(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109498616 A(43)申请公布日 2019.03.22
(21)申请号 201811633528.7(22)申请日 2018.12.29
(71)申请人 中国医科大学附属第一医院
地址 110001 辽宁省沈阳市和平区南京北
街155号(72)发明人 曹艳丽 杨万里 暴素青 侯慧敏 (74)专利代理机构 西安铭泽知识产权代理事务
所(普通合伙) 61223
代理人 李振瑞(51)Int.Cl.
A61K 31/353(2006.01)A61P 1/16(2006.01)A61P 5/50(2006.01)
权利要求书1页 说明书12页 附图4页
(54)发明名称
EGCG在制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物中的应用(57)摘要
本发明公开了EGCG在制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物中的应用。本发明首次发现绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯能够通过调节肝脏组织中TLR4信号通路，改善胰岛素敏感性。本发明为目前改善肝脏炎症及胰岛素抵抗的治疗提供了一种全新的选择和思路，拓宽了改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物的选择领域，可预防和改善非酒精性脂肪肝和糖尿病的发生和发展。
CN 109498616 ACN 109498616 A
权 利 要 求 书
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1.EGCG在制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的EGCG在制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物中的应用，其特征在于，所述EGCG来源于绿茶。
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CN 109498616 A
说 明 书
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EGCG在制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及EGCG的一种新用途，具体公开EGCG在制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物中的应用。
背景技术
[0002]肥胖是一种慢性疾病，逐年上升的发病率已经成为世界性的健康问题。肥胖还是其它一系列疾病的重要危险因素，包括2型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等。肝脏是参与人体能量代谢过程的重要器官，是脂肪运输的枢纽。当个体处于超重或者肥胖状态时，全身脂肪代谢紊乱，过多的脂肪堆积于肝脏内形成脂肪性肝病，进而影响肝脏的多种代谢功能。非酒精性脂肪性肝脏疾病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是最常见的脂肪肝疾病，相对早期出现的是单纯良性的脂肪变性，部分患者可能会向肝纤维化、肝硬化或癌症等进一步发展，给肥胖患者带来很大的隐患。[0003]Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是一种模式识别受体，通常参与到先天免疫系统的免疫反应中，通过激活促炎性信号通路对微生物病原体起反应。TLR4信号通路的激活可以通过促炎性激酶与氧化应激的活化直接抑制胰岛素活动，间接地通过细胞因子信号级联激活和促炎性物质及胰岛素脱敏物质的释放抑制胰岛素的活动。TLR4在慢性肝脏疾病的发生及发展中也起到关键作用。Allina等学者提出在用大气颗粒物刺激Kupffer细胞上的TLR4后，增加了NAFLD的发生。在酒精性脂肪性肝病研究中，TLR4基因突变的C3H/HeJ鼠在慢性酒精刺激后没有表现出明显的肝脏损伤，TLR4还参与到许多肝脏疾病的进程中，比如原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、肝细胞癌等等。
