μｇ/ｍＬ混合标准品溶液ꎮ配制各种可能性较大的流动相ꎬ上样检测ꎬ再根据试验现象进一步调整改进流动相组成ꎬ确定流动相和最佳检测条件ꎬ流动相Ａ液为０.０５ｍｏＬ/Ｌ磷酸０５％三乙胺溶液ꎬＢ液为乙睛(色谱纯)ꎬ进行洗脱ꎮ开始流动相比例ꎬＡ液为９０％ꎬＢ液为１０％ꎻ随后在１８ｍｉｎ内流动相比例变为ꎬＡ液为６７％ꎬＢ液为３３％ꎮ柱温为３０℃ꎬ进样量为２０μＬꎬ流速为０８ｍＬ/ｍｉｎꎮ
１.２.３ 三种目标物标准曲线的绘制
１.１.２ 主要仪器
移液枪ꎬ郑州博科仪器有限公司ꎻ冰箱ꎬ河南新飞电器有限公司ꎻ
超声波清洗器ꎬ金坛市吉特实验仪器厂ꎻＦＡ２００４Ｎ电子分析天平ꎬ河北省虹宇设备有限超净工作台ꎬ苏州净化设备有限公司ꎻ
高效液相色谱仪ꎬ杭州尔首科学仪器有限公司ꎻ紫外检测器ꎬ惠州市华高仪器设备有限公司ꎻ电子分析天平ꎬ赛多利斯科学仪器(北京)有限
对浓度分别为２.５、５、８.３、２５、１００μｇ/ｍＬ的三种
目标物混合的检测溶液ꎬ上样检测ꎮ以混合目标物的浓度为横坐标ꎬ色谱峰积分面积为纵坐标ꎬ制作麻保沙星、恩诺沙星和环丙沙星三种目标物的标准曲线ꎮ麻保沙星的标准曲线回归方程为Ｙ＝１７８.１３Ｘ－５２６.４７ꎬ相关系数达到０.９９７ꎻ环丙沙星的标准曲线其回归方程为Ｙ＝１７７２１Ｘ－５５４.１１ꎬ相关系数达０.９９７９ꎻ恩诺沙星的标准曲线ꎬ其线性回归方程为Ｙ＝２０２.６６Ｘ－５６４１１ꎬ线性回归相关系数达０.９９８ꎮ
１.２.４ 检测限的测定
公司ꎻ
公司ꎻ
低速离心机ꎬ金坛市恒丰仪器制造有限公司ꎻ高速离心机ꎬ浙江三联环保科技股份有限公司ꎻ旋转蒸发器ꎬ上海申生科技有限公司ꎻ
微型旋涡混合仪ꎬ上海沪西分析仪器厂有限公司ꎻ
对浓度分别为０.２５、０.５、１０μｇ/ｍＬ的混合标准
液上样检测ꎬ混合检测液中麻保沙星、环丙沙星和恩
４５
肉品安全与检测
诺沙星的检测限均为０.５μｇ/ｍＬꎮ１.２.５ 奶样的前处理方法
ＭＥＡＴＩＮＤＵＳＴＲＹ
２０１９年第１１期总第４６３期
在牛奶中添加混和标准品的溶液ꎬ检测结果如图１、图２ꎬ回收率测定结果如表１ꎮ
用移液枪量１.０ｍＬ的奶样于１０ｍＬ的离心管
中ꎬ加入３.０ｍＬ酸化乙腈溶液于超声５ｍｉｎꎬ３５００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ吸取上清液置另一管中ꎮ按照以上步骤再进行处理１~２次ꎬ并与上一次清液放于同一管中ꎮ在上清液中加入３.０ｍＬ的正己烷ꎬ混合１ｍｉｎꎬ３５００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ除去正己烷层ꎮ将下层即乙腈层转移入５０ｍＬ圆底旋蒸瓶中ꎬ加进２.０ｍＬ的异丙醇ꎬ混匀ꎬ于４５℃条件下减压旋蒸至近干ꎮ用流动相把残渣经多次移入到离心管中ꎬ定容至１ｍＬ左右ꎮ再加入２.０ｍＬ正己烷ꎬ涡旋混合１ｍｉｎꎬ３５００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ除去上层ꎬ底层用０.２２ｕｍ的滤膜过滤ꎬ于４℃下存放ꎮ１.２.６ 肉样的前处理方法
添加目标物
图１ ５０.０μｇ/ｍＬ奶样检测结果
图２ １０.０μｇ/ｍＬ奶样检测结果表１ 牛奶中三种目标物的添加回收结果
目标物添加水平/ｕｇｍＬ
５.０
麻保沙星
１０.０２５.０５０.０５.０
环丙沙星
１０.０２５.０５０.０５.０
