微生物大小与数量的测定实验报告

微⽣物⼤⼩与数量的测定实验报告

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⼭东⼤学实验报告2017年11⽉27⽇ _________________________________________________________________

科⽬：微⽣物学实验题⽬：微⽣物⼤⼩与数量的测定姓名：丁志康⼀、⽬的要求

1.学习并掌握⽤测微尺测定微⽣物⼤⼩的⽅法。2.增强微⽣物细胞⼤⼩的感性认识。3. 明确⾎细胞计数板计数的原理。

4. 掌握使⽤⾎细胞计数板进⾏微⽣物计数的⽅法。⼆、基本原理⼀）微⽣物⼤⼩的测定

1.微⽣物细胞的⼤⼩是微⽣物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之⼀。微⽣

物⼤⼩的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量⼯具——测微尺，包括⽬镜测微尺和镜台测微尺。2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻⽚，⼀般是将1mm等分为100格

每格长（即10µm）。镜台测微尺并不直接⽤来测量细胞的⼤⼩，⽽是⽤于矫正⽬镜测微尺每格的相对长度。3.⽬镜测微尺是⼀块可放⼊接⽬镜内的圆形⼩玻⽚，其中央有精确的等分刻度，

有等分为50⼩格和100⼩格两种。测量时，需将其放在接⽬镜中的隔板上，⽤以测量经显微镜放⼤后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的⽬镜和物镜组合放⼤倍数不同，⽬镜测微尺每⼩格所代表的实际长度也不⼀样。因此，⽤⽬镜测微尺测量微⽣物⼤⼩时，必须先⽤镜台测微尺进⾏校正，以求出该显微镜在⼀定⼤放⼤倍数的⽬镜和物镜下，⽬镜测微尺每⼩格所代表的相对长度。然后根据微⽣物细胞相当于⽬镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际⼤⼩。4.球菌⽤直径来表⽰其⼤⼩；杆菌则⽤宽和长的范围来表⽰。如⾦黄⾊葡萄球菌直径约为µm，枯草芽孢杆菌⼤⼩为~×2~3µm。⼆）微⽣物数量的测定

1.微⽣物数量的测定有多种⽅法，本次试验中使⽤显微镜直接计数法。显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于⼀种特别的具有确定⾯积和容积的载玻⽚上(⼜称计菌器)，于显微镜下直接计数的⼀种简便、快速、直观的⽅法。⽬前国内外常⽤的计菌器有：⾎细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及

Hawksley计菌器等，它们都可⽤于酵母、细菌、霉菌孢⼦等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻⽚后，总容积为，⽽且盖玻⽚和载波⽚之间的距离只有，因此可⽤油浸物镜对细菌等较⼩的细胞进⾏观察和计数。

（除了⽤这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂⽚⾯积与视野⾯积之⽐的估算法，此法⼀般⽤于⽜乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。⽬前已有⼀些⽅法可以克服这⼀缺点，如结合活菌染⾊微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等⽅法来达到只计数活菌体的⽬的。本实验以⾎球计数板为例进⾏显微镜直接计数。

2.⽤⾎细胞计数板在显微镜下直接计数是⼀种常⽤的微⽣物计数⽅法。该计数板

是⼀块特制的载玻⽚，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台⼜被⼀短横槽隔成两半，每⼀边的平台上

3.各列有⼀个⽅格⽹，每个⽅格⽹共分为九个⼤⽅格，中间的⼤⽅格即为计数

室。计数室的刻度⼀般有两种规格，⼀种是⼀个⼤⽅格分成25个中⽅格，⽽每个中⽅格⼜分成16个⼩⽅格；另⼀种是⼀个⼤⽅格分成16个中⽅格，⽽每个中⽅格⼜分成25个⼩⽅格，但⽆论是哪⼀种规格的计数板，每⼀个⼤⽅格中的⼩⽅格都是400个。每⼀个⼤⽅格边长为lmm，则每⼀个⼤⽅格的⾯积为

lmm2，盖上盖玻⽚后，盖玻⽚与载玻⽚之间的⾼度为，所以计数室的容积为(万分之⼀毫升)。（本次试验所⽤⾎球计数板为25个中⽅格）

4.计数时，通常数随机五个不相邻中⽅格的总菌数，然后求得每个中⽅格的平均值，再乘上25，就得出⼀个⼤⽅格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。5.设五个中⽅格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，所以对于25个中⽅格的计数板，1mL菌液中的总菌数n=A/5×25×10^4×B=50000A·B（个）。⾎球计数板三、器材