[0004]绿茶活性成分主要是表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG，约占绿茶儿茶素的60％)，是目前已知的抗氧化作用最强的自由基清除剂之一。EGCG能否调节通过肝脏组织中TLR4信号通路，改善肝脏的胰岛素敏感性，改善肥胖、非酒精性脂肪性肝病，目前尚未见报道。
发明内容
[0005]本发明的目的是提供一种EGCG在制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物中的应用。[0006]优选地，所述EGCG来源于绿茶。[0007]优选地，所述药物可制备成药学上可接受的药物剂型，所述药物剂型为固体制剂或液体制剂。
[0008]对比现有技术，本发明的有益效果为：[0009]1、本发明为目前制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物提供了一种全新的选择和思路，拓宽了制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物的选择领域，也为该技术领域的发展作出了贡献。[0010]2、本发明首次证实绿茶中的成分EGCG能够通过调节肝脏组织中TLR4信号通路，改善胰岛素敏感性。
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说 明 书
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3、本发明提供的EGCG在制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物中的应用，能改善非
酒精性脂肪肝和胰岛素抵抗，且方法简单，安全无毒副作用。附图说明
[0012]图1为油红O染色方法观察EGCG对高脂饮食大鼠肝脏组织中脂质浸润的影响结果图，其中图1(A)表示NC组，图1(B)表示HFD组，图1(C)表示EGCG干预组；[0013]图2为EGCG对高脂饮食大鼠肝脏中甘油三酯含量的影响结果图；[0014]图3为EGCG对高脂饮食大鼠肝脏组织中TLR4、TRAF6mRNA表达的影响结果图，其中图3(A)及图3(B)分别表示EGCG对高脂饮食大鼠肝脏组织中TLR4表达及TRAF6mRNA表达的影响；
[0015]图4为EGCG对高脂饮食大鼠肝脏组织中TLR4信号通路相关因子蛋白表达水平的影响结果图，其中图4(A)、图4(B)、图4(C)、图4(D)及图4(E)分别表示TLR4、IKKβ、p-IKKβ、p-NF-κB及TNF-α表达水平；
[0016]图5为EGCG对高脂饮食大鼠肝脏组织中胰岛素信号通路相关因子蛋白表达水平的影响结果图，其中图5(A)、图5(B)、图5(C)及图5(D)分别表示IRS-1、IRS-2、PI-3K及Akt表达水平。
具体实施方式
[0017]为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。[0018]实施例
[0019]本发明提供了一种EGCG在制备改善肝脏炎症及胰岛素抵抗药物中的应用，该EGCG来源于绿茶。
[0020]需要说明的是，所述药物可制备成药学上可接受的药物剂型，药物剂型为固体制剂或液体制剂。
[0021]需要说明的是，所述EGCG可以使用绿茶直接应用，具体方法为称取绿茶2g，加入200ml沸水冲泡，每天饮用10杯。
[0022]采用高脂饮食喂养的肥胖大鼠动物模型，给予EGCG干预，探讨肝脏组织中TLR4信号通路及胰岛素信号通路的变化情况，评价EGCG在改善肝脏炎症及胰岛素抵抗中的效果。[0023]1、实验材料[0024]1.1实验动物[0025]雄性的SD大鼠，总共30只，SPF级，由中国医科大学实验动物部提供SPF级饲养条件，条件如下：室温22℃左右，相对湿度50％左右，12小时明暗交替，自由摄食饮水，笼具、垫料、饮用水等定期更换清洁，适应性喂养一周。[0026]1.2主要仪器设备
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[0028]
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[0029]
1.4实验试剂的配制
[0031]4％甲醛PBS：40％甲醛10ml，10xPBS 10ml，溶于80ml ddH2O中，常温避光保存。[0032]油红O储存液：油红O 0.5g溶于100ml异丙醇中，60℃过夜，密闭遮光瓶，室温存放。[0033]分离胶缓冲液：Tris base/HCL(PH 8.8)1.5mmol/L[0034]Tris base 18.16g溶解于80ml ddH2O中，待溶液冷却至室温，随后加入浓盐酸调节PH至8.8，加ddH2O定容至100ml后备用。[0035]浓缩胶缓冲液：Tris base/HCL(PH 6.8)0.5mmol/L[0036]Tris base 3.03g溶解于40ml ddH2O中，待溶液冷却至室温，随后加入浓盐酸调节PH至6.8，加ddH2O定容至50ml备用。[0037]电泳缓冲液(PH8.8)(1x)