恩诺沙星
１０.０２５.０５０.０
－１
色谱峰积分面积９８３.０９６１６３０.６９６４０７０.４１７８６７５.８２９７９.５４５１５５７.２６３３９１９.８３９８２８０.６３７７１１５８.１８２１９１４.６７５４８４２.０４１１０１２５.１
回收体积/ｍＬ０.６０.８０.９１.００.６０.８０.９１.００.６０.８０.９１.０
回收浓度/ｕｇｍＬ－１
５.０８９.６８２３.２２５１.６６５.１９９.６２２２.７２４９.８５５.０８９９.７８２４.００５２.７４
回收率/％１０１.１９６.８９２.９１０３.３１０３.８９６.２９０.８９９.７１０１.９９７.８９６.０１０５.４
称１.０ｇ猪样于１５.０ｍＬ离心管中ꎬ加２ｇ无水
硫酸钠ꎬ混匀ꎮ加入４.０ｍＬ酸化乙腈ꎬ２０００ｒ/ｍｉｎ离心１ｍｉｎꎬ超声８ｍｉｎꎬ２５００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ得上清液置２５ｍＬ分液漏斗中ꎮ残渣部分再加入４０ｍＬ的酸化乙腈ꎬ用以上处理方法在进行处理１~２次ꎬ把上清液放于２５ｍＬ分液漏斗中ꎬ再加进６.０ｍＬ的正己烷ꎬ充分摇匀２ｍｉｎ后ꎬ静置一段时４０℃旋蒸至近干ꎬ用氮吹仪吹干ꎮ用流动相溶解瓶１３０００ｒ/ｍｉｎ离心８ｍｉｎꎬ吸取底层的清液ꎬ经过超滤后ꎬ于４℃下存放ꎬ备检ꎮ１.２.７ 样品的添加回收试验和优质肉品进行检测ꎮ
间ꎮ取静置后的基层清液置于５０ｍＬ圆底烧瓶中ꎬ中的残渣ꎬ定容至１０ｍＬꎬ加入１ｍＬ正己烷ꎬ
(１)空白样检测ꎬ从丹尼斯超市购买伊利纯牛奶(２)添加回收试验:在空白牛奶样和猪肉样品中
进行一系列混合标准品溶液浓度的添加回收试验ꎮ添加浓度为５.０ꎬ１０.０ꎬ２５.０ꎬ５００μｇ/ｍＬꎬ共四个浓度进行检测ꎬ计算添加回收率ꎮ
结果显示:这种牛奶提取方法的麻保沙星回收率在９２.９％~１０３.３％之间ꎻ环丙沙星的回收率在９０.８％~１０３.８％之间ꎻ恩诺沙星的回收率在９６.０％~１０５.４％之间ꎮ表明这个试验确立这种牛奶提取方法可靠性良好ꎬ可以用于牛奶中这三种物质的提取检测ꎮ
２ 结果分析
２.１ 奶样回收率的测定结果
对牛奶空白样检测ꎬ结果没有出现明显色谱峰ꎮ
２.２ 肉样回收率的测定结果
对肉品的空白样检测ꎬ检测结果图谱中没有出
４６
２０１９年第１１期总第４６３期
ＭＥＡＴＩＮＤＵＳＴＲＹ
肉品安全与检测
现明显色谱峰ꎮ肉品中添加混和标准品的溶液检测结果如图３、图４ꎬ回收率测定结果表２ꎮ
品３种氟喹诺酮类药物残留的方法ꎬ对实验结果进行整理综合ꎬ得出结论ꎮ
星吸收波长在２７８~１８０ｎｍꎬ环丙沙星吸收峰在２７８ｎｍ左右ꎮ综合考虑ꎬ选择高效液相检测中麻保沙星吸收波长为２９９ｎｍꎻ设置环丙沙星和恩诺沙星的吸收波长均为２７８ｎｍꎮ
０５％三乙胺溶液ꎬＢ液为乙睛ꎬ进行梯度洗脱ꎬ初始比例Ａ∶Ｂ＝９∶１(ｖ/ｖ)ꎬ在１８ｍｉｎ内流动相Ｂ液由速为０.８ｍＬ/ｍｉｎ进行测定ꎬ可得到最佳色谱分离图ꎮ１０％上升到３３％ꎮ柱温为３０℃ꎬ进样量为２０μＬꎬ流
(２)确定相流动为Ａ液为０.０５ｍｏＬ/Ｌ磷酸(１)麻保沙星吸收波长在２９８~２９９ｎｍꎬ恩诺沙
图３ ２５.０μｇ/ｍＬ肉样检测结果
图４ ５.０μｇ/ｍＬ肉样检测结果表２ 肉品中三种目标物的添加回收结果
添加
目标物添加
色谱峰
回收体积/ｍＬ０.８０.８０.９１.００.８０.８０.９１.００.８０.８０.９１.０