1.菌种：⼤肠杆菌7d鞋⾯培养物，酿酒酵母24h液体合成培养基培养物。2.仪器或其他⽤具：⽬镜测微尺，镜台测微尺，载玻⽚，盖玻⽚，显微镜，移液枪，⾎球计数板等。四、操作步骤⼀）微⽣物⼤⼩的测定1.装⽬镜测微尺

取出右⽬镜，把⽬镜上的透镜⽚旋下，将⽬镜测微尺刻度朝下放在⽬镜镜筒内的隔板上，然后旋上⽬镜透镜，再将⽬镜插⼊镜筒内。

2.校正⽬镜测微尺

（1）放镜台测微尺将镜台测微尺刻度⾯朝上放在显微镜载物台上。

（2）校正先⽤低倍镜观察，将镜⾯测微尺有刻度的部分移⾄视野中央，调节焦距，当清晰的看到镜台测微尺的刻度后，转动⽬镜使⽬镜测微尺的刻度与镜

台测微尺的刻度平⾏。利⽤移动器移动镜台测微尺，使两尺在某⼀区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台微尺和⽬镜微尺所占的格数。

（3）计算由于已知镜台测微尺每格长10µm，根据下列公式即可分别计算处在不同放⼤倍数下，⽬镜测微尺每格所代表的长度。

⽬镜测微尺每格长度（µm）=

⽤上述⽅法分别对低倍镜、⾼背景和油镜进⾏校正，分别测出在低倍镜、⾼倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数，并⽤上述公式计算出不同倍镜下⽬镜测微尺每格所代表的长度。

（观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台微尺的刻度；换⾼倍镜和油镜校正时，务必⼗分细⼼，防⽌接物镜压坏镜台微尺和损坏镜头。）3.菌体⼤⼩的测定

⽬镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上细菌染⾊制⽚。先⽤低倍镜和⾼倍

镜找到菌体后，换油镜测定⼤肠杆菌的宽度和长度。测定时，通过转动⽬镜微尺和移动载玻⽚，测出⼤肠杆菌宽和长所占⽬镜测微尺的格数。最后将所测得的格数乘以⽬镜测微尺（⽤油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际⼤⼩。测定酵母菌时，先将酵母菌培养物制成⽔浸⽚，然后⽤⾼倍镜测出宽和长各占⽬镜微尺的格数，最后，将测得的格数乘上⽬镜微尺（⽤⾼倍镜

时）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际⼤⼩。通常测定对数⽣长期菌体来代表该菌的⼤⼩；可选择有代表性的3~5个细胞进⾏测定；细菌的⼤⼩需⽤油镜测定，以减少误差。4.测定完毕

取出⽬镜测微尺后将接⽬镜放回镜筒，再将⽬镜测微尺和镜台测微尺分别⽤擦镜纸擦拭⼲净，放回盒内保存。⼆）微⽣物数量的测定1. 菌悬液制备

以⽆菌⽣理盐⽔将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进⾏镜检。若有污物，则需清洗，吹⼲后才能进⾏计数。3．加样品

将清洁⼲燥的⾎细胞计数板盖上盖玻⽚，再⽤换上新枪头的移液枪移取少量摇匀的酿酒酵母菌悬液，之后由盖玻⽚边缘缓缓注⼊⼀⼩滴，让菌液沿缝隙靠⽑细渗透作⽤⾃动进⼊计数室，⼀般计数室均能充满菌液。（取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有⽓泡产⽣。）4．显微镜计数