[0030]
[0038]
[0039]
电转移缓冲液(现用现配)(1x)
[0040]
[0041]
洗涤缓冲液(TBST)(1x)
[0042]
[0043][0044]
加水至900ml，用HCL调整PH为7.4，再加ddH2O至1L。5％封闭缓冲液：将1g脱脂奶粉或者BSA溶于20ml洗涤缓冲液，即5％封闭缓冲液。
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说 明 书
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30％丙烯酰胺储备液：丙烯酰胺29g+N,N’-亚甲双丙烯酰胺1g+60ml ddH2O，加热
至37℃，等待固体溶解，溶解后加入ddH2O至100ml，4℃避光保存。[0046]10％SDS：SDS 10g溶于ddH2O 90ml，充分溶解后，ddH2O定溶至100ml。[0047]10％过硫酸铵：过硫酸铵20mg溶解于ddH2O 200μl中，现用现配。[0048]2动物模型建立[0049]2.1实验动物分组
[0050]30只4周龄SPF级雄性SD大鼠，适应性喂养一周后，随机分为两组：[0051]普通饮食组(normal diet group as the control，NC组，n＝10)，给予普通饲料(含脂肪10％)；
[0052]高脂饮食组(high-fat diet group，HFD组，n＝20)，给予高脂饲料(含脂肪：60％)喂养。
[0053]喂养期间大鼠摄食、摄水自由，称量大鼠体重每周进行，了解大鼠生长情况。[0054]在喂养16周时，普通饮食组和高脂饮食组大鼠体重出现差异(p＜0.05)后，将高脂饮食组随机分为两个亚组：[0055]①HFD组：高脂饮食喂养不变；②EGCG组：在高脂饮食中加入3.2gEGCG/kg。即在后续实验中，动物分组分为三组：①NC组(n＝10)，②HFD组(n＝10)，③EGCG组(n＝10)，继续喂养16周。
[0056]喂养期间每周测量三组大鼠各项代谢相关指标。[0057]3标本采集
[0058]喂养阶段结束后，进行标本采集，大鼠禁食16h，称量体重后进行麻醉，采用腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)的方法，麻醉后，留取心尖血，于4℃离心机中离心(3000转/min)，离心后保存在-80℃冰箱中备用。留取肝脏，放入液氮中速冻，保存在-80℃冰箱中以备后续使用。
[0059]4指标检测
[0060]4.1代谢相关指标[0061](1)体重：购得大鼠之日起，在每周的固定时间段，称量大鼠体重。[0062](2)空腹血胰岛素测定(fasting insulin，FINS)：在中国医科大学同位素检测实验室技术人员指导下，测定大鼠血清空腹胰岛素水平，采用的试剂盒是碘(I125)胰岛素放免试剂盒。[0063](3)空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)：采用罗氏血糖仪测鼠尾静脉血糖。[0064](4)稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistanc，HOMA-IR)：[0065]计算公式为：
[0066]HOMA-IR＝空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(mIU/L)/22.5[0067](5)游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)：取大鼠血清样本200ul，采用全自动生化分析仪酶法测定各组大鼠血清FFA水平。[0068](6)葡萄糖输注率(glucose infusion rate，GIR60-120)：大鼠于麻醉状态下进行，采用的方法是葡萄糖-高血浆胰岛素钳夹。
[0069]4.2油红-O染色方法检测大鼠肝脏组织中脂肪浸润程度
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说 明 书