回收浓度/ｕｇｍＬ－１
４.９６１０.２１２４.４７５０.０９４.８０８.２０２１.７１４８.００４.６１１０.２３２５.４０５１.９１
回收率/％９９.３１０２.１９７.８１００.１９６.０８２.０８６.８９６.０９２.２１０２.３１０１.６１０３.８
Ｙ＝１７８.１３Ｘ－５２６.４７ꎬ其相关系数为０.９９７０ꎮ环丙沙星线性回归方程为Ｙ＝１７７.２１Ｘ－５５４.１１ꎬ相关系数为０.９９７９ꎮ恩诺沙星线性回归方程为Ｙ＝２０２６６Ｘ－５６４.１１ꎬ相关系数为０.９９８ꎮ表明这三种目标物的标准曲线的线性拟合效果良好ꎮ这三种物质的检测限均为０.５μｇ/ｍＬꎮ
同添加浓度的回收率均在９７.８％~１０５.４％之间ꎬ肉品的添加回收率均在８２.０％~１０５.６％之间ꎮ这表明试验建立的这种牛奶提取方法和肉品提取方法的可靠性良好ꎬ可以用于牛奶和肉品中这三种物质的提取检测ꎮ
参考文献
１ ＨｅｒｎａｎｄｅｚＭꎬＡｇｕｉｌａｒＣꎬＢｏｒｒｕｌｌＦ.Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｉｐｒｏ￣
ｆｌｏｘａｃｉｎꎬｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎａｎｄｆｌｕｍｅｑｕｉｎｅｉｎｐｉｇｐｌａｓｍａｓａｍ￣ｐｌｅｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｉｓｏｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－ｃａｐｉｌｌａｒｙｚｏｎｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ￣７７２(１):１６３－１７２
ｒｅｓｉｓ.ＪｃｈｒｏｍａｔｏｇｒＢＡｎａｉｙｔＴｅｃｈｎｏｌＢｉｎｏｍｅｄＬｉｆｅＳｃｉꎬ２００２ꎬ
(３)建立的麻保沙星标准曲线ꎬ性回归方程为
目标物水平/ｕｇｍＬ－１积分面积
５.０
麻保沙星
１０.０２５.０５０.０５.０
环丙沙星
１０.０２５.０５０.０５.０
恩诺沙星
１０.０２５.０５０.０
５８０.９５８１７４８.６８７４３１７.５５７８３９７.０６３５０９.７２０１２６３.０６２３７２１.９２３７９５３.７９０６０４.８６７２０２８.７６０５１５７.０８２９９５６.８７３
(４)在牛奶提取方法中ꎬ三种目标物在牛奶中不
结果显示:在肉样添加回收试验中ꎬ测得麻保沙星的回收率在９７.８％~１０４.７％之间ꎻ测得环丙沙星的回收率在８２.０％~９６.０％之间ꎻ恩诺沙星的回收率在１０１.６％~１０５.６％之间ꎮ表明这个试验确定的这种方法可靠性良好ꎮ
２ 岳振峰ꎬ谢丽琪ꎬ陈小霞等.牛奶中１６种喹诺酮类药物残
留量的高效液相色谱－串联质谱法测定[Ｊ].分析测试学报ꎬ２００８ꎬ２７(３):２４０－２４３
３ 岳振峰ꎬ林秀云ꎬ唐少冰等.高效液相色谱－串联质谱法
２００７ꎬ(４):４９１－４９５
３ 结论
本文成功建立了高效液相色谱法测定动物性产
测定动物组织中的１６种喹诺酮类药物残留[Ｊ].色谱ꎬ
(收稿日期 ２０１９－０５－０５)
４７
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容