加样后静⽌5min，然后将⾎细胞计数板置于显微镜载物台上，先⽤低倍镜找到计数室所在位置，然后换成⾼倍镜进⾏计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于⽤反光

镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向⼀边，否则视野中不易看清楚计数室⽅格线，或只见竖线或只见横线。5．清洗⾎细胞计数板

使⽤完毕后，将⾎细胞计数板在⽔龙头⽤⽔冲洗⼲净，切勿⽤硬物洗刷，洗完后⾃⾏晾⼲或⽤吹风机吹⼲。之后镜检，观察每⼩格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不⼲净，则必须重复洗涤⾄⼲净为⽌。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。⼀般样品稀释度要求细菌每⼩格内约有5～10个菌体为宜，酵母菌每⼩格内约有2～6个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个⾓和中央的⼀个中格)中的菌体进⾏计数。位于格线上的菌体⼀般只数上⽅和右边线上的。如遇酵母出芽，可按照各⼈习惯记或者不记芽体，但要在结果中注明芽体数⽬是否算⼊。五、实验结果

六、思考题

(1)为什么更换不同放⼤倍数的⽬镜或物镜时，必须⽤镜台微尺重新对⽬镜测微尺进⾏校正

答：因为⽬镜测微尺每⼀组的长度都是对应⼀个特定的放⼤倍数，在更换不同放⼤倍数的⽬镜或物镜之后，整个显微镜所观测到物体的整体放⼤倍数发⽣了改变，那么原来的⽬镜测微尺的标度就不再适⽤了，需要进⾏重新标定。

(2)在不改变⽬镜和物镜测微尺，⽽改⽤不同放⼤倍数的物镜来测定同⼀株细菌的⼤⼩时，其测定结果是否相同为什么答：基本相同。因为细菌的⼤⼩是由其本⾝确定的，若使⽤不同的放⼤倍数测定同⼀株细菌，只要⽬镜测微尺的标定长度是正确的，那么所测得的结果就是⼤体相同的，不过因为不同放⼤倍数下读数的精确度不同以及读数时本⾝所存在的误差，可能会导致两次不同放⼤倍数下的测量结果和精确度有⼀定的差别。

(3)根据你的体会，说明⽤⾎细胞计数板计数的误差主要来⾃哪些⽅⾯应如何尽量减少误差、⼒求准确

误差来源：①刻度不清晰导致读数不准；②浓度安排不合理导致过浓菌体有重叠或者过稀数据不准确；③菌液中混有杂质或⽓泡导致视野受阻；④视野中菌体分布不均匀，读数差别⼤，不准确等等。

解决⽅案：①使⽤之前⽤⽔洗净并镜检确定没有污物；②滴加菌液时从盖玻⽚边缘滴加让其缓缓渗⼊；③滴加完菌液之后将⾎球计数板静置5min使菌体沉淀；④清理⾎球计数板时不可使⽤⽑刷或者吸⽔纸，⽤冲洗后⾃然晾⼲；⑤读数时若发现菌体密度过稀或过浓应及时调整稀释倍数重新测量，以菌体数每⼩⽅格2-6个为宜（针对酵母菌来说）。(4)某单位要求知道⼀种⼲酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可⾏的检测⽅法。

⽅案⼀：取适量酵母粉加⼊清⽔制成悬液，活化12h,加⼊美蓝染⾊10分钟，之后取少量菌液⽤⾎球计数板计数，分别记下总菌数以及活菌数（菌体呈⽆⾊），从⽽求得活菌成活率。

⽅案⼆：同样取适量酵母粉制成悬液，先是⽤光电⽐浊法测得菌液中总菌数，之后阶梯稀释成不同浓度的菌液，分别涂布在麦芽琼脂平⽫上，28℃培养3天，根据出现的菌落数和对应菌液的稀释倍数算出活菌数，两组数据结合求得该酵母粉中的活菌存活率。