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为了评估EGCG是否能够改变大鼠肝脏组织中脂肪浸润情况，采用油红-O染色方法
测定。
方法如下：冰冻切片机(Leica CM3050S)提前预冷，选取适当大小肝脏组织放在组
织托上，OCT包埋，切片(厚度10μm)，粘片，于4％甲醛PBS中固定10min，取出后干燥20min，置于60％异丙醇中2min，油红-O使用液染色10min(密封减少挥发，油红-O使用液配置方法：油红-O储存液与水比例为3：2进行使用液配置，剧烈振荡混匀，倒置10分钟后，滤纸过滤，2h内使用)，滤纸吸干染色液后，置于60％异丙醇中3min，之后放入自来水中终止分化，苏木素复染30S后，自来水返蓝，1％HCL酒精分化1S，与水中静置10min后取出干燥，干燥后，甘油明胶封片，显微镜下观察。
[0072]4.3大鼠肝脏组织中甘油三酯(TG)含量检测[0073]采用甘油三酯(TG)测定试剂盒，检测大鼠肝脏中甘油三酯含量。[0074]方法如下：[0075](1)样本处理：称量组织重量后，按重量(g)：体积(ml)＝1：9的比例，加入9倍体积的匀浆介质，在冰水浴条件下进行机械匀浆(2500转/分，10min)，取上清液待测。[0076](2)操作表见表1：[0077]表1操作表
[0078][0071]
空白孔标准孔样本孔蒸馏水(μl)2.5--2.26mmol/L校准品(μl)-2.5-样本(μl)--2.5工作液(μl)250250250[0079](3)计算公式：(蛋白含量测定方法见后面Western blot部分)[0080]酶标仪比色：
[0081]甘油三酯含量(mmol/gprot)＝(样本OD值-空白OD值)/(校准OD值-空白OD值)×校准品浓度(2.26mmol/L)÷待测样品蛋白浓度(gprot/L)[0082]4.4 Real-Time PCR检测大鼠肝脏组织中TLR4信号通路相关指标mRNA水平[0083]4.4.1提取组织RNA[0084]用TRIzol提取肝组织总RNA，方法如下：[0085](1)RNase-free 2ml匀浆管中，放入黄豆粒大小肝组织、高压处理过的钢珠、TRIzol试剂1ml，匀浆机匀浆8min(频率25次/分)；[0086](2)将匀浆液转移到RNase-free 1.5ml EP管中，冰上静置5min；[0087](3)加入200ul体积的氯仿(TRIzol的1/5)，振荡混匀，放在冰上静置5min；[0088](4)4℃离心机离心15min(转速：12000rpm)；[0089](5)离心后上清液，移到新的RNase-free 1.5ml EP管中，加入等体积异丙醇后，冰上静置15min；[0090](6)4℃离心机离心10min(转速：12000rpm)；[0091](7)去掉上清液，向沉淀中加入1ml预冷75％的乙醇溶液，洗涤沉淀；[0092](8)4℃离心机离心5min(转速：7500rpm)；
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(9)去掉上清液，干燥保留沉淀，加入一定量的(10～20μl)的DEPC水，溶解沉淀物；
[0094](10)取RNA溶液1μl，以DEPC水作为空白对照，用紫外分光光度计测定RNA浓度以及OD260/OD280比值。根据液体量及测定的浓度将每个标本的浓度调整为200ng/μl。[0095]4.4.2合成cDNA[0096](1)应用RNA反转录试剂盒，将RNA反转录为cDNA，反应体系为20μl，见表2。[0097]表2逆转录体系(20μl)
[0098]
组分用量(μl)25×dNTP Mix0.8MultiScribe Reverse Transcription1.010×RT Random Primers2.010×RT buffer2.0Nuclease-free H2O4.2总RNA(0.2μg/ul)10.0[0099](2)反应条件：[0100]25℃—10min，37℃—120min(反转录)，85℃—5min(热灭活)，4℃—∞[0101]4.4.3 Real-Time PCR[0102](1)引物设计与合成[0103]设计引物，见表3。[0104]表3引物序列
[0105]
基因名称上游引物(5’-3’)下游引物(5’-3’)TLR4CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTAGTCTCCACAGCCACCAGATTCTCTRAF6TTTGGCGTCGGAGACACTTGTCGCTTGAAGACTGGCTGGAGAPDHGCAAGTTCAACGGCACAGGCCAGTAGACTCCACGACAT[0106](2)由于样品之间不同的起始量、不同的RNA提取效率、加样误差等因素，造成RNA量出现误差，需以GAPDH为参照基因对误差进行校正。[0107](3)反应体系组成(SYBR Green法，见表4)[0108]表4 Real-Time PCR反应体系(20μl)
[0109]
组分
上游引物(10μmol/L)下游引物(10μmol/L)模版cDNA灭菌蒸馏水SYBR Select Master
[0110]反应条件(LightCycler480System)：
用量(μl)0.50.52.07.010.0
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[0111]
[0112]
PCR反应结束后所得的数据，采用LightCycler480 Software 1.5分析。
[0114]4.5 Western blot[0115]4.5.1组织蛋白提取[0116](1)1.5ml匀浆管中加入1ml蛋白裂解液(其中包括Lysis buffer 1ml，磷酸酶抑制剂5μl，蛋白酶抑制剂1μl，PMSF 5μl)，冰上保存。[0117](2)称量后的标本，钢珠放入匀浆管中，匀浆机匀浆8min，匀浆2次。[0118](3)匀浆后置于冰箱中30min后，将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在离心机中离心15min(4℃，12000转)，离心后取上清液，移至预冷的离心管中，置于-80℃冰箱中保存。[0119]4.5.2蛋白定量[0120]标准曲线制备，BSA蛋白浓度梯度，如表5。[0121]表5标准曲线制备
[0113][0122]
组分123456蒸馏水(μl)1000900850800750700BSA蛋白标准液(μl)0100150200250300蛋白终浓度0100150200250300[0123]待测样品蛋定量：[0124](1)取样品原液2μl加ddH2O 398μl，相当于原液稀释200倍。[0125](2)标准品与样品各取20μl加入96孔板(加样2次)，每孔中加入200μl Bradford试剂，充分混匀，静置10min，期间震荡2次。[0126](3)上机读数(波长595nm)，计算时取平均值。
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(4)计算浓度：将标准品OD值代入下列方程式中计算：y＝kx+b(y：OD值，x：浓度)。
[0128](5)标准曲线计算出后，根据测定出的样品的OD值，计算出所测样品的蛋白浓度。[0129]4.5.3聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[0130](1)凝胶装置准备：将两块干净的玻璃板插入固定架上，置于注胶架上固定，构成一个凝胶腔，准备灌注分离胶。[0131](2)制备分离胶，常选用10％分离胶(配置10ml)，依下表：
[0132]
(3)注入分离胶：于振荡器上混匀分离胶，沿玻璃板长的一侧将分离胶溶液加入到玻璃板夹层中，凝胶加入的高度为6cm左右时，预留出1.5cm高度，随后加入异丙醇压胶。静置40min至60min等待凝胶完全聚合。[0134](4)配置浓缩胶(pH6.8，浓度4％)，依下表
[0133]
[0135]
倒掉异丙醇，ddH2O冲洗干净，滤纸吸干水分，振荡器上混匀浓缩胶后，立即加入到夹层中分离胶上面，加到顶端后停止，立即插入梳子，不要留下气泡，如果有气泡，轻轻晃动梳子赶出气泡。凝胶聚合需要30～40min。[0137](5)加入样品：胶凝固后，将玻璃板夹到电泳架上并放入电泳槽中，电泳槽中加入的是提前放置在4℃预冷过的电泳缓冲液，确保电泳架内侧液体平面要比外侧液体平面高。取下齿梳，加入样品之前，最好用注射器将电玻璃板之间的空隙中存在的气泡排除。事先取出需要上样的蛋白样品，放置在冰上融化，混匀后低速离心机上离心。加样时采用微量加样器，于每孔加入10μl样品，还要在侧面的上样孔中加入5μl蛋白Marker。[0138](6)进行电泳：凝胶电泳实验中采用的是Bio-Rad电泳装置。正确连接电泳装置，打
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[0136]
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开电源，首先以80V电压电泳30min左右，然后调整电压至100V，溴酚蓝染料逐渐向下移动，待其接近分离胶底部时，停止电泳。[0139]4.5.4蛋白质转膜[0140](1)准备好PVDF膜，将其放入无水甲醇中活化，时间约为1min，之后放入1×转膜液中。[0141](2)准备Bio-Rad蛋白转移装置夹板，取出玻璃板以及凝胶，按照蛋白Marker分子量提示切下目的条带，胶的尺寸要略小于PVDF膜，将凝胶放入转膜缓冲液中。[0142](3)将滤纸，海绵提前用转膜液浸润，按照海绵→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→海绵的顺序排列，放置在转移装置上，保证转移装置上红色与红色相对，黑色与黑色相对。[0143](4)依据根据目的蛋白不同的分子量，在50V～70V条件下，转膜1～3个小时，期间注意在转移槽内加入冰袋降温，还要将转移槽外置在碎冰中。[0144]4.5.5封闭及抗体孵育[0145](1)封闭：转膜完成后，取下PVDF膜，放入封闭液中，室温封闭2小时。[0146](2)用TBST(含0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min。[0147](3)封闭过的PVDF膜加入一抗2ml，4℃摇床，过夜封闭。(孵育比例IRS-1 1：1000；IRS-2 1：1000；PI-3K 1：1000；AKT 1：10000；TLR4 1：500；IKKβ1：1000；p-IKKβ1：1000；p-NF-κB 1：1000；TNF-α1：200；β-actin 1：2000)。[0148](4)用TBST(含0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min。[0149](5)加入HRP标记的二抗(稀释度1：1000～3000)，于室温条件下，孵育2h。[0150](6)取出PVDF膜，用TBST(含0.05％Tween-20)洗膜3次，每次10min。[0151]4.5.6显影及灰度分析[0152](1)放置PVDF膜于ECL化学发光仪中，正面朝上，按照1：1的比例配置化学发光显影液，应用成像系统拍照保存图像。[0153](2)保存图片，并用Image J软件分析，样本中目的蛋白的含量，以目的蛋白灰度值/β-actin条带灰度值反映。[0154]5统计学分析
[0155]
采用SPSS 19.0统计学软件处理分析数据，采用的是均数±标准差形式表
示数据。均数之间的比较采用的是独立样本t检验和One-ways ANOVA分析LSD法。以p<0.05
表示差异具有统计学意义。[0156]6结果
[0157]6.1大鼠一般代谢指标[0158]如表6所示。
[0159]表6大鼠一般代谢指标
[0160]
参数
体重(1)(g)体重(2)(g)
游离脂肪酸(mmol/L)空腹胰岛素(mmol/L)NC组
487±8(n＝10)578±6(n＝10)0.37±0.1114.6±0.7
12
HFD组
520±9*(n＝20)634±23*(n＝10)0.81±0.15*31.7±3.6*EGCG组-588±16(n＝10)0.38±0.12#13.8±2.1#
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说 明 书
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空腹血糖(mmol/L)5.26±0.225.33±0.675.44±0.30[0161]注：体重(1)EGCG干预前的大鼠体重，体重(2)：EGCG干预后的体重；*p<0.05，HFD组
#
与NC组之间比较；p<0.05，EGCG组与HFD组之间比较。[0162]结果显示，高脂喂养32周，HFD组大鼠体重、游离脂肪酸、空腹胰岛素较NC组均明显升高(p<0.01)，EGCG干预16周后，FFA、FINS较HFD组均明显下降(p<0.01)；EGCG组大鼠体重较HFD组有下降趋势，但没有统计学差异(p<0.05)；三组大鼠得到空腹血糖水平比较后无统计学差异(p>0.05)。
[0163]6.2EGCG对高脂饮食大鼠胰岛素抵抗情况的影响
[0164]GIR60-120表示的是正常葡萄糖-高血浆胰岛素钳夹实验中，60-120分钟的平均葡萄糖输注率，用以评价胰岛素敏感性，结果见表7。[0165]表7 EGCG干预后大鼠胰岛素抵抗评价指标结果
[0166]
指标NC组HFD组EGCG组GIR(mg/kg/min)4.55±0.812.15±0.2*4.36±1.03#HOMA-IR(n＝10)3.40±0.157.59±0.9*3.36±0.31#
#[0167]注：*p<0.05，HFD组与NC组之间比较；p<0.05，EGCG组与HFD组之间比较。
[0168]结果显示，HFD组GIR60-120与NC组相比明显下降(p<0.05)，EGCG组GIR60-120与HFD组相比明显升高(p<0.05)。
[0169]HOMA－IR通过FBG和FINS计算得出，HFD组HOMA－IR与NC组相比明显升高(p<0.05)，EGCG组HOMA－IR较HFD组明显下降(p<0.05)，而NC组与EGCG组之间相比差异无统计学意义(p>0.05)。上述结果表明，EGCG干预可以改善高脂饮食大鼠胰岛素敏感性。[0170]6.3 EGCG对高脂饮食大鼠肝脏组织中脂肪浸润情况的影响[0171]如图1所示，油红-O的染色结果大致反映出高脂饮食大鼠肝脏中脂肪浸润情况，其中蓝色的是细胞核，脂类物质可被油红-O染成红色。肉眼观察到，与NC组(图A)相比，HFD(图B)组脂质红染更显著，EGCG干预后(图C)，脂质浸润较HFD组改善。[0172]6.4 EGCG对高脂饮食大鼠肝脏中甘油三酯(TG)含量的影响[0173]为进一步定量肝脏脂质浸润情况，测定肝脏中甘油三酯(TG)含量，结果如图2所示，其中*表示HFD组与NC组相比较p<0.05，#表示EGCG组与HFD组相比较p<0.05。HFD组TG含量高于NC组(p<0.05)，EGCG组TG含量低于HFD组(p<0.05)，EGCG组与NC组之间差异没有统计学意义。结果表明，EGCG干预后能够减轻大鼠肝脏中TG含量。[0174]6.5 EGCG对高脂饮食大鼠肝脏组织中TLR4信号通路相关因子表达的影响[0175]6.5.1 TLR4信号通路相关因子mRNA水平[0176]EGCG干预16周后，测定肝脏组织中TLR4信号通路炎症相关因子mRNA水平，结果如图3所示，其中*表示HFD组与NC组相比较p<0.05，#表示EGCG组与HFD组相比较p<0.05。结果显示，HFD组中TLR4mRNA较NC组表达含量上升，EGCG组TLR4 mRNA较HFD组表达量下降，差异具有统计学意义(p<0.05，图3-A)；HFD组中TNF受体相关因子6(TRAF-6)mRNA较NC组表达含量上升，EGCG组TNF受体相关因子6(TRAF-6)mRNA较HFD组表达量下降，差异具有统计学意义(p<0.05，图3-B)。[0177]6.5.2 TLR4信号通路相关因子蛋白水平
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提取肝脏组织中总蛋白，采取Western blot方法检测TLR4、IKKβ、p-IKKβ、p-NF-κ
B、TNF-α等的蛋白水平，采用Image J软件分析，结果如图4所示，其中*表示HFD组与NC组相比较p<0.05，#表示EGCG组与HFD组相比较p<0.05。[0179]图4结果显示，HFD组TLR4、IKKβ、p-IKKβ、p-NF-κB及TNF-α蛋白表达水平较NC组升高，差异具有统计学意义(p<0.05)；EGCG组TLR4、IKKβ、p-IKKβ、p-NF-κB及TNF-α蛋白表达水平较HFD组下降，差异具有统计学意义(p<0.05)；NC组TLR4、IKKβ、p-IKKβ、p-NF-κB及TNF-α与EGCG组之间比较差异无统计学意义(p>0.05)。[0180]6.6 EGCG对高脂饮食大鼠肝脏组织中胰岛素信号通路相关因子蛋白表达水平的影响
[0181]提取肝脏组织中总蛋白，采取Western blot方法检测IRS-1、IRS-2、PI-3K、Akt等的蛋白表达水平，采用Image J软件分析，结果如图5所示，其中*表示HFD组与NC组相比较p<0.05，#表示EGCG组与HFD组相比较p<0.05。[0182]图5结果显示，HFD组IRS-1、PI-3K、Akt蛋白表达水平较NC组下降，差异具有统计学意义(p<0.05)，IRS-2蛋白表达水平较NC组有所下降，但是差异没有统计学意义(p>0.05)；EGCG组IRS-1、IRS-2、PI-3K、Akt蛋白表达水平较HFD组升高，差异具有统计学意义(p<0.05)；NC组IRS-1、IRS-2、PI-3K、Akt与EGCG组之间比较，差异不具有统计学意义(p>0.05)。[0183]综上所述，EGCG可改善高脂饮食喂养大鼠肝脏组织中脂质浸润，改善肝脏组织中TLR4炎症信号通路及胰岛素信号通路的关键分子表达，对肥胖、非酒精性脂肪性肝病具有改善作用。
[0184]显